专利名称：一种防治鸭甲型病毒性肝炎变异株的卵黄抗体的制备方法
技术领域：
本发明涉及禽类用生物制品技术领域，尤其是一种防治鸭病毒性甲型肝炎变异株的卵黄抗体的制备方法。
背景技术：
鸭甲型病毒性肝炎(Duck virus hepatitis A, DHAV-A)是由鸭甲型肝炎病毒(DHAV)引起的一种雏鸭高度致死性、急性传染病。DHAV属小RNA病毒科，曾与鸭星状病毒(DAstV)统一命名为鸭肝炎病毒(DHV)，并分为I、II、III3个血清型，均属小RNA病毒科，后经鉴定，将DHV- 11、0狀-111归于星状病毒科，且更名为048丨￥-1、048^-2。DHAV-A主要侵害1-3周龄雏鸭，发病严重，传播迅速，雏鸭通常在出现症状后Ih内死亡，10日龄内的雏鸭感 染后死亡率可达90%以上。该病呈世界性分布，首次报道于1945年美国长岛，1954年在英国病鸭中分离到该病毒，德国、意大利、印度、法国、苏联等相继有本病的发生。我国1963年最早报道了该病在上海地区出现，之后北京、福建、浙江等多个地区爆发本病，流行区域广，给我国养鸭业造成了严重损失。鸭甲型病毒性肝炎变异株首先是由印度、埃及报道，此后美国在1992年发现了DHAV的变异株，并命名为I a型。近年来我国不断从病鸭中分离到鸭甲型病毒性肝炎变异株，使用现有的鸭病毒性肝炎疫苗、高免血清或高免卵黄抗体对变异株的治疗效果均不理想，变异株的出现给DHAV-A的防治带来了新的挑战。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，而提供一种稳定性好、治疗效果明显、特异性强、制备安全方便的防治鸭甲型病毒性肝炎变异株的卵黄抗体的制备方法。为实现本发明的目的所采用的技术方案是一种防治鸭病毒性甲型肝炎变异株的卵黄抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤I、制备鸭甲型病毒性肝炎变异株的高免鸡蛋(I)选择健康高产蛋鸡隔离饲养，加强饲料营养，同时加喂专用抗生素制剂以预防细菌感染；(2)制备变异株灭活苗A.制水相用冷冻保存的鸭甲型病毒性肝炎变异株毒种稀释后接种12日龄SPF鸭胚，24_72h后无菌采集死亡鸭胚尿囊液，然后对其进行灭活程序，取灭活后的尿囊液与无菌吐温-80进行混合后制成水相；B.制油相取白油、司本和硬脂酸铝，并将三种混合，搅拌均匀后，高压灭菌后制成油相；C.制备油乳剂灭活苗将上述步骤I- (2) -A所制得的水相和步骤I- (2) -B所制得的油相进行混匀即得;(3)免疫产蛋鸡，制备高免鸡蛋将步骤I- (2)所制备的变异株灭活苗免疫步骤I- (I)处理过的高产蛋鸡，进行免疫程序后收集鸡蛋，即为鸭甲型病毒性肝炎变异株的高免鸡蛋；2、利用步骤I制备的鸭甲型病毒性肝炎变异株的高免鸡蛋制备卵黄抗体(I)分离高免鸡蛋蛋黄将步骤I制备的高免鸡蛋进行消毒程序，然后送入蛋清蛋黄分离机进行蛋黄分离；(2)提取卵黄抗体将步骤2- (I)所分离的蛋黄用TBS作为缓冲液，将卵黄液稀释4倍后，加入35%的聚乙二醇6000，沉淀脂类，卵黄囊抗体保留在上清液中；再将40%甲醛溶液与该上清液混合，使甲醛的终浓度达到O. 1% (V/V)，对其进行过滤操作后，取滤液4°C保存备用； (3)配制、保存将步骤2- (2)所得滤液进行鸭甲型病毒性肝炎变异株抗体效价测定，用O. 01M、PH7. 2的无菌PBS稀释至中和抗体效价为1:512 ;然后加入终浓度为O. 01%(V/V)的吐温80作为稳定剂，搅拌均匀后进行无菌定量分装。上述鸭甲型病毒性肝炎变异株毒种为I a型。上述步骤1_(2)_A中的灭活程序是指对尿囊液用O. 1%的甲醛37°C密封灭活48h。上述步骤I- (2) -A中尿囊液与无菌吐温-80的混合比例为30:1 (W/W)。上述步骤I- (2)-B中白油、司本和硬脂酸铝的混合比例为94:4:2 (W/W/W)。上述步骤I- (2) -C中水相和油相的混合体积比例为1:2。上述步骤I- (3)中的免疫程序是对免疫产蛋鸡进行肌肉注射，剂量为2ml/只，免疫次数为3次，第I次与第2次间隔10天，第2次与第3次间隔14天，3次免疫后正常饲喂一周。上述步骤2- (I)中的消毒程序是对高免鸡蛋用自来水冲洗干净，再用O. 05%的百毒杀浸泡3-5min，然后用纱布擦干，用75%乙醇擦一遍晾干。上述步骤2- (2)中的过滤操作是先充分搅拌均匀后密封60min，再用O. 22 μ m的微孔滤膜过滤。与现有技术相比，本发明的有益效果是(I)本发明制备的鸭甲型病毒性肝炎变异株卵黄抗体能针对鸭甲型病毒性肝炎变异株进行有效的防治，解决现有疫苗及血清抗体、卵黄抗体对变异株治疗无效的困境；(2)同时本发明采用聚乙二醇(PEG)法提取鸭甲型病毒性肝炎变异株卵黄抗体，该法安全、价格低廉，适于大规模生产，且制备的卵黄抗体纯度高、效价高、性质稳定、易于保存。
具体实施例方式以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。一种防治鸭病毒性甲型肝炎变异株的卵黄抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤I、制备鸭甲型病毒性肝炎变异株的高免鸡蛋(I)选择健康高产蛋鸡隔离饲养，加强饲料营养，同时加喂专用抗生素制剂以预防细菌感染；(2)制备变异株灭活苗A.制水相用冷冻保存的鸭甲型病毒性肝炎变异株毒种稀释后接种12日龄SPF鸭胚，24_72h后无菌采集死亡鸭胚尿囊液，然后对其进行灭活程序，取灭活后的尿囊液与无菌吐温-80 进行混合后制成水相；B.制油相取白油、司本和硬脂酸铝，并将三种混合，搅拌均匀后，高压灭菌后制成油相；C.制备油乳剂灭活苗将上述步骤I- (2) -A所制得的水相和步骤I- (2) -B所制得的油相进行混匀即得;(3)免疫产蛋鸡，制备高免鸡蛋将步骤I- (2)所制备的变异株灭活苗免疫步骤I- (I)处理过的高产蛋鸡，进行免疫程序后收集鸡蛋，即为鸭甲型病毒性肝炎变异株的高免鸡蛋；2、利用步骤I制备的鸭甲型病毒性肝炎变异株的高免鸡蛋制备卵黄抗体( I)分离高免鸡蛋蛋黄将步骤I制备的高免鸡蛋进行消毒程序，然后送入蛋清蛋黄分离机进行蛋黄分离；(2)提取卵黄抗体将步骤2- (I)所分离的蛋黄用TBS作为缓冲液，将卵黄液稀释4倍后，加入35%的聚乙二醇6000，沉淀脂类，卵黄囊抗体保留在上清液中；再将40%甲醛溶液与该上清液混合，使甲醛的终浓度达到O. 1% (V/V)，对其进行过滤操作后，取滤液4°C保存备用；(3)配制、保存将步骤2- (2)所得滤液进行鸭甲型病毒性肝炎变异株抗体效价测定，用O. 01M、PH7. 2的无菌PBS稀释至中和抗体效价为1:512 ;然后加入终浓度为O. 01%(V/V)的吐温80作为稳定剂，搅拌均匀后进行无菌定量分装。上述鸭甲型病毒性肝炎变异株毒种为I a型。上述步骤1_(2)_A中的灭活程序是指对尿囊液用O. 1%的甲醛37°C密封灭活48h。上述步骤I- (2) -A中尿囊液与无菌吐温-80的混合比例为30:1 (W/W)。上述步骤I- (2)-B中白油、司本和硬脂酸铝的混合比例为94:4:2 (W/W/W)。上述步骤I- (2) -C中水相和油相的混合体积比例为1:2。上述步骤I- (3)中的免疫程序是对免疫产蛋鸡进行肌肉注射，剂量为2ml/只，免疫次数为3次，第I次与第2次间隔10天，第2次与第3次间隔14天，3次免疫后正常饲喂一周。上述步骤2- (I)中的消毒程序是对高免鸡蛋用自来水冲洗干净，再用O. 05%的百毒杀浸泡3-5min，然后用纱布擦干，用75%乙醇擦一遍晾干。
上述步骤2-(2)中的过滤操作是先充分搅拌均匀后密封60min，再用O. 22 μ m的微孔滤膜过滤。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于 本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1. 一种防治鸭病毒性甲型肝炎变异株的卵黄抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤 1、制备鸭甲型病毒性肝炎变异株的高免鸡蛋 (1)选择健康高产蛋鸡隔离饲养，加强饲料营养，同时加喂专用抗生素制剂以预防细菌感染； (2)制备变异株灭活苗 A.制水相 用冷冻保存的鸭甲型病毒性肝炎变异株毒种稀释后接种12日龄SPF鸭胚，24-72h后无菌采集死亡鸭胚尿囊液，然后对其进行灭活程序，取灭活后的尿囊液与无菌吐温-80进行混合后制成水相； B.制油相 取白油、司本和硬脂酸铝，并将三种混合，搅拌均匀后，高压灭菌后制成油相； C.制备油乳剂灭活苗 将上述步骤I- (2)-A所制得的水相和步骤I- (2)-B所制得的油相进行混匀即得； (3)免疫产蛋鸡，制备高免鸡蛋 将步骤I- (2)所制备的变异株灭活苗免疫步骤I- (I)处理过的高产蛋鸡，进行免疫程序后收集鸡蛋，即为鸭甲型病毒性肝炎变异株的高免鸡蛋； 2、利用步骤I制备的鸭甲型病毒性肝炎变异株的高免鸡蛋制备卵黄抗体 (1)分离高免鸡蛋蛋黄 将步骤I制备的高免鸡蛋进行消毒程序，然后送入蛋清蛋黄分离机进行蛋黄分离； (2)提取卵黄抗体 将步骤2- (I)所分离的蛋黄用TBS作为缓冲液，将卵黄液稀释4倍后，加入35%的聚乙二醇6000，沉淀脂类，卵黄囊抗体保留在上清液中；再将40%甲醛溶液与该上清液混合，使甲醛的终浓度达到O. 1% (V/V)，对其进行过滤操作后，取滤液4°C保存备用； (3)配制、保存 将步骤2- (2)所得滤液进行鸭甲型病毒性肝炎变异株抗体效价测定，用O. 01M、pH7. 2的无菌PBS稀释至中和抗体效价为1:512 ;然后加入终浓度为O. 01% (V/V)的吐温80作为稳定剂，搅拌均匀后进行无菌定量分装。
2.根据权利要求I所述的一种防治鸭病毒性甲型肝炎变异株的卵黄抗体的制备方法，其特征在于所述鸭甲型病毒性肝炎变异株毒种为I a型。
3.根据权利要求I所述的一种防治鸭病毒性甲型肝炎变异株的卵黄抗体的制备方法，其特征在于所述步骤I- (2) -A中的灭活程序是指对尿囊液用O. 1%的甲醛37°C密封灭活48h。
4.根据权利要求I所述的一种防治鸭病毒性甲型肝炎变异株的卵黄抗体的制备方法，其特征在于所述步骤I- (2) -A中尿囊液与无菌吐温-80的混合比例为30:1 (W/W)。
5.根据权利要求I所述的一种防治鸭病毒性甲型肝炎变异株的卵黄抗体的制备方法，其特征在于所述步骤I- (2)-B中白油、司本和硬脂酸铝的混合比例为94:4:2 (W/W/W)。
6.根据权利要求I所述的一种防治鸭病毒性甲型肝炎变异株的卵黄抗体的制备方法，其特征在于所述步骤I- (2)-C中水相和油相的混合体积比例为1:2。
7.根据权利要求I所述的一种防治鸭病毒性甲型肝炎变异株的卵黄抗体的制备方法，其特征在于所述步骤I- (3)中的免疫程序是对免疫产蛋鸡进行肌肉注射，剂量为2ml/只，免疫次数为3次，第I次与第2次间隔10天，第2次与第3次间隔14天，3次免疫后正常饲喂一周O
8.根据权利要求I所述的一种防治鸭病毒性甲型肝炎变异株的卵黄抗体的制备方法，其特征在于所述步骤2- (I)中的消毒程序是对高免鸡蛋用自来水冲洗干净，再用O. 05%的百毒杀浸泡3-5min，然后用纱布擦干，用75%乙醇擦一遍晾干。
9.根据权利要求I所述的一种防治鸭病毒性甲型肝炎变异株的卵黄抗体的制备方法，其特征在于所述步骤2- (2)中的过滤操作是先充分搅拌均匀后密封60min，再用O. 22 μ m的微孔滤膜过滤。
全文摘要
本发明公开了一种防治鸭病毒性甲型肝炎变异株的卵黄抗体的制备方法，先制备鸭甲型病毒性肝炎变异株的高免鸡蛋，然后利用步骤1制备的鸭甲型病毒性肝炎变异株的高免鸡蛋制备卵黄抗体，本发明制备的鸭甲型病毒性肝炎变异株卵黄抗体能针对鸭甲型病毒性肝炎变异株进行有效的防治，解决现有疫苗及血清抗体、卵黄抗体对变异株治疗无效的困境；同时本发明采用聚乙二醇(PEG)法提取鸭甲型病毒性肝炎变异株卵黄抗体，该法安全、价格低廉，适于大规模生产，且制备的卵黄抗体纯度高、效价高、性质稳定、易于保存。
文档编号C07K16/02GK102875672SQ201210375380
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月29日 优先权日2012年9月29日
发明者焦伟丽, 程雪娇, 高锐, 于贵菊 申请人:天津市中升挑战生物工程有限公司