限制性内切酶和核酸外切酶ⅲ的无标记荧光检测dna甲基化和甲基转移酶活性的检测方法
【专利摘要】本发明公开一种基于限制性内切酶HpaⅡ和核酸外切酶Ⅲ的DNA甲基化及甲基化转移酶活性的检测方法。制备了无标记的DNA探针，该探针序列包含了限制性内切酶的切割位点和甲基化的CpG位点,通过该无标记的DNA探针与目标DNA杂交，用甲基化转移酶进行甲基化处理，再用限制性内切酶HpaⅡ的特异性切割以及作用于双链DNA的3'→5'外切酶活性的核酸外切酶Ⅲ作用，然后利用荧光信号分子噻唑橙对单双链DNA不同信号实现检测甲基化及甲基转移酶活性的目的。本发明无需制备复杂材料和标记DNA探针，可避免材料制备及标记DNA探针而导致检测成本高、操作烦琐，重现性差的缺陷。本发明具有成本低、快速、简便、灵敏度高的优点。
【专利说明】限制性内切酶和核酸外切酶III的无标记荧光检测DNA甲基化和甲基转移酶活性的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物检测领域，具体涉及限制性内切酶和核酸外切酶III的无标记荧光检测DNA甲基化和甲基转移酶活性的检测方法，本发明属于一种识别特殊甲基化位点和定量分析DNA甲基转移酶活性的生物传感技术，具体是指DNA甲基化后，被甲基化敏感的限制性内切酶识别并切割特定的序列后，核酸外切酶III消化DNA，观测荧光信号分子噻唑橙信号的改变。
【背景技术】
[0002]DNA甲基化是一种重要的修饰途径，在甲基转移酶的催化下，DNA的CG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基，形成5-甲基胞嘧啶，这常见于基因的5’-CG-3’序列(被称为CpG岛)。大量研究表明，DNA甲基化涉及到调控许多细胞过程，比如胚胎发育、转录、染色质结构、X染色体失活、基因组印迹和染色体的稳定性。
[0003]在高等真核生物的正常细胞中，一般情况下CpG岛是未甲基化，但是，异常甲基化会抑制遗传信息的表达，会导致人类各种疾病比如癌症。因此，DNA甲基化可以作为疾病的一种潜在生物标志。然而，要了解DNA甲基化CpG机制，我们需要一个可以识别甲基化的DNA特定序列的系统，继而可以应用于疾病早期诊断和确定肿瘤的类型。然后，新的药物可以被研发并用于治疗与甲基化相关的疾病。
[0004]传统的测序技术不能用于特殊位点的甲基化检测，因为甲基胞嘧啶和胞嘧啶仍能遵守沃森-克里克碱基对行为。目前，甲基化检测方法主要基于区别DNA上甲基胞嘧啶和胞嘧啶。例如,重亚硫酸盐处理方法、甲基化抗体识别方法和对甲基化敏感的限制性内切酶方法。基于重亚硫酸盐处理的方法中，亚硫酸氢盐能使DNA上的胞嘧啶脱氨转变成尿嘧啶，而5’甲基胞嘧唳没有变化,在通过PCR (polymerase chain reaction)扩增出所需片段后进行直接检测。利用甲基化抗体的方法来检测甲基化，甲基化抗体贵，成本高。在甲基化敏感限制性内切酶的方法中，该酶特异性识别甲基化的位置和选择性切断特定的DNA序列。如果在特定序列上的胞嘧啶被甲基化以后，那这段特定的序列就不会被限制性内切酶识别并切断。它提供了一个经济的方法来识别DNA甲基化的特定位点和确定其甲基化程度。但是，这些方法中都没有提出同时确认甲基化特定位点和检测甲基转移酶活性。因为甲基转移酶在细胞分化和发育、基因的抑制、肿瘤和基因疾病中发挥了关键作用，所以甲基转移酶的活性评价在药物发现和临床诊断的领域是很重要的。因此，发展一种快速、简单、高效、选择性高来检测DNA甲基化和甲基转移酶活性的方法是迫切需要的。
【发明内容】
[0005]发明目的:针对现有技术的问题，本发明中针对基因中CpG位点进行分析的DNA甲基化检测和测定甲基转移酶活性方法，它具有快速、简便、无标记、经济、准确地确定DNA甲基化位点和检测甲基转移酶活性。[0006]技术方案:为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于限制性内切酶和核酸外切酶III无标记荧光检测DNA甲基化和甲基转移酶活性的检测方法，包括以下步骤:
[0007](I)无标记的探针DNA和目标DNA的选取:所述无标记的探针DNA和目标DNA部分互补，并且都包含一段能被限制性内切酶识别并切割的5’-CCGG-3’特定序列，并且3’尾部分别都多出6个碱基序列；其中，目标DNA是抑癌基因p53中的一段DNA序列；
[0008](2)无标记的探针DNA与目标DNA的杂交；
[0009](3)甲基化转移酶对双链DNA上CpG位点进行甲基化；
[0010](4)对甲基化敏感的限制性内切酶(Hpa II )和核酸外切酶III (Exo III)同时作用DNA ；
[0011](5)加入突光信号分子；
[0012](6)利用荧光分光度计对产物溶液进行检测。
[0013]其中，上述荧光信号分子为噻唑橙。其中，上述噻唑橙在缓冲液中的终浓度为
0.7~3.0 μ M。噻唑橙染料与双链DNA结合时表现出荧光增强的特性。噻唑橙染料的水溶液几乎没有荧光，与单链DNA结合时会稍有荧光增强，当与双链DNA结合时，荧光有明显地增强。有报道表明:这是由于染料通过正负电荷静电吸引力与核酸结合时，喹啉环嵌入双链DNA分子的小沟中，染料分子由于受到空间位阻影响，其结构更趋于平面性，因而有荧光明显增强的现象图2。
[0014]其中，上述检测方法的具体步骤如下:取无标记的探针DNA和目标DNA以及缓冲溶液于离心管中杂交，然后加入甲基转移酶使其CpG位点上的胞嘧啶甲基化，37°C反应I小时后，加入限制性内切酶(Hpa II )和核酸外切酶III (ExoIII)，37°C反应2.5小时，最后加入噻唑橙，室温条件反应I小时后，对其溶液进行荧光检测。
[0015]其中，上述无标记的探针DNA和目标DNA浓度在缓冲液中的终浓度分别为10~ΙΟΟηΜ。
[0016]其中，上述缓冲溶液为含有NaCl、MgCl2, BSA和DTT的pH7~8的10~80mM的Tris-HCl，所述NaCl初始浓度为100~500mM，MgCl2初始浓度为2~10mM，BSA初始浓度为0.05~5mg/mL，DTT初始浓度为0.05~10mM。
[0017]其中，上述甲基转移酶在缓冲液中的终浓度为I~16U/mL。
[0018]其中，上述限制性内切酶Hpa II在缓冲液中的终浓度为O~60U/mL。
[0019]其中，上述核酸外切酶III在缓冲液中的终浓度为O~200U/mL。
[0020]核酸外切酶III具有作用于双链DNA的3’ 一5’外切酶活性。该酶对双链结构具有高度特异性，能降解平滑末端、3’凹陷末端及有切口的DNA，但是不能降解3’突出末端。所以本方法利用核酸外切酶III的这一特性，从3’凹陷末端降解，得到单链DNA和5’ -P单核苷酸。
[0021] 上述包含限制性内切酶切割位点的无标记的探针DNA与目标DNA杂交形成双螺旋结构的DNA链，在特定位点没有被甲基化的情况下，限制性内切酶会识别特定序列(5’-CCGG-3’)并切割，继而核酸外切酶III会识别3’凹端并消化DNA，加入噻唑橙染料分子后，荧光的强度弱。如果，CpG位点上的胞嘧啶在甲基转移酶的作用下对其特定位点进行甲基化，对甲基化敏感的限制性内切酶就不会识别并切割特定的序列，继而核酸外切酶III也不会降解DNA。在加入噻唑橙染料分子后，荧光的强度强；此法通过噻唑橙染料分子的荧光强度改变实现甲基化和甲基转移酶的检测。
[0022]有益效果:本发明相对于现有技术，具有以下优点:
[0023](I)本发明无需标记，可避免现有技术中对甲基化与未甲基化DNA进行标记而导致检测成本高、准确性差的缺点。
[0024](2)利用限制性内切酶来识别特殊位点并切割来确认特殊位点的甲基化，提高其特异性。
[0025](3)核酸外切酶III消化限制性内切酶切割下来的片段DNA，提高其灵敏度。
[0026](4)本发明既可以用来检测特殊位点的甲基化又可以定量检测甲基转移酶的活性。
【专利附图】
【附图说明】
[0027]图1基于限制性内切酶和核酸外切酶无标记荧光检测甲基化和甲基转移酶活性的流程图；
[0028]图2显示了噻唑橙(TO)的荧光性质图；噻唑橙在溶液中的荧光强度；b:噻唑橙在单链溶液中的荧光强度；c:噻唑橙在双链溶液中的荧光强度；从图中可以看出，TO在不同的体系中，荧光强度会发生很大的变化； [0029]图3显示了甲基化检测实验验证图；a:噻唑橙在单链探针DNA溶液中的荧光强度；b:噻唑橙在探针DNA与目标DNA杂交后溶液中的荧光强度；c:杂交DNA(未甲基化)溶液中加入限制性内切酶和核酸外切酶III后，加入噻唑橙后，得到荧光图；d:使杂交DNA在甲基转移酶作用下甲基化，加入限制性内切酶和核酸外切酶III，再加入噻唑橙，得到荧光图；
[0030]图4显示了检测甲基转移酶活性的荧光变化图；A:在不同量的甲基转移酶作用下，得到的荧光图(甲基转移酶的浓度:(a) 1、(b)2、(c)3、(d)4、(e)5、(f)6、(g)8、(h)9、
(i)10、(j)12、(k) 16U/mL) ;B:荧光强度与甲基转移酶浓度的标准曲线；插图:荧光强度与甲基转移酶之间的线性关系；从图中可以看出甲基转移酶M.SssI在lU/mL到10U/mL呈良好的线性关系。
【具体实施方式】
[0031]下面结合附图对本发明作更进一步的说明。
[0032]本实验中用到的试剂和仪器:
[0033]限制性内切酶(Hpa II )，核酸外切酶III (Exo III)，甲基转移酶(M.SssI)，S-腺甲硫氨酸(SAM)，噻唑橙(TO)，牛血清蛋白(BSA)，二硫苏糖醇(DTT)，荧光分光光度计
[0034]合成的寡核苷酸探针DNA和目标DNA:
[0035]探针DNA: 5，-TCCTGGGAGAGACCGGCGCACAGAGGTTATTA-3，
[0036]目标 DNA: 5，-CCTCTGTGCGCCGGTCTCTCCCAGGACAGGCA-3 ’
[0037]加下划线的序列是限制性内切酶特定识别并切割的序列，标注斜体的序列是杂交后探针DNA和目标DNA的3’尾部多出的6个碱基序列。
[0038]实施例1:
[0039]基于限制性内切酶和核酸外切酶III无标记荧光检测DNA甲基化的分析方法，检测步骤是:[0040]杂交步骤:在50mM Tris-HCl (IOOmM NaCl, 5mM MgCl2, 0.lmg/mL BSA, ImM DTTpH7.9)反应体系中，加入5 μ LlO μ M探针DNA和5 μ LlO μ M目标DNA，充分混匀后，在70°C恒温水浴锅中反应10分钟后，自然降温至室温，然后加入T0，噻唑橙在缓冲液中的终浓度为3.0 μ M，室温反应一个小时后，产物溶液去测荧光，此溶液作为控制溶液。
[0041]甲基化检测步骤:在DNA杂交溶液中加入7U甲基转移酶和50 μ M SAM充分混匀后，在37°C恒温水浴锅中反应I小时，然后加入IOU Hpa II和25U Exo III，混匀后，继续在37°C恒温水浴锅反应2.5小时后，加入T0,噻唑橙在缓冲液中的终浓度为3.0 μ M，在室温条件下反应I小时，反应结束后，将产物溶液去测荧光。与不加甲基转移酶和SAM进行比较。实验结果见图3:将甲基化的荧光数据与控制溶液比较，荧光强度几乎不变，对DNA甲基化的检效果很好。
[0042]甲基转移酶活性检测步骤:在DNA杂交溶液中加入不同量的Μ.Sssl(0、l、2、3、4、
5、6、8、9、10、12、16U/mL)和50 μ M SAM充分混匀后，在37°C恒温水浴锅中反应I小时，然后加入IOU Hpa II和25U Exo III，混匀后，继续在37°C恒温水浴锅反应2.5小时后，加入TO,噻唑橙在缓冲液中的终浓度为3.0 μ Μ，在室温条件下反应I小时，反应结束后，将产物溶液去测荧光。分析得到荧光谱图，作出甲基转移酶线性图。实验结果见图4:甲基转移酶Μ.SssI在lU/mL到10U/mL呈良好的线性关系，检测限是0.16U/mL。注:反应总体积为500 μ L。
[0043]实施例2
[0044]基于限制性内切酶和核酸外切酶III无标记荧光检测DNA甲基化的分析方法，检测步骤是:
[0045]杂交步骤:在IOmM Tris-HCl (300mM NaCl, 2mM MgCl2, 0.05mg/mL BSA, 0.05mMDTTpH7)反应体系中，加入终浓度为20nM探针DNA和20nM目标DNA，充分混匀后，在70°C恒温水浴锅中反应10分钟后，自然降温至室温，然后加入T0，噻唑橙在缓冲液中的终浓度为
0.7μΜ,室温反应一个小时后，产物溶液去测荧光，此溶液作为控制溶液。
[0046]甲基化检测步骤:在DNA杂交溶液中加入的甲基转移酶终浓度为lU/mL和50 μ MSAM充分混匀后，在37°C恒温水浴锅中反应I小时，然后加入Hpa II和Exo III，Hpa II的终浓度为60U/mL，Exo III的终浓度为200U/mL，混匀后，继续在37°C恒温水浴锅反应2.5小时后，加入T0，噻唑橙在缓冲液中的终浓度为0.7 μ M，在室温条件下反应I小时，反应结束后，将产物溶液去测荧光。与不加甲基转移酶和SAM进行比较。实验结果:将甲基化的荧光数据与控制溶液比较，荧光强度几乎不变，对DNA甲基化的检效果很好。
[0047]甲基转移酶活性检测步骤:在DNA杂交溶液中加入不同量的Μ.SssI (0,0.2,0.3、
0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9、1、1.2、1.5、1.7、2U/mL)和 50 μ M SAM 充分混匀后，在 37°C恒温水浴锅中反应I小时，然后加入Hpa II和Exo III，Hpa II的终浓度为60U/mL，Exo III的终浓度为200U/mL，混匀后，继续在37°C恒温水浴锅反应2.5小时后，加入TO,噻唑橙在缓冲液中的终浓度为0.7 μ M，在室温条件下反应I小时，反应结束后，将产物溶液去测荧光。实验结果:甲基转移酶Μ.SssI在Ο-lU/mL呈良好的线性关系，检测限是0.05U/mL。注:反应总体积为500 μ L0
[0048]实施例3
[0049]基于限制性内切酶和核酸外切酶III无标记荧光检测DNA甲基化的分析方法，检测步骤是:[0050]杂交步骤:在80mM Tris-HCl (500mM NaCl, IOmM MgCl2, 5mg/mL BSA, IOmM DTTpH7.5)反应体系中，加入终浓度为50nM探针DNA和50nM目标DNA，充分混匀后，在70°C恒温水浴锅中反应10分钟后，自然降温至室温，然后加入T0，噻唑橙在缓冲液中的终浓度为1.6 μ M，室温反应一个小时后，产物溶液去测荧光，此溶液作为控制溶液。
[0051]甲基化检测步骤:在DNA杂交溶液中加入的甲基转移酶在缓冲液中的终浓度为10U/mL和50 μ M SAM充分混匀后，在37°C恒温水浴锅中反应I小时，然后加入Hpa II和Exo III，Hpa II的终浓度为40U/mL，Exo III的终浓度为150U/mL，混匀后，继续在37°C恒温水浴锅反应2.5小时后，加入TO,噻唑橙在缓冲液中的终浓度为1.6 μ Μ，在室温条件下反应I小时，反应结束后，将产物溶液去测荧光。与不加甲基转移酶和SAM进行比较。实验结果:将甲基化的荧光数据与控制溶液比较，荧光强度几乎不变，对DNA甲基化的检效果很好。
[0052]甲基转移酶活性检测步骤:在DNA杂交溶液中加入不同量的Μ.SssI (0,0.5、1、
1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5,5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10U/mL)和 50 μ M SAM 充分混匀后，在37°C恒温水浴锅中反应I小时，然后加入Hpa II和Exo III，Hpa II的终浓度为40U/mL，Exo III的终浓度为150U/mL，混匀后，继续在37°C恒温水浴锅反应2.5小时后，加入TO,噻唑橙在缓冲液中的终浓度为1.6 μ M，在室温条件下反应I小时，反应结束后，将产物溶液去测荧光。实验结果:甲基转移酶Μ.SssI在l-6U/mL呈良好的线性关系，检测限是0.12U/mL。注:反应总体积为500 μ L0
[0053]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出:对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本 发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种基于限制性内切酶和核酸外切酶III无标记荧光检测DNA甲基化和甲基转移酶活性的检测方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)无标记的探针DNA和目标DNA的选取:所述无标记的探针DNA和目标DNA部分互补，并且都包含一段能被限制性内切酶识别并切割的5’-CCGG-3’特定序列，并且3’尾部分别都多出6个碱基序列； (2)无标记的探针DNA与目标DNA的杂交； (3)甲基化转移酶对双链DNA上CpG位点进行甲基化； (4)对甲基化敏感的限制性内切酶HpaII和核酸外切酶III Exo III同时作用DNA ； (5)加入突光信号分子； (6)利用荧光分光度计对产物溶液进行检测。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述荧光信号分子为噻唑橙。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法的具体步骤如下:取无标记的探针DNA和目标DNA以及缓冲溶液于离心管中杂交，然后加入甲基转移酶使其CpG位点上的胞嘧啶甲基化，37°C反应I小时后，加入限制性内切酶Hpa II和核酸外切酶III Exo III，37V反应2.5小时，最后加入噻唑橙，室温条件反应I小时后，对其溶液进行荧光检测。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述无标记的探针DNA和目标DNA浓度在缓冲液中的终浓度分别为10~ΙΟΟηΜ。
5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述缓冲溶液为含有NaCl、MgCl2,BSA 和 DTT 的 pH7 ~8 的 10 ~80mM 的 Tris-HCl，所述 NaCl 初始浓度为 100 ~500mM，MgCl2初始浓度为2~10mM，BSA初始浓度为为0.05~5mg/mL，DTT初始浓度为0.05~10mM。
6.根据权利要求1或3任一项所述的检测方法，其特征在于，所述甲基转移酶在缓冲液中的终浓度为I~16U/mL。
7.根据权利要求1或3任一项所述的检测方法，其特征在于，所述限制性内切酶HpaII在缓冲液中的终浓度为O~60U/mL。
8.根据权利要求1或3任一项所述的检测方法，其特征在于，所述核酸外切酶III在缓冲液中的终浓度为O~200U/mL。
9.根据权利要求1或3任一项所述的检测方法，其特征在于，所述噻唑橙在缓冲液中的终浓度为0.7~3.0 μ M。
【文档编号】C12Q1/68GK103993083SQ201410220070
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年5月22日 优先权日:2014年5月22日
【发明者】卫伟, 高春燕, 刘松琴 申请人:东南大学