荧光染料修饰的核苷酸及类似物的固相合成方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及荧光染料修饰的核苷酸及类似物的固相合成方法。
【背景技术】
[0002] 荧光染料修饰的核苷酸及类似物广泛应用于生物分析，DNA序列分析和临床诊断 等领域。荧光染料修饰的核苷酸及类似物一般在水中溶解度高，极性大。液相合成的方法 一般操作繁琐，分离比较困难，分离纯化需要结合反相色谱和离子色谱去除反应体系中残 余的游离的荧光染料和核苷酸，难以大量生产。
[0003] 美国化学家Merrifield(Merrifield,R.B.J.Am.Chem.Soc. 1963，85， 2149.)在1963年首先用树脂负载法合成了四肽化合物以来，固相有机合成已经从最初 的肽合成扩展到各类有机小分子，复杂天然产物的合成和DNA合成等领域。固相合成的特 点是简化了多步骤的合成，可避免因手工操作和物料重复转移而产生的损失；固相载体共 价相联的肽链处于适宜的物理状态，可通过快速的抽滤、洗涤未完成中间的纯化。使用过量 反应物，使目标反应完全，使最终产物得到较高的产率。
[0004] 本发明的目的在于提供荧光染料修饰的核苷酸及类似物的固相合成方法，解决荧 光染料修饰的核苷酸及类似物液相合成分离困难导致难以大量生产的技术问题。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了一种制备式（1)荧光染料修饰的核苷酸及类似物的固相合成方法，
【主权项】
1.制备式（I)荧光染料修饰的核苷酸及类似物的固相合成方法， ,Jfe . _ -H - - __
其中取代基具有以下的含义： M是H, Na或K Rl为H或OH R2为H或OH R3为C1-C8直链烷基（CH2)n Base为具有下列结构的喊基或喊基类似物取代基：
Dye为具有下列结构的荧光染料取代基团： 其中取代基具有以下的含义：
R4 为 OH, NH2, N (Me)2 (Et)2, N (Pr)2 R5 为 0,或 NH2+, N (Me)2+或 N (Et)2+, N (Pr)2+ R6 为 H, F, Cl，Br 或 I R7和R8为H或CH2NH2，或者具有以下结构的取代基：
R9 为 H，CH3 或 CH2CH3 其特征是包括以下步骤： a. 将式（II)化合物
Base为具有下列结构的喊基或喊基类似物取代基：
用DMF溶解，再加入氢氧化钠和树脂，搅拌均匀，振荡反应；再分别用Ν，Ν' -二甲基甲 酰胺，二氯甲烷，醋酸水溶液和甲醇洗涤后，得到式（III)化合物
b. 将式（IV)化合物
其中FMOC为芴甲氧羰基 与式（III)化合物，碘化铜以及无水DMF混合，在氮气保护下，注入无水三乙胺，在氮 气的保护下，投入四（三苯基膦）钯，反应结束后，再分别用N，N' -二甲基甲酰胺，二氯 甲烷，醋酸水溶液和甲醇洗涤后，再加入六氢吡啶的Ν，Ν'-二甲基甲酰胺溶液，去掉芴甲氧 羰基，得到式（V)化合物
RlO和Rll为H或芴甲氧羰基氨基甲基，或者具有以下结构的取代基：
与式（V)混合于Ν，Ν' -二甲基甲酰胺中，加入羟基苯并三唑，Ν，Ν'-二异丙基碳二亚 胺和DMAP4-二甲氨基吡啶，经酰胺化反应后，再分别用Ν，Ν' -二甲基甲酰胺，二氯甲烷， 醋酸水溶液和甲醇洗涤，获得式（VII)化合物；RlO和Rll为芴甲氧羰基氨基甲基时，树脂 洗涤后加入六氢吡啶的Ν，Ν' -二甲基甲酰胺溶液，去掉芴甲氧羰基后获得式（VII)化合物 然后加入六氢吡啶的Ν，Ν' -二甲基甲酰胺溶液，去掉芴甲氧羰基后获得式（VII)化合物
d.在所得的式（VII)化合物中加入盐酸，振荡后过滤，取滤液洗涤后冻干得到式（I) 化合物。
2. 根据权利要求1所述的荧光染料修饰的核苷酸及类似物的固相合成方法，其特征是 步骤a中的树脂为Merrifield树脂或者王树脂。
3. 根据权利要求1所述的荧光染料修饰的核苷酸及类似物的固相合成方法，其特征是 步骤a中式（II)化合物与树脂混合时，式（II)化合物与树脂的摩尔比是1. 5-3。
4. 根据权利要求1所述的荧光染料修饰的核苷酸及类似物的固相合成方法，其特征是 步骤a，b和c中，反应结束后洗涤树脂的溶剂为N，N'_二甲基甲酰胺，二氯甲烷，醋酸水 溶液和甲醇，醋酸水溶液的浓度为5-10%(w/v)。
5. 根据权利要求1所述的荧光染料修饰的核苷酸及类似物的固相合成方法，其特征是 步骤b和c中六氢吡啶的Ν，Ν' -二甲基甲酰胺溶液浓度为15-40%(v/v)。
6. 根据权利要求1所述的荧光染料修饰的核苷酸及类似物的固相合成方法，其特征是 步骤c中的酰胺化反应中，羟基苯并三唑与式（VI)化合物的摩尔比为0. 05-0. 2, N，Ν' -二 异丙基碳二亚胺与式（VI)化合物的摩尔比为0. 05-0. 2, 4-二甲氨基吡啶与式（VI)化合物 的摩尔比为0. 05-0. 2。
7. 根据权利要求1所述的荧光染料修饰的核苷酸及类似物的固相合成方法，其特征是 步骤d中盐酸浓度为0. 5-3 mol/L，盐酸与式（VII)化合物的摩尔比为1. 5-4. 5,洗涤所用 的洗涤液为乙酸乙酯。
【专利摘要】荧光染料修饰的核苷酸及类似物的固相合成方法。本发明涉及荧光染料修饰的核苷酸及类似物的固相合成方法。 （I）
【IPC分类】C07H19-10, C09K11-06, C07H1-00
【公开号】CN104650170
【申请号】CN201310580357
【发明人】马东杰, 张伟
【申请人】上海毕欧桥生物科技有限公司
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2013年11月20日