专利名称：通过单分子荧光分析检测核酸与核酸结合蛋白结合的方法
技术领域：
本发明涉及一种通过单分子荧光分析检测核酸与核酸结合蛋白结合的方法。尤其是本发明可通过研究基因与结合此基因的转录因子之间的相互作用而用于分析蛋白质功能及检测应用此蛋白质的药物。
背景技术：
生命现象通过由基因表达所合成的蛋白质的正常表达并发挥功能来实现，并且异常基因表达是癌症发生和细胞凋亡的一个原因。大多数基因表达由一种被称为转录因子的DNA结合蛋白控制。转录研究的发展正在揭示转录系统的一幅整体图像，基础转录机制的相似性已经在从酵母到人类的真核细胞中得到了显示。例如整合于启动子上的TBP(TATA框结合蛋白)/TFIIA/TFIIB复合物的空间结构已经被阐明，关于一条DNA链上的基础转录因子和基础转录因子参与的DNA高级结构形成之间的蛋白一蛋白相互作用的最新信息也正在被收集。鉴于此，对转录调节因子使转录激活或失活的分子机制的分析已经在进行中，并集中于一种作为转录平台的转录系统。最后，人们需要通过一个转录控制的网络(network)和级联(cascade)了解生命现象，如发育、分化、增殖、癌变。在这样的情况下，开发一种用于迅速并特异地检测转录因子与DNA结合反应的检测系统是人们所期望的。
迄今为止，作为一种检测转录因子与一段独特DNA序列特异结合的系统，使用电泳和一种同位素(放射性物质)的分析方法如凝胶移位测定(gel shift assay)、体外转录测定(in vitro transcription assay)及足印法(footprinting method)是众所周知的。
凝胶移位测定利用了转录因子和一段独特DNA序列的结合使DNA结合蛋白的电泳迁移率下降的原理。在此方法中，由于需要大量的几个毫克的蛋白质，电泳需要较长时间，并且进一步地，与DNA结合的蛋白质复合物的分子量需要通过放射自显影分析，因而需要大量的时间和成本。另外，即使找到了特异的样品，回收该样品也是困难的，并且其很难扩展到蛋白质组分析。另外，由于很多蛋白质需要筛选，所以很多时间、成本及劳动都是必需的。
体外转录测定基于转录因子与DNA序列的特异结合而测定转录因子活性，此测定通过将作为模板的指定DNA序列、RNA聚合酶、转录因子、及底物NTP(碱基成分为G、A、C、和U)加入试管并在其中进行RNA合成反应而完成。在此方法中，由于需要用电泳和接下来的放射自显影分析来检测合成的RNA，所以很多时间、成本及劳动都是必需的。
足印法可以确定DNA链上的可以结合到DNA特异位点的蛋白质的核苷酸序列识别位点。详细而言，首先，本方法中一个含有蛋白质结合位点的DNA片段的5’或3’端用32P标记，标记的DNA片段用DNA酶处理以进行非特异性碱基切割，在凝胶电泳之后进行放射自显影，从而获得彼此相差一个碱基长度而分离的DNA片段条带。另一方面，当用DNA酶处理结合了蛋白质的上述DNA片段时，结合位点的碱基不能被切割，相应的条带在放射自显影图中消失而在有色背景中显示白色。通过对比两者的放射性自显影图，可以确定蛋白质的结合位点和相应于此结合位点的核苷酸序列。在此方法中，由于同样必须进行电泳和放射性自显影分析，所以很多时间、成本及劳动都是必需的。
另外，还有一种利用与足印法相同的原理分析蛋白质和配体相互作用的方法。这是用于检测蛋白质构象改变的方法。通过应用于转录复合物，可以检测由于濒死状态复合物(moribund complex)和死端复合物(dead-end complex)而导致的构象改变(参见Nagai & Shimamoto(1997)Most conserved regions of the E.coli primary sigma factor areinvolved in interaction with RNA polymerase core enzyme.Genes Cells 2，725-734)。然而，还是在此方法中，由于用同位素、电泳和放射性自显影分析，所以需要设备投资和专业人员，进行一次实验是非常困难的。
发明内容
由于上述情况，本发明的目的之一就是提供一种检测核酸和核酸结合蛋白结合的新方法，其可以解决所有由于使用同位素(放射性物质)和电泳的分析方法如凝胶移位测定、体外转录测定及足印法而产生的问题。
本发明人发现了一种新方法，其可以简便而迅速地检测能与核酸结合的蛋白质。本发明使用一种非放射性物质作为检测标记，由此可完成本发明。本发明的方法可以立刻解决由于前述检测方法如凝胶移位测定、体外转录测定及足印法而产生的问题。
本发明提供了下述方法(1)一种通过单分子荧光分析(monomolecular fluorescentanalysis)检测核酸与核酸结合蛋白结合的方法。
(2)一种通过单分子荧光分析检测核酸与两种核酸结合蛋白结合的方法，其包括检测核酸与第一种核酸结合蛋白结合的步骤；及当在上一步中已经检测到核酸与第一种核酸结合蛋白结合后，检测所得到的核酸—蛋白质复合物与第二种核酸结合蛋白的结合。
(3)一种通过单分子荧光分析检测核酸与n种核酸结合蛋白结合的方法(n表示2或大于2的整数)，其包括检测核酸与第一种核酸结合蛋白的结合的步骤；及当在上一步中已经检测到核酸与从第一个到第X-1个共X-1个核酸结合蛋白结合时，重复检测所得到的核酸—蛋白质复合物与第X个核酸结合蛋白结合的步骤n-1次，从X＝2到X＝n顺序进行。
(4)(1)-(3)项中任一项的方法，其进一步包含通过使用针对任何一个核酸结合蛋白的抗体确定核酸与一或多种核酸结合蛋白结合的步骤。
(5)(1)-(4)项中任一项的方法，其中所述核酸具有蛋白结合位点的序列。
(6)(1)-(5)项中任一项的方法，其中所述核酸结合蛋白是TATA框结合蛋白。
(7)(1)-(6)项中任一项的方法，其中所述核酸与所述核酸结合蛋白的结合通过光信号检测，所述光信号通过将所述核酸与荧光物质、发光物质、酶发光物质、或放射性物质结合而产生。
(8)(1)-(7)项中任一项的方法，其中所述核酸结合蛋白是基础转录因子、转录促进因子、或转录抑制因子。
附图简述
图1.蛋白质分子量和平移扩散时间的关系图2.DNA大小和平移扩散时间的关系图3.用于本发明检测方法的荧光相关分析装置的一个实例。
在图3中，指代数字1-15表示如下1-激光源2-光度调节装置(ND滤镜)3-光衰减率选择装置(ND滤镜转换器)4-双色相面镜5-物镜6-镜台7-滤镜8-管状透镜(tube lens)9-反射镜10-针孔11-透镜12-光探测器(雪崩光电二极管)
13-荧光强度记录装置(计算机)14-样品15-光束图4.DNA与DNA结合蛋白之间相互作用的检测实现本发明的最佳方式单分子荧光分析技术首先解释一下单分子荧光分析(一种用于本发明方法的分析技术)。
单分子荧光分析是一种测量从进入并位于微小共聚焦区域的荧光分子产生的荧光信号，并根据函数关系分析所获得数据的技术。本技术包括(1)用荧光相关光谱学(Fluorescence CorrelationSpectroscopy)分析；(2)荧光强度分布分析(Fluorescence IntensityDistribution Analysis)；及(3)荧光强度多分布分析(FluorescenceIntensity Multiple Distribution Analysis)。同时进行这些分析，下面具体解释每一项(1)荧光相关光谱学(以后简称为FCS)是一种测量介质中荧光标记的靶分子涨落运动的技术，并可以通过使用自相关函数(Autocorrelation function)正确地测量单个靶分子的微运动(参见D.Magde和E.Elson，“Fluorescence correlation spectroscopy.II.Anexperimental realization”，Biopolymers 1974 13(1)29-61)。
FCS可以通过分析来自荧光强度涨落的扩散时间和通过确定物理数量(分子数目及大小)进行，所述分析通过记录溶液中微区域中的荧光分子的布朗运动而完成。FCS分析记录分子涨落从而所述微区域可有效地以高灵敏性和高特异性检测分子间相互作用。
下面更详细地解释FCS检测的原理。在FCS中，由样品中微区域产生的荧光信号被检测到并用显微镜量化。接下来介质中的荧光标记的靶分子通常会移动(布朗运动)，从而检测到的荧光强度会根据靶分子进入微视野区域的频率和在此区域中的停留时间而变化。
例如，当表观分子量由于发生分子二聚化而增加时，靶分子的运动会减慢，表观分子数目会降低，导致靶分子进入一个微视野区域的频率下降，观察到的荧光强度会改变。通过监控这样的荧光强度变化可以追踪靶分子的表观分子量变化。
(2)荧光强度分布分析(以后简称为FIDA)由以下参考文献公开P Kask，et al.，PNAS 23，96，13756-13761，1999和WO 98/16814。FIDA是一种用激光照射样品、用APD(高灵敏度光探测器)测量发射自样品的荧光分子的激发光、并用关于在每40微秒的极短时间内光子计数的双泊松分布函数分析测量到的荧光信号及接下来进行统计分析的技术。通过FIDA，可以计算每分子荧光强度(亮度，qn)和荧光分子的数目(cn)。即使存在多种类型的分子，它们也可以通过分布分析区分，并且通过将亮度与每一种类型分子的数目相乘可以计算一个数值，作为总荧光量。
(3)荧光强度多分布分析(以后简称为FIMDA)将FCS和FIDA同时进行。详细内容由参考文献K Palo，Biophysical Journal，79，2858-2866，2000)公开。根据FIMDA，荧光分子平移扩散时间的数据、分子数目、每分子荧光强度(亮度)可以同时得到。由此不仅可以确定分子大小，还可以根据亮度差异区分分子大小上大约2倍的变化，这是用FCS所不能得到的。在FCS中，只能区分分子大小上大约5倍的变化。
本发明的检测方法用上述的单分子荧光分析技术可以进行本发明的检测。具体地，利用单分子荧光分析技术，可以通过平移扩散时间增加(即分子量增加)来检测“游离的核酸结合蛋白”与核酸结合而形成复合物(见图4)。另外，利用单分子荧光分析技术，可以通过每种分子的分子数目的变化或每分子荧光强度的变化得到“游离的核酸结合蛋白”和通过与核酸结合而得到的“核酸—蛋白复合物”的存在比例。因此，利用本发明的单分子荧光分析技术的检测方法不仅可以检测到是否存在核酸结合蛋白与核酸的结合，还可以检测一种核酸结合蛋白结合核酸的能力(结合力强度)。
下面详细解释本发明的方法。
本发明的检测方法是一种通过单分子荧光分析技术检测核酸与核酸结合蛋白结合的方法。在本发明的检测方法中，核酸结合蛋白可以是一种或多种。
也就是说，在两种核酸结合蛋白的情况下，利用本发明的单分子荧光分析技术的检测方法包括检测核酸与第一种核酸结合蛋白结合的步骤，及当在上一步中检测到核酸与第一种核酸结合蛋白的结合后，检测得到的核酸—蛋白复合物与第二种核酸结合蛋白结合的步骤。
进一步地，在n种核酸结合蛋白的情况下(n表示2或大于2的整数)，利用本发明的单分子荧光分析技术的检测方法包括检测核酸与第一种核酸结合蛋白结合的步骤；及当在上一步中已经检测到核酸与从第一个到第X-1个共X-1个核酸结合蛋白结合时，重复检测所得到的核酸—蛋白质复合物与第X个核酸结合蛋白结合的步骤n-1次，从X＝2到X＝n顺序进行。通常预期n种为2至9种。
根据本发明的检测方法，通过预先选择一种“核酸”可以研究“结合所述核酸的核酸结合蛋白”。另外，根据本发明的检测方法，通过预先选择一种“核酸结合蛋白”可以研究“结合所述核酸结合蛋白的核酸”。
(关于核酸和核酸结合蛋白)在本发明中，“核酸”可以是DNA或RNA，并且可以包含修饰的碱基。另外，所述核酸可以是单链或双链的，但是不被此特定限制。当一种“核酸”被预先选定并且一种“结合所述核酸的核酸结合蛋白”被研究后，所述“核酸”优选地是具有蛋白结合位点的核酸。更特别地，所述核酸可以是包含可以通过特异地结合一种蛋白质以起始基因转录或者促进或抑制转录的蛋白质结合位点的核酸。如同所描述的，当一种“核酸”被预先选定并且一种“结合所述核酸的核酸结合蛋白”被研究后，所述“核酸结合蛋白”可以是任意一种蛋白，其被预期与所述核酸特异地或非特异地结合。
另外，所述“核酸”的长度不被特别限定，只要其包含一段所希望的序列(例如蛋白质结合位点)即可。然而，当基于分子量变化而检测到一个“核酸”和一个“核酸结合蛋白”的结合，并且所述“核酸结合蛋白”被荧光标记时，设定所述“核酸”的分子量是所希望的，这样相对于“游离的核酸结合蛋白”，分子量的5倍或更多的增加可由所述“核酸结合蛋白”和所述“核酸”的结合而产生复合物导致。
另一方面，当一种“核酸结合蛋白”被预先选定并且一种“结合所述核酸结合蛋白的核酸”被研究时，所述“核酸结合蛋白”不被特别限定，只要已知其与一种核酸结合即可。其具体实例包括通过结合DNA参与转录调节如转录起始、延伸、和终止的转录因子。更特别地，转录因子的实例包括基础转录因子、转录促进因子、及转录抑制因子。已知转录因子超过50种，其实例包括AP-1(激活蛋白1)、c-Myb、和FAST-1。据报道转录因子的分子量是12至250kDa，很多因子分子量大约是40kDa。作为转录因子结合的序列，一段短DNA长6个碱基，可以通过单分子荧光分析测量的核苷酸序列优选地具有至多5200碱基对的长度，更优选地具有至多1000碱基对的长度。这样，当一种“核酸结合蛋白”被预先选定并且一种“结合所述蛋白的核酸”被研究时，所述“核酸”可以是任意一个核酸，其被预期与所述“核酸结合蛋白”特异地或非特异地结合。
当多种“核酸结合蛋白”被预期，每一种核酸结合蛋白可以直接结合一种核酸，或可以通过其他核酸结合蛋白间接结合一种核酸。
预先选定的“核酸”的实例包括包含TATA框的核酸。TATA框是一段独特的DNA序列，其位于基因转录起始位置的上游，并且在转录起始中具有重要作用。TATA框的一段序列已知是5’-TATAA(或T)AT(或A)-3’。已知一种TATA框结合蛋白(即转录因子TFIID)与此TATA框结合，其后转录因子TFIIB结合其上。根据本发明的检测方法，能结合到一个蛋白质结合位点如所述TATA框的蛋白质可以被研究。
另外，当一个TATA框结合蛋白(即TFIID)被用作预先选择的“核酸结合蛋白”的一个具体实例时，所述TATA框结合蛋白可以结合的核酸可以根据本发明的方法研究。
在本发明中，“核酸”和“核酸结合蛋白”可以是通过任何方法制备的。关于“核酸”，所希望的序列可以通过合成制备。关于所述“核酸结合蛋白”，可以通过由对编码所述蛋白的基因进行已知的遗传工程步骤进行体外表达获取核酸结合蛋白，或者可以从体内或细胞内提取含有此蛋白的组分，或者可以使用从蛋白质或肽文库获得的样品。
本发明的检测方法不限于前述具体描述，无须赘述，其还可以用于检测任意核酸与任意核酸结合蛋白的结合。
下面阐述真核细胞的转录。
在真核细胞中存在3类RNA聚合酶，每一种转录一类不同的基因。RNA聚合酶II和6种基础转录因子(TFIIA、TFIIB、TFIID、TFIIE、TFIIF、TFIIH)对于转录编码蛋白的基因是必需的，在这些因子中，TFIID是唯一具有DNA结合能力的因子。TFIID结合于TATA框，接下来不同的因子在启动子上依次组装，从而形成转录起始复合物(transcrition initiation complex，PIC)。RNA聚合酶从PIC上分离后转录即进入转录延伸阶段。在最近的几年中，研究了组成转录系统的不同因子，PIC的形成机制已经被详细阐明。进一步地，还揭示了基础转录因子或转录延伸因子的突变与人类遗传病密切相关，并且人们非常需要一种有用的检测方法。因而，本发明的检测方法还可用于研究转录因子的突变对其结合DNA的能力的影响。
(检测核酸与核酸结合蛋白结合的步骤)本发明中，单分子荧光分析需要所述“核酸结合蛋白”和所述“核酸”中的至少一种被预先标记。实例(A)到(C)作为标记的代表性模式在下面得到阐述，但是本发明并不限于这些。
(A)当“核酸结合蛋白”用荧光标记时在本实例中，比较理想的是“核酸”长度比较长，从而在与核酸结合为复合物时一个游离核酸结合蛋白的分子量增加至其5倍或更多。例如，当分子量为38kDa的转录因子TFIID被用作“核酸结合蛋白”时，比较理想的是合成的用于结合的“核酸”分子量优选的是152kDa或更高。由于在双链DNA中一个碱基对的分子量是660Da，所以分子量为152kDa的DNA相应于230碱基对。另一方面，若“核酸”长度小于230碱基对，所述蛋白质和核酸的结合可以通过用两种颜色的荧光标记每一个蛋白质和所述核酸来分析，并进行交叉相关分析。
(B)当“核酸”被标记时若核酸被荧光标记，所述核酸可以很容易地通过在末端合成一段寡核苷酸而掺入荧光物质标记。另外，核酸也可以用如下方法(缺口翻译方法(nick translation method))标记用脱氧核糖核酸酶I处理任意核酸以产生一个缺口(nick)，加入四种脱氧核苷酸和DNA聚合酶I进行修复合成，其中荧光标记的核苷酸通过第二个反应掺入DNA中。由于所述“核酸结合蛋白”显著大于合成的寡核苷酸，所以核酸大小根据复合物的形成而显著地改变，因此此类复合物的形成可以通过单分子荧光分析识别。
(C)当多个分子用荧光标记时通过用荧光标记，“核酸”和“核酸结合蛋白”可以用两种颜色分类，它们都可以通过检测交叉相关的分析方法(荧光交叉相关分析)区分。
作为荧光标记法的标记，任何标记都是可用的，只要其是能够发射可被光追踪的信号的物质，即可用光检测到的物质即可。例如可以使用一种荧光物质、一种发光物质、一种酶发光物质、和一种放射性物质。特别地，优选使用荧光色素，因为色素可以使单个测量微小物质的存在成为可能。优选地，可以使用发射可检测的荧光的任意荧光物质，例如可以使用各种荧光色素如罗丹明、TAMRA、Cy3、Cy5(Amersham)、Alexa系列(分子探针)、绿色荧光蛋白GFP(Clontech)。荧光标记可以通过已知步骤进行。
检测“核酸”与“核酸结合蛋白”结合的一个步骤是通过将所述“核酸”和所述“核酸结合蛋白”置于一种指定溶液中而进行的。所述指定溶液可以是一种已知在其中一种“核酸”与一个已知与所述核酸结合的蛋白可以结合的溶液。例如可以使用生理盐水或磷酸盐缓冲溶液。
通过在所述指定溶液中将所述“核酸”与所述“核酸结合蛋白”维持在所述指定条件下，在众多“核酸结合蛋白”中只有能与所述“核酸”结合的蛋白质引起结合反应。此处指定条件(温度、pH、反应时间等等)可以根据“核酸”的类型适当地设定。
若所述“核酸结合蛋白”用荧光标记，应向反应溶液中加入的“核酸结合蛋白”的量应是使终浓度优选地为大约0.01至100nM的量，更优选地使终浓度为大约0.1至50nM。应向反应溶液中加入的“核酸”的量应是使终浓度优选地为大约0.01nM至10μM的量，更优选地使终浓度为大约0.1至50nM。
一个反应的实例是如下面实施例中所描述的，所述反应可以通过将每50μL含有10nmol/L用5-TAMRA标记的所述“核酸”的生理缓冲溶液和含有1-100nmol/L所述“核酸结合蛋白”的生理缓冲溶液混和，并在室温温育15-30分钟进行。
对于温育，含有一套处于悬浮状态的反应成分的指定反应溶液可以保持在一种适当的液体容纳手段如试管、孔、比色杯、凹槽、管、平板、及多孔介质中。此处所述液体容纳手段的形状、材料、大小被优选地选择，从而各种检测步骤的部分或全部如分配、搅拌、温育、测量、及运送可以迅速进行。例如，由于通过单分子荧光分析的测量在光聚焦水平上使用极端微小的区域作为测量场所，所以所述手段应是一种非常小型的液体容纳手段。特别地，通过光测量的检测，所述液体容纳手段优选地具有开口部位以用于测量光束的进和/或出，从而所述用于测量的光束与反应成分尽可能地直接相联系。
在反应后的溶液中，与所述“核酸”结合的所述“核酸结合蛋白”和在反应溶液中游离的所述“核酸结合蛋白”可以基于各自分子量的差异通过单分子荧光分析测量。从而，所述“核酸结合蛋白”结合到所述“核酸”的容易程度(亲和力)可以作为解离常数而得到。
另外，在所述“核酸”和“核酸结合蛋白”的结合反应之后将特异针对一种核酸结合蛋白的抗体加入到反应溶液中，从而可以可靠地通过分子量的进一步增加而确定所述核酸结合蛋白与核酸结合(参见下面所描述的实施例)。
另外，核酸和核酸结合蛋白的分子量可以很容易地由通过分析而得到的平移扩散时间计算出来。图1显示当蛋白质分子量增加时平移扩散时间也增加。在图1中，横坐标轴表示蛋白质的分子量，纵坐标轴表示平移扩散时间(μ秒)。图1中的指代数字1-9指代下述蛋白质1.α-银环蛇毒素，分子量80002.钙调蛋白，分子量167003.胰蛋白酶抑制剂，分子量21000
4.牛血清白蛋白，分子量660005.运铁蛋白，分子量800006.菜豆(Phaseolus vulgaris)凝集素PHA-L，分子量1200007.IgG，分子量1500008.血纤蛋白原，分子量3400009.α-晶体蛋白，分子量800000另外，图2显示当DNA大小(即碱基对)增加时平移扩散时间也增加。在图2中，横坐标轴表示DNA核苷酸序列长度，纵坐标轴表示平移扩散时间(μ秒)。
(进行单分子荧光分析的装置)下面将会通过参考图3解释实现单分子荧光分析的装置(此后也称为荧光相关分析装置)的实例。
如图3所示，荧光相关分析装置装备有激光源1、用于减弱从激光源1发出的光束15的强度的光度调节装置(此处是ND滤镜)2、用于设定适当的光度调节装置2的光衰减选择装置(此处是ND滤镜转换器)3、放置包含荧光分子的样品14的镜台6、用于将从激光源1发射的光束15汇聚于样品14以形成共聚焦区域的光系统4和5、将从样品14发射的荧光汇聚的光系统7-11、用于检测汇聚的荧光的光探测器12、及用于记录荧光强度变化的荧光强度记录装置13。如所描述的，所述荧光相关分析装置使用共焦激光显微镜。
在图3中，激光源1发出的激光可以是任何氩离子激光、氦—氖激光、氪、及氦—镉。在图3中，用于将从激光源1发射的光束15汇聚于样品以形成共聚焦区域的光系统4和5特别地是指双色相面镜4和物镜5。从激光源1发出的光束15沿着图3中箭头所示的路径行进，即从激光源1发出的光束15的强度首先根据光度调节装置(此处是ND滤镜)2的衰减度衰减，接下来光束15通过双色相面镜4在相对于入射光线的方向上折射90度，并通过物镜5照射到位于镜台6上的样品。通过这种方式，所述光束在一个微小的点上汇聚于样品以形成共聚焦区域。
在图3中，将从荧光分子发射的荧光汇聚于共聚焦区域的光系统7-11特别地是指滤镜7、管状透镜8、反射镜9、针孔10、及透镜11。从荧光分子发出的荧光沿着图3中箭头所示的路径行进，即从荧光分子发出的荧光首先在光线行进方向上穿过双色相面镜4，由反射镜9经过滤镜7和管状透镜8折射，在针孔10形成一幅图像，再经过透镜11汇聚于光探测器12。
用于检测汇聚的荧光的光探测器12(此处是指雪崩光电二极管)将接受到的光信号转换成电信号，并将其传送到荧光强度记录装置(此处是指计算机)13。
用于记录荧光强度变化的荧光强度记录装置13进行记录并分析被传送的荧光强度数据。特别地，通过分析所述荧光强度数据可以设定自相关函数。由于荧光分子结合到受体而产生的分子量增加和游离荧光分子数量减少可以通过自相关函数的改变而检测到。
用于实现单分子荧光分析的装置(荧光相关分析装置)不限于图3所示的实例。例如，当“核酸”和“核酸结合蛋白”被用两种具有不同激发波长的荧光物质可区分地标记时，则需要所述荧光相关分析装置具有两种激光源，以用于激发各自的荧光物质，并且还需要两种光探测器以用于检测从各自荧光物质发出的光。所述光探测器可以是除APD(雪崩光电二极管)之外还含有光电倍增管的设备。
本发明的相关效果常规地，基于转录因子结合到核酸的结合力的转录因子活性测量通过电泳和同位素(放射性物质)的分析进行，如凝胶移位测定、体外转录测定和足印法。
凝胶移位测定利用了转录因子和一段独特DNA序列的结合使DNA结合蛋白的电泳迁移率下降的原理，但是由于需要大量的数毫克的蛋白质，电泳需要较长时间，并且与DNA结合的蛋白质复合物的分子量需要通过放射自显影分析，因而需要大量的时间和成本。另外，即使找到了特异的样品，回收该样品也是困难的，并且本测定很难扩展到蛋白质组分析。另外，由于很多蛋白质需要筛选，所以很多时间、成本及劳动都是必需的。同样，体外转录测定和足印法需要复杂的电泳操作和放射自显影。
然而，通过用本发明的单分子荧光分析技术的检测方法，上述常规方法的问题已经得到了解决，并且本发明的检测方法还具有下面所述的优点(1)清除了常规方法中特有的麻烦，并且可以迅速并简便地检测核酸与核酸结合蛋白的结合。一般地，单分子荧光分析的测量时间只需几秒至几十秒，并且其测量操作非常简单。另外，测量成本可以被压缩至较低。
(2)本发明的检测方法不仅可以检测是否存在核酸结合蛋白与核酸的结合，还可以检测核酸结合蛋白与核酸的结合能力(结合力强度)。
(3)由于应用了单分子荧光分析技术，几十微升的样品溶液即已足够用于本发明的检测方法，甚至即使样品在样品溶液中的浓度很低，仍然可以进行高灵敏度检测。另外，即使样品溶液是未纯化的粗溶液，此溶液仍可用于本发明的检测方法。
(4)即使粗纯化溶液被用作样品溶液，并且样品溶液中所含的核酸或核酸结合蛋白的分子量是未知的，其分子量仍可以根据作为测量到的结合反应的结果的平移扩散时间的增加值计算出来。
综上所述，根据本发明的检测方法，常规方法如凝胶移位测定、体外转录测定和足印法的所有问题都可以得到解决。其中根据本发明的方法，核酸和具有核酸结合能力的蛋白之间的相互作用可以在分子水平以高灵敏度和低成本迅速地测量。另外，分子量可以根据由分析得到的平移扩散时间计算出来。
实施例用TAMRA标记具有TATA框序列的合成寡核苷酸并在溶液中分析所述寡核苷酸与转录因子TFIID及TFIIB形成复合物的行为。结果显示于图4和表1。
表1
转录因子TFIID的基本性质参见参考文献(Ehrenberg，M.，Rigler，R.，；Chem.Phys.，4，390-410，1974)。转录因子TFIIB的基本性质参见参考文献(Patterson，M.G.，et al.；Science，248，1625-1630，1990)。
从具有TFIID结合位点的用TAMRA标记的25个碱基对的寡核苷酸(Sigma Genosis)获得一条双链DNA，接下来向其中加入人重组转录因子TFIID和TFIIB(Promega)。此标记的双链DNA在表1和下文中称作“TFIID结合位点的25寡核苷酸”。所述“TFIID结合位点的25寡核苷酸”在溶液中的浓度设为5nM，转录因子TFIID和TFIIB在溶液中的浓度分别设为50nM。
所述“TFIID结合位点的25聚寡核苷酸”的序列如下
5’-GCA GAG CAT ATA AGG TGA GGT AGG A-3’(SEQ ID NO.1)5’-CGT CTC GTA TAT TCC ACT CCA TCC T-3’(SEQ ID NO.2)在图4中，指代数字(1)是指当只含有所述“TFIID结合位点的25聚寡核苷酸”的溶液被用作样品时所述寡核苷酸荧光分子的平移扩散时间。指代数字(2)是指当转录因子TFIID加入到(1)中的溶液后溶液中的荧光分子的平移扩散时间。指代数字(3)是指当转录因子TFIIB加入到(2)中的溶液后溶液中的荧光分子的平移扩散时间。指代数字(4)是指当抗-TFIIB单克隆抗体(抗-TFIIB)加入到(3)中的溶液后溶液中的荧光分子的平移扩散时间。指代数字(5)是指当只含有用荧光标记的不具有TFIID结合位点的合成寡核苷酸(21聚体)的溶液被用作样品时所述寡核苷酸荧光分子的平移扩散时间。指代数字(6)是指当转录因子TFIID、转录因子TFIIB、和抗-TFIIB单克隆抗体加入到(5)中的溶液后溶液中的荧光分子的平移扩散时间。另外，在关于指代数字(1)至(6)的情形中，每个分子的行为被以图例显示于图4中。
所述“TFIID结合位点的25聚寡核苷酸”的分子量是17kDa，平移扩散时间是178微秒(图4(1))。图中可见当TFIID加入到所述寡核苷酸中时，平移扩散时间变为237微秒。此处由复合物的55kDa分子量预期平移扩散时间为264微秒，测量值和预期值之间的差异在大约10％之内(图4(2))。由此可见分子量可由平移扩散时间估计。
进一步地，通过加入转录因子TFIIB，复合物变得更大，其分子量变为87kDa。图中可见当每分子分子量增加时，以原始合成寡核苷酸为标准的平移扩散时间也增加，其数值接近计算值(图4(3))。此时可见平移扩散时间的测量值和预期值之间的差异仅在大约4％之内。
进一步地，通过加入抗-TFIIB或抗-TFIID单克隆抗体证实，溶液中出现一个复合物(图4(4))。所述抗体分子量为140kDa，包含此抗体的复合物分子量为227kDa。图中可见平移扩散时间的预期值和相似测量获得的测量值之间的差异在大约3％之内。此处当向溶液中加入抗体时，可使用任何抗-TFIIB抗体和抗-TFIID抗体，或同时使用二者。
如上所述，图4中的指代数字(1)至(4)显示通过使蛋白质与所述“TFIID结合位点的25聚寡核苷酸”结合，所述寡核苷酸荧光分子的大小增加，所述荧光分子的平移扩散时间增加。
另一方面，在不具有TATA框结合序列的合成寡核苷酸(21聚体)中，即使加入转录因子和抗—转录因子抗体，具有荧光信号的复合物还是不能形成，并且平移扩散时间并没有明显增加(表1，图4(5)和(6))。
工业应用根据本发明，提供了一种通过单分子荧光分析检测核酸和核酸结合蛋白结合的方法。特别地，本发明可用于研究基因和与此基因结合的转录因子之间的相互作用、分析蛋白质功能、及用此方法检测药物。
序列表<110>奥林巴斯光学工业株式会社<120>通过单分子荧光分析检测核酸与核酸结合蛋白结合的方法<130>03S0569P<140>PCT/JP03/05189<141>2003-04-23<160>2<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述具有TFIID结合位点的寡核苷酸<400>1gcagagcata taaggtgagg tagga25<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述具有TFIID结合位点的寡核苷酸<400>2tcctacctca ccttatatgc tctgc2权利要求
1.一种通过单分子荧光分析检测核酸与核酸结合蛋白结合的方法。
2.一种通过单分子荧光分析检测核酸与两种核酸结合蛋白结合的方法，所述方法的特征包括检测核酸与第一种核酸结合蛋白结合的步骤；及当在上一步中已经检测到核酸与第一种核酸结合蛋白结合后，检测所得到的核酸一蛋白质复合物与第二种核酸结合蛋白的结合。
3.一种通过单分子荧光分析检测核酸与n种核酸结合蛋白结合的方法(n表示2或大于2的整数)，所述方法的特征包括检测核酸与第一种核酸结合蛋白结合的步骤；及当在上一步中已经检测到核酸与从第一个到第X-1个共X-1个核酸结合蛋白结合时，重复检测所得到的核酸—蛋白质复合物与第X个核酸结合蛋白结合的步骤n-1次，从X＝2到X＝n顺序进行。
4.权利要求1至3任一项的方法，其进一步的特征是包含通过使用针对任何一个核酸结合蛋白的抗体确定核酸与一或多种核酸结合蛋白结合的步骤。
5.权利要求1的方法，其特征是所述核酸具有蛋白质结合位点的序列。
6.权利要求1的方法，其特征是所述核酸结合蛋白是TATA框结合蛋白。
7.权利要求1的方法，其特征是所述核酸与核酸结合蛋白的结合用光信号检测，所述光信号通过将所述核酸与荧光物质、发光物质、酶发光物质、或放射性物质结合而产生。
8.权利要求1的方法，其特征是所述核酸结合蛋白是基础转录因子、转录促进因子、或转录抑制因子。
全文摘要
本发明涉及一种通过单分子荧光分析检测核酸与核酸结合蛋白结合的方法。
文档编号G01N33/50GK1860368SQ0382635
公开日2006年11月8日 申请日期2003年4月23日 优先权日2003年4月23日
发明者加藤则子, 冈本直明 申请人:奥林巴斯株式会社