专利名称：实时荧光定量pcr检测基孔肯亚病毒核酸的方法
技术领域：
本发明提供一种利用实时荧光定量PCR检测基孔肯亚病毒核酸的方法。
背景技术：
基孔肯雅病毒(Chikungunya virus)是单股正链RNA病毒，属于披膜病毒科 (Togaviridae)甲病毒属(Alphavirus)，引起基孔肯雅热(Chikungunyafever，CHIK)。该 病为一种急性传染病，通过伊蚊传播给人，在临床上以发热、关节疼痛、皮疹和轻度出血为 特征。1953年首次从坦桑尼亚的1例发热患者的血液中分离出基孔肯雅病毒。20世纪 60-90年代，在非洲中部和南部的许多国家该病均有流行，并分离到CHIK病毒，如苏丹、乌 干达、刚果民主共和国、中非共和国、马拉维、津巴布韦、肯尼亚和南非；西非的塞内加尔、贝 宁、几内亚共和国、科特迪瓦和尼日利亚等；在东南亚，1999年印度尼西亚首次暴发CHIK， 2001-2003年此地再次出现该病流行；在印度洋岛屿，近几年，印度洋岛屿出现大规模的 CHIK暴发流行。2005年，科摩罗岛发生大暴发流行并迅速传播到整个印度洋的其他岛屿； 在欧洲，2007年7月，意大利拉文纳省的2个村庄发生CHIK ；2004-2007年，亚洲和非洲等 地区的CHIK暴发流行不断发生，其中2006年全球共发生CHIK患者大约200万例。值得注 意的是我国的台湾地区在1967年和2006年曾发生过CHIK流行，2008年我国大陆首次发现 的CHIK输入性病例。但截至目前我国尚无CHIK本土流行的确切报道。纵观历史，CHIK已 经成为全球区日益严重的公共卫生问题。目前，针对外来传染病的实验室快速检测技术主要采用的是免疫学检测及核酸检 测技术，尤其以PCR技术为代表的核酸检测技术，能够非常灵敏的检测出各种疫病病原体 的核酸。但是由于PCR扩增技术经常带来特异性问题，各国科学家和技术人员都在PCR技术 基础上，结合其它新技术，努力改善PCR技术的特异性和敏感度。近年来，基于PCR技术及 ABI Taqman探针杂交技术发展起来的实时荧光PCR技术极大地改善了传统PCR技术的特异 性和敏感性以及抗污染的能力，已经越来越广泛的应用到各种疫病的检验检疫中。随着探 针技术的进一步发展完善，一种新型的Hydro Easy Probes的出现，能够有效的改进Taqman 探针本底信号高的缺点，并且进一步提高检测的灵敏度。本发明拟采用新型HydroEasy Probes设计技术，开发基孔肯雅病毒的荧光PCR检测诊断方法，为国境口岸的基孔肯雅病 毒的快速检测提供有力保障。
发明内容
本发明的目的在于提供一种实时荧光定量PCR检测基孔肯亚病毒核酸的方法。该 方法利用实时荧光定量PCR检测技术，设计了一对引物和探针对病毒样本进行实时定量检 测。该方法检测特异性好，灵敏度高。本发明实时荧光定量PCR检测基孔肯亚病毒核酸的方法，首先包括获得检测基孔 肯亚病毒核酸的引物和探针的步骤，该步骤具体为(1)收集筛选基孔肯亚病毒全基因组序列，利用生物信息学软件对其进行同源性比对，在其保守区设计引物；(2)根据PCR扩增 区域内的核苷酸序列设计特异性探针，并登录GENEBANK中检测探针的特异性；(3)对待检 测物进行实时定量分析。在本发明上述方法中，所筛选的基孔肯亚病毒可以是NCBI公布的所有基孔肯亚 病毒全基因组序列。另外，本发明的方法中，可以利用DNASTAR软件进行序列的同源性比 对。比对结果见
图1。图中阴影部分为全序列中某个高保守区。在本发明引物和探针设计中，首先在比对的序列保守区设计上下游引物，根据引 物设计原理，在保守区之间设计上游和下游引物，其中在下游引物的第5位和第25位存在 简并性，设计位于扩增区域内的特异的探针，其中在探针的第19位和第21位存在简并性。 引物和探针在合成时，探针5'端连接FAM荧光基团，3'端连接BHQ非荧光基团。引物的特 异性增强。引物和探针序列见表1。表 权利要求
实时荧光定量PCR检测基孔肯亚病毒核酸的方法，其特征在于，该方法利用实时荧光定量PCR检测技术，通过设计一对引物和探针对病毒样本进行实时定量检测，所设计引物和探针序列如下
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法包括引物和探针的获得，对基孔肯 亚病毒核酸的检测；其中，引物和探针的获得步骤为(1)收集筛选基孔肯亚病毒全基因组 序列，利用生物信息学软件进行同源性比对，并在其保守区设计引物，(2)根据PCR扩增区 域内的核苷酸序列设计特异性探针，并登录 GENEBANK检测探针的特异性；对基孔肯亚病毒 核酸的检测步骤为首先提取病毒的核酸，然后利用所设计的引物和探针对待检测物进行 实时荧光定量PCR检测。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述RT-PCR扩增具体为配制一定组分浓度 的25 μ L PCR反应体系。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样本包括蚊虫、蝙蝠、人血清及组织、细 胞培养液、野生灵长类、家畜等。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述实时荧光定量PCR检测技术中，所述 探针上连接的荧光基团包括FAM-BHQ、FAM-TAMARA。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述RT-PCR反应适用于ABI实时PCR系统、 BioRad实时PCR检测系统、Stratagene定量多聚酶链反应仪来完成。
全文摘要
本发明公开了一种实时荧光定量PCR检测基孔肯亚病毒核酸的方法，该方法包括引物和探针的获得及基孔肯亚病毒核酸的检测。本发明具有特异性好，灵敏度高等优点。
文档编号C12Q1/70GK101935715SQ20101027664
公开日2011年1月5日 申请日期2010年9月8日 优先权日2010年9月8日
发明者姚李四, 张晓龙, 燕清丽 申请人:中国检验检疫科学研究院