3型鸭肝炎病毒荧光定量rt-lamp检测试剂盒及其应用和方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体设及3型鸭肝炎病毒巧光定量RT-LAMP检测试 剂盒及其应用和方法。
【背景技术】
[0002] 近几年随着养殖业发展的不断规模化、工业化、现代化，病毒性或细菌性疾病感染 现象更加普遍，并且由于微生物变异更加频繁，导致其耐药性更加严重。鸭肝炎病毒中的 DHAV值uck viral h巧atitis A virus)存在于养鸭的各个国家和地区，而DHAV中的3型鸭 肝炎病毒值HAV-3)自被发现W来，其感染维鸭的症状与1型极其相似，且针对DHAV-3无疫 苗，因此建立一种准确、快速、简便、定量的DHAV-3检测方法具有重要意义。
[0003]目前，针对DHAV的检测方法有W下几种：（1)病毒的分离与鉴定，运是最可靠的传 统检测方法，但由于有些病毒的变异株不能分离培养，导致该方法的使用受限；（2)形态学 方法，运是一种利用胶体金免疫电镜技术对病毒颗粒进行检测的方法，但由于胶体金制备 成本高，经济性差，导致此方法使用不够普遍；（3)血清学检测，但该方法同样由于DHAV抗 原或抗体的纯化难度高而受限，即使用单克隆抗体对血清学检测方法进行改进，但由于单 抗制备繁琐，导致该方法在基层不易被推广，另外，利用基因工程的方法制备重组蛋白，易 受宿主蛋白或密码子偏爱性影响；（4) RT-PCR或定量RT-PCR检测，与其它检测方法相比，该 方法具有特异性强、灵敏度高、准确性好的特点，在实验室诊断中应用广泛，但是RT-PCR技 术对仪器设施要求高，实验操作过程繁琐，对检测者有一定实验技能要求，因此难W在基层 推广。
[0004]反转录环介等溫扩增技术（reverse transcription loop-mediated isothermal amplification, RT-LAMP)是AMV反转录酶（分离自禽类成髓细胞瘤病毒中的一种反转录 酶）先将RNA反转录为DNA，再依靠BstDNA聚合酶在60-65°C进行DNA扩增的一种检测方 法，该方法特异性高、快速、操作简单。目前RT-LAMP定量的可能方法主要有利用浑浊度、巧 光染料和巧光探针S种，其中，最常用的巧光染料定量是根据SYBR Green I与双链DNA非 特异性结合，反应发出的全部巧光信号与双链DNA量呈比例，且会随扩增产物的增加而增 加，可W根据巧光信号检测出LAMP或RT-LAMP体系中存在的双链DNA数量，而目前尚无关 于DHAV-3的定量RT-LAMP检测方法的相关报导。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种3型鸭肝炎病毒的巧光定量RT-LAMP检测 试剂盒，该试剂盒既可W进行定性检测，也可W进行定量检测；本发明还提供了上述试剂盒 的应用及方法。
[0006] 本发明采取的技术方案如下：
[0007] 1、3型鸭肝炎病毒巧光定量RT-LAMP检测试剂盒，包括根据3型鸭肝炎病毒VP3 基因部分核巧酸序列（如SEQ ID No. 1所示）设计的一对外引物、一对内引物W及一对环 引物，所述外引物序列如SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3所示，内引物序列如SEQ ID No. 4和 沈Q ID No. 5所示，环引物序列如沈Q ID No. 6和沈Q ID No. 7所示。
[000引优选的，所述试剂盒还包括3型鸭肝炎病毒RNA阳性标准品、BstDNA聚合酶、 20 Xlliermo Pol Reaction Buffer、AMV 反转录酶、核酸酶抑制齐lj、dNTPs、甜菜碱、Mg2\SYBR Green I 和 DEPC &0。
[0009] 优选的，所述试剂盒中W下成分在反应体系中的终浓度为：BstDNA聚合酶0.4U/ yLAMV反转录酶0. 25U/yL核酸酶抑制剂0. 25U/yLdNTPs 0. 5yM，外引物各0. 25yM， 内引物各 2yM，环引物各 lyM，甜菜碱 0. 5M，Mg2+7. 5mM，SYBRGreen I IX 或 5X。
[0010] 优选的，所述试剂盒按反应体系体积为20 y L计，包括：8U/ y L的BstDNA聚合酶 1 y L，20 X lliermo Pol Reaction Buffer 2 y L，5U/ y L 的 AMV 反转录酶 1 y L，5U/ y L 的核 酸酶抑制剂1 y L 2. 5 y M的dNTPs 4 y L外引物的混合物0. 5 y L内引物的混合物4 y L 环引物的混合物 2 y L，4M 的甜菜碱 2. 5 y L，300mM 的 Mg2+0. 5 y L，20 X SYBR Green I 或 lOOXSYBR Green I lyL，80ng/yL阳性标准品RNA 0. 5化；所述外引物、内引物及环引物 中每个引物的浓度均为10 y M，相应引物混合的体积比为1:1。
[0011] 优选的，所述试剂盒W ct值为纵坐标，W 3型鸭肝炎病毒阳性标准品RNA模板拷 贝数的对数为横坐标，建立标准曲线进行定量检测。
[0012] 优选的，所述3型鸭肝炎病毒RNA阳性标准品的制备包括如下步骤：首先W含3 型鸭肝炎病毒的尿囊液抽提RNA，反转录合成cDNA，然后W外引物进行PCR扩增得到2Ubp 的目的片段，将目的片段进行回收，构建重组质粒PGEM-T/VP3,测序鉴定后通过体外转录将 DNA转录为RNA，琼脂糖凝胶电泳检测目的片段大小为29化P，核酸蛋白质检测仪测定RNA浓 度，将RNA模板依次10倍稀释得到阳性标准品。
[001引优选的，所述PCR扩增条件如下：94°C预变性4min ;94°C变性30s，60°C退火30s， 72°C延伸30s，共35个循环；72°C延伸lOmin。
[0014] 2、上述3型鸭肝炎病毒巧光定量RT-LAMP检测试剂盒在非疾病诊断中用于3型鸭 肝炎病毒的定性或定量检测。
[0015] 3、上述3型鸭肝炎病毒巧光定量RT-LAMP检测试剂盒在非疾病诊断中定量检测3 型鸭肝炎病毒的方法，先制备3型鸭肝炎病毒RNA阳性标准品，然后W阳性标准品RNA为模 板，加入引物和试剂，瞬时离屯、混匀，置于巧光定量PCR仪中61~65°C条件下反应50min， 每隔Imin收集一次巧光，设置50个循环，在80°C条件下反应2min后停止反应，通过构建标 准曲线对结果进行定量分析。
[0016] 优选的，巧光定量PCR仪中的反应溫度为64. 2°C。
[0017] 本发明的有益效果在于：本发明通过构建巧光定量RT-LAMP引物，获得了 DHAV-3 巧光定量RT-LAMP检测试剂盒。该试剂盒既能够用于DHAV-3的定性检测，也可W用于定 量检测。若用于定性检测，则根据反应体系是否变浑浊或瞬时离屯、观察白色沉淀即可判断 结果为阴性还是阳性，另外还可W在反应后加入高浓度SYBR Green I(IOOX)，根据自然光 或紫外灯下其颜色的变化对结果进行判断；若用于定量检测，则在反应体系中加入低浓度 SYBR Green I(20X)，通过巧光定量PCR仪收集巧光即可获得定量检测数据。该方法准确、 快速、简便，最低检测限达24拷贝数，更适用于基层推广应用。另外，从定量的结果来分析， 相对而言，本发明所建方法更适合于高浓度样本的定量检测。
【附图说明】
[0018] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
[0019] 图1 PCR扩增目的片段的琼脂糖凝胶电泳图，其中1-3泳道为PCR产物（条带大 小为 21 化P)，M 泳道为 DNA Marker 0L200 O);
[0020] 图2重组质粒的菌落PCR琼脂糖凝胶电泳图，其中1泳道为菌落PCR产物（条带 大小为 21 化P)，M 泳道为 DNA Marker 0L200 O);
[0021] 图3抽提质粒的琼脂糖凝胶电泳图，其中1泳道为质粒（质粒大小为3217bp，但因 质粒为环状，实际位置小于线性DNA Marker的对应位置），M泳道为DNA Marker值L15000);
[0022] 图4线性化质粒的琼脂糖凝胶电泳图，其中1泳道为质粒（质粒大小为3217bp， 但因质粒为环状，实际位置小于线性DM Marker的对应位置），2泳道为线性化质粒， 3泳道为纯化后的线性化质粒（2、3泳道线性化质粒的大小为3217bp)，M泳道为DNA Marker 0L15OOO);
[0023] 图5体外转录RNA的琼脂糖凝胶电泳图，其中1泳道为体外转录RNA，RNA大小 为29化P (从T7启动子一 2nbp目的片段一 Sail酶切位点共有29化P)，M泳道为RNA Marker(DL1000);
[0024] 图6不同溫度与相对巧光信号强度关系，其中，曲线1-5依次代表64. 2°C、63. 3°C、 61. rC、62. 0°C和65. 0°C下的巧光信号强度曲线；
[002引图7不同外引物F 3和B3浓度与相对巧光信号强度关系；W F3/B3浓度为10 iiM 计，1-5曲线依次为其加入量0. 5 y 1、0. 1 y 1、0. 9 y 1、0. 7 y 1和0. 3 y 1的对应浓度的巧光 信号强度曲线；
[0026] 图8不同内引物FIP和BIP浓度与相对巧光信号强度关系；W FIP/BIP浓度为 10 y M计，1-5曲线依次为其加入量4. 0 y 1、3. 0 y 1、3. 5 y 1、2. 0 y 1和2. 5 y 1的对应浓度 的巧光信号强度曲线；
[0027] 图9不同环引物LF和LB浓度与相对巧光信号强度关系；W LF/LB浓度为10 iiM 计，1-5曲线依次为其加入量2. 0 y 1、1. 0 y 1、1. 5 y 1、2. 5 y 1和0. 5 y 1的对应浓度的巧光 信号强度曲线；
[002引图10不同甜菜碱与相对巧光信号强度关系；W甜菜碱浓度为4M计，1-5曲线依次 为其加入量3. 0 y 1、2. 5 y 1、2. 0 y 1、1. 5 y 1和3. 5 y 1的对应浓度的巧光信号强度曲线；
[0029] 图11不同BstDNA聚合酶浓度与相对巧光信号强度关系；W BstDNA聚合酶浓度为 8U/ y 1计，1-5曲线依次为其加入量1. 0 y 1、0. 8 y 1、0. 4 y 1、0. 6 y 1和1. 2 y 1的对应浓度 的巧光信号强度曲线；
[0030] 图12不同儀离子浓度与相对巧光信号强度关系；WMgS〇4浓度为300mM计，1-5曲 线依次为其加