一种抗鸭病毒性肝炎山豆根多糖及其分子修饰物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种抗鸭病毒性肝炎山豆根多糖及其分子修饰物，属于中兽药制备【技术领域】。提取了山豆根多糖不同醇沉部分，经反复临床试验筛选出抗鸭病毒性肝炎(DVH)活性部位，再用正交法确定氯磺酸-吡啶硫酸化修饰山豆根多糖活性部位的最佳条件为：反应温度95℃，反应时间2h，氯磺酸-吡啶配比1∶5，经红外光谱分析所得产物为山豆根多糖硫酸酯，其总糖含量达83.77％，硫酸根含量达39.33％，产物得率达117.33％。山豆根多糖硫酸酯抗DHV-1感染鸭胚肝细胞作用和对DVH的疗效显著强于山豆根多糖。本发明所获得的抗DVH山豆根多糖活性部位硫酸酯具有较高的糖和磷酸根含量，及较高产物得率，对DVH有良好疗效。
【专利说明】—种抗鸭病毒性肝炎山豆根多糖及其分子修饰物
一、【技术领域】
[0001]本发明涉及一种抗鸭病毒性肝炎山豆根多糖及其分子修饰物，属于中兽药制备【技术领域】。
二、【背景技术】
[0002]鸭病毒性肝炎是鸭肝炎病毒(DHV)感染引起的一种传播迅速、高发病率、高致死性疫病。1949年首次分离到该病毒，目前已呈全世界范围分布。DHV主要存在DHV-1及其变异株、Duck Astrovirus以及DHV-3三个血清型，其中DHV-1型毒性最强、分布最广，主要侵染3周龄以内的雏鸭，病死率高于80 %，甚至可高达100 %，是严重危害养鸭业主要病原
之一
[0003]目前，世界范围内临床上还没有有效的抗DHV-1药物，主要通过对种鸭或雏鸭注射弱毒苗进行免疫防御。临床病例一旦出现,即造成难以挽回的损失。1958年Gerber等首先发现海藻多糖具有抗病毒作用，此后多种多糖及硫酸化多糖的抗病毒作用陆续被报道。近年来，本实验室也发现了黄芪、香菇、当归等多种中药多糖能显著抵抗新城疫、传染性法氏囊病等病毒的感染。中药化合物结构修饰是提高其水溶性和生物活性的主要手段之一。许多学者发现，中药多糖成分、皂苷等成分硫酸化或磷酸化修饰后，使其成酯化物，其水溶性普遍增加，免疫药理作用明显增强。
[0004]山豆根是一种经典的清热解毒用中药。现代药理学研究表明，山豆根多糖是其主要有效成分之一，具有良好的抗氧化作用。虽然有学者发现，经过硫酸化修饰的硫酸化山豆根多糖在体外对肝炎病毒表现出良好的抑制作用。但由于不同的药物对同一种病毒的作用并不一致，同一种药物对不同的病毒也表现出不同的作用。我们发现，按照不同的条件修饰中药多糖所获得的多糖成分修饰物也有所不同，其作用大相径庭。为研究有效的抗鸭病毒性肝炎药物，我们根据前期的预试验，将分离获得并经在体试验验证有效的山豆根多糖采用氯磺酸吡啶法进行了修饰，并采用正交试验比较优化了其制备工艺，以进一步提高其生物活性和生物利用率。
[0005]本发明首次将山豆根多糖抗鸭病毒性肝炎有效部位进行硫酸化分子修饰，并采用正交法优化了抗鸭病毒性肝炎山豆根多糖活性部位硫酸化分子修饰条件，发现硫酸化分子修饰能显著增加山豆根多糖抗鸭病毒性肝炎效果，提高其生物利用度，并获得较高的产物得率。
三、
【发明内容】
[0006]技术问题本发明针对世界范围内临床上还没有有效的抗鸭病毒性肝炎药物问题，提供一种山豆根多糖抗鸭病毒性肝炎有效部位的硫酸化分子修饰方法，所获得的山豆根多糖硫酸酯(SBSRPS65)总糖含量达83.77%，硫酸根含量为39.33%，产物得率达117.33%,且对鸭病毒性肝炎的治疗作用明显提高，可望最终应用于鸭病毒性肝炎的临床防治。
[0007]技术方案[0008]采用水煎醇沉法，收集不同醇沉部位山豆根多糖，经数次临床试验发现山豆根多糖乙醇浓度65%醇沉部分(BSRPS65)对鸭病毒性肝炎有较理想的治疗效果，再用正交试验法对BSRPS65的硫酸化分子修饰方法进行优化。经优化后的山豆根多糖抗鸭病毒性肝炎有效部位的硫酸化分子修饰方法为:将带有搅拌装置的三颈烧瓶置于冰中，加入无水吡啶20mL，剧烈搅拌，使之充分冷却，按氯磺酸-吡啶的配比为1: 5的比例将氯磺酸逐滴缓慢加入，冷却后于65~95°C水浴锅上融化成淡黄色液体。精密称取抗鸭病毒性肝炎山豆根多糖活性部位(BSRPS65) 300mg，加入酯化试剂，95°C反应2h。反应结束后立即加入IOOmL冰水，用饱和氢氧化钠溶液(20.0mol / L)调pH至7后放入透析袋中,用自来水流水透析2d、蒸馏水流水透析ld，将透析袋中的硫酸化多糖浓缩并冷冻干燥后得硫酸化山豆根多糖。经Nicolet FT-1R200型傅立叶变换红外光谱仪分析为山豆根多糖硫酸酯(SBSRPS65)。按此方法制备的山豆根多糖硫酸酯总糖含量达83.77%，硫酸根含量为39.33%，产物得率达117.33%，入水即溶。对体外培养的鸭胚肝细胞的毒性显著降低。
[0009]有益效果
[0010]病毒性疾病已经成为目前人类和动物健康的最大威胁之一，并造成了巨大的社会经济损失。近年来肆虐人类的禽流感、甲流、艾滋病、非典、流感、肠道病毒EV71型等等，肆虐动物的禽流感、新城疫、蓝耳病、圆环病毒2型、伪狂犬病、细小病毒病、鸭病毒性肝炎等等，都使人类和动物生命健康遭受了严重的威胁。病毒性疾病肆虐人畜的一个重要原因是人类对于这些烈性病毒目前尚没有临床特效的药物。曾今的抗流感病毒特效药“达菲”现在对H5N1、H7N9却不再那么有效。虽然三氮唑核苷、盐酸金刚乙胺、无环鸟苷等抗病毒药对病毒病也有一定的临床疗效，但是其引起的恶心、精神紊乱、腹泻、肝肾功能损伤、眩晕等等不良反应和药物残留，这些医源性、药源性疾病的不断增加使得人们开始拒绝这些抗病毒西药，转而选择毒副作用小的中草药，目前已有40%以上的消费者选择了中药或中西结合治疗。而在养殖业中，病毒性疾病仍然是目前养禽业危害最大的疫病之一，随着金刚烷胺、利巴韦林等抗病毒西药的全面被禁用，动物药品市场上治疗动物病毒病的西药出现了空档。由于世界范围内临床上尚还没有有效的抗DHV-1药物，主要通过对种鸭或雏鸭注射弱毒苗进行免疫防御。临床病例一旦出现3周龄以内的感染雏鸭，其病死率往往高于80%，甚至可高达100%，造成的损失难以估量。
[0011]山豆根多糖是山豆根的主要药效成分之一，具有良好的抗病毒、抗氧化等作用，对肝炎病毒体外感染肝细胞有良好的抑制作用。兽医临床试验也发现，山豆根对鸭病毒性肝炎有一定的疗效。为研制有效的抗鸭病毒性肝炎治疗用药，并提高其生物利用度，本发明采用氯磺酸-吡啶法硫酸化分子修饰山豆根多糖抗鸭病毒性肝炎有效部位，所形成的山豆根多糖硫酸酯不仅硫酸根和糖含量高，产物得率亦很高，临床试验发现其对鸭病毒性肝炎的疗效明显增强，且水溶性良好，制剂使用更为方便。
[0012]与现有技术相比，本发明优点如下:
[0013]1.山豆根多糖硫酸化分子修饰的方法国内虽有报道[张玉，蒋小丰，张名洋，等.山豆根 多糖硫酸化修饰及体外抗HBV活性测定[J].中国临床药学杂志，2011，20(3):151-154]，但该文并没有对最佳修饰条件进行优化，其反应条件与本发明提供的条件大相径庭，且其提供的山豆根多糖为75%乙醇醇沉部位，虽对乙肝病毒感染体外培养的2215细胞有一定的抑制作用，但经临床试验验证，对鸭病毒性肝炎的临床疗效并不理想。而本发明提供了优化的山豆根多糖硫酸化分子修饰条件，且本发明所用山豆根多糖为抗鸭病毒性肝炎有效部位(BSRPS65),目前国内外尚未见相似研究。
[0014]2.通过本发明实施所获得的山豆根多糖硫酸酯糖含量达83.77%，硫酸根含量为39.33 %，产物得率达117.33 %，而且具有良好的水溶性，入水即溶，制剂使用方便。
[0015]3.通过本发明实施所获得的山豆根多糖硫酸酯不仅对鸭肝炎病毒DHV-1感染体外培养的鸭胚肝细胞作用显著优于未修饰山豆根多糖(BSRPS65)，且对DHV-1攻毒感染鸭的治疗作用也优于未修饰的山豆根多糖(BSRPS65)。
四、【具体实施方式】
[0016]1.山豆根多糖的提取及有效部位筛选
[0017]称取1000g山豆根，加10倍量水浸泡3h，加热煮沸lh，收集煎煮液，反复3次；合并收集的煎煮液，煮沸浓缩至1000mL,用高速离心机离心，取上清。缓慢向浓缩液中加入不同体积分数为95 %的乙醇，使溶液中乙醇含量分别为50 %、65 %、75 %、80 %，静置过夜，分别离心收集沉淀。经流水透析后，真空浓缩，3000rpm / min,离心20min,上清再次加入不同体积分数95%乙醇沉淀，重复透析、浓缩、离心后，60°C真空干燥，碾碎，分别得到山豆根多糖不同醇沉部位 BSRPS5Q、BSRPS65, BSRPS75, BSRPS80 和总多糖 BSRPSt。
[0018]3日龄非免樱桃谷鸭随机均分7组，每组31羽，分别为空白对照组、攻毒对照组和5个不同醇沉部位山豆根多糖组。除空白对照组外，其余6组鸭分别肌肉注射鸭肝炎病毒DHV-10.2mL /羽后，Ih后各多糖组分别于饮水中添加多糖饮喂,5mg /羽.天,连续3天,每天观察记录各组鸭死亡情况 ，死亡鸭及时逐只剖检观察病变，剔除无病变雏鸭，待全群鸭停止死亡时，统计各组存活率。结果发现，山豆根多糖不同醇沉部位BSRPS5tl、BSRPS65、BSRPS75、BSRPS80和总多糖BSRPSt及攻毒对照组各组存活率依次为16.13 %、35.48 %、22.58 %、16.13%、19.35%和0%。其中65%醇沉部位BSRPS65的存活率显著高于攻毒对照组，并远高于其他醇沉部位。
[0019]2.山豆根多糖硫酸化分子修饰及条件优化
[0020]采用氯磺酸-吡啶法硫酸化分子修饰山豆根多糖(BSRPS65)。根据单因素预试验结果，反应温度、试剂比例，反应时间对多糖硫酸化修饰的影响较大，采用正交试验设计方法，选取反应温度(A)、氯磺酸与吡啶的配比(B)和反应时间(C)为因素，确定三个水平，按照正交表L9 (34)(表1)设计正交试验。
[0021]将带有搅拌装置的三颈烧瓶置于冰中，加入无水吡啶20mL，剧烈搅拌，使之充分冷却，按表1氯磺酸-吡啶的配比将氯磺酸逐滴缓慢加入，冷却后于65~95°C水浴锅上融化成淡黄色液体。称取抗鸭病毒性肝炎山豆根多糖活性部位(BSRPS65) 300mg，加入酯化试剂，按表1设计的反应温度和反应时间分别在恒温水浴振荡器上反应。反应结束后立即加入IOOmL冰水,用饱和氢氧化钠溶液(20.0mol / L)调pH至7后放入透析袋中,用自来水流水透析2d、蒸馏水流水透析ld，将透析袋中的硫酸化多糖浓缩并冷冻干燥后得硫酸化山豆根多糖。
[0022]表1因素和水平
[0023]
【权利要求】
1.一种抗鸭病毒性肝炎山豆根多糖硫酸化分子修饰方法，采用氯磺酸-吡啶法硫酸化分子修饰山S?根多糖。 (1)采用水煎醇沉法，收集不同醇沉部位山豆根多糖，以其添加于饮水中治疗鸭肝炎病毒DHV-1攻毒鸭，数次临床试验发现山豆根多糖酒精浓度65%醇沉部分(BSRPS65)对鸭病毒性肝炎有较理想的治疗效果。 (2)将带有搅拌装置的三颈烧瓶置于冰中，加入无水吡啶20mL，剧烈搅拌，使之充分冷却，按氯磺酸-吡啶的配比将氯磺酸逐滴缓慢加入，冷却后于65~95°C水浴锅上融化成淡黄色液体。称取抗鸭病毒性肝炎山豆根多糖活性部位(BSRPS65) 300mg，加入酯化试剂，在一定温度下反应适当时间。反应结束后立即加入IOOmL冰水,用饱和氢氧化钠溶液(20.0mol.L—1)调pH至7后放入透析袋中，用自来水流水透析2d、蒸馏水流水透析ld，将透析袋中的硫酸化多糖浓缩并冷冻干燥后得硫酸化山豆根多糖。 (3)上述方法硫酸化分子修饰山豆根多糖的条件为:反应温度65°C~95°C、反应时间I~3h、氯磺酸-吡啶的配比为1: 5~9。 (4)按照上述方法硫酸化分子修饰山豆根多糖的最佳条件为:反应温度95°C、反应时间2h、氯磺酸-吡啶的配比为1: 5。 (5)在最佳条件下硫酸化分子修饰山豆根多糖，其产物中山豆根多糖硫酸酯总糖含量为83.77%，硫酸根含量为39.33%，产物得率为117.33%。 (6)在最佳条件下硫酸化分子修饰山豆根多糖，其产物的红外光谱图基本形状与修饰前一致，未发生根本性改变，均具有多糖特征吸收峰，除多糖母体特征峰得到保留之外，在1248CHT1处出现的吸收峰是由不对称S=O伸缩振动引起的，在8 McnT1处左右出现了 C-O-SO3相关的对称性C-O-S吸收峰，表明本法中硫酸化分子修饰山豆根多糖产物为山豆根多糖硫酸酯。 (7)在最佳条件下制备的山豆根多糖硫酸酯对鸭肝炎病毒DHV-1感染体外培养的鸭胚肝细胞具有良好的抑制作用，且优于未修饰的山豆根多糖。 (8)在最佳条件下制备的山豆根多糖硫酸酯对鸭肝炎病毒DHV-1攻毒感染引起的鸭病毒性肝炎具有良好的治疗作用，其作用优于未修饰的山豆根多糖。 (9)在山豆根多糖(BSRPS65)及其硫酸酯治疗鸭病毒性肝炎的治疗剂量分别为4mg/羽和2mg /羽，添加于饮水中，连用3天。
2.权利要求1所述方法获得的山豆根多糖硫酸酯能够明显提高山豆根多糖抗鸭病毒性肝炎活性部位(BSRPS65)的抗病效果，并具有较高的糖和磷酸根含量高以及产物得率。
【文档编号】C08B37/00GK103739733SQ201410009323
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2014年1月9日 优先权日:2014年1月9日
【发明者】刘家国, 陈云, 熊文, 曾玲, 徐美云, 王德云, 胡元亮, 武毅, 黄兵, 马秀丽 申请人:南京农业大学