可溶性i型鸭肝炎病毒3d蛋白在制备elisa试剂中的应用及其elisa试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了可溶性I型鸭肝炎病毒3D蛋白在制备ELISA试剂中的应用及其ELISA试剂盒，ELISA试剂盒含有可溶性I型鸭肝炎病毒3D蛋白包被的反应板、酶标抗体、显色液和终止液，将该试剂盒用于检测I型鸭病毒性肝炎抗体具有特异性强、重现性好、敏感度高，与用全病毒作包被抗原的ELISA试剂盒检测的符合率高，可用于临床样品的检测。
【专利说明】可溶性I型鸭肝炎病毒3D蛋白在制备EL ISA试剂中的应用 及其ELISA试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化学领域，具体涉及可溶性I型鸭肝炎病毒3D蛋白在制备ELISA 试剂中的应用和检测I型鸭病毒性肝炎血清抗体的ELISA试剂盒。
【背景技术】
[0002] 我国是世界上养鸭数量最多的国家，鸭的饲养量约占世界的70%，养鸭业在我国 农业经济中占有重要地位。鸭肝炎病毒（Duck Η印atitis Virus，DHV)可引起雏鸭的鸭病 毒性肝炎（Duck Viral Η印atitis，DVH)。DVH是一种高度致死性传染病，以发病急、病程 短、发病率和死亡率高为特点。
[0003] 鸭肝炎病毒属于小RNA病毒科（Picornaviridae)禽肝炎病毒属 (Avih印atovirus)，本病毒有三个血清型，分别为DHAV-UDHAV-2和DHAV-3,无免疫交叉反 应。在我国，主要流行1型鸭病毒性肝炎，给我国养鸭业造成了巨大的经济损失，威胁着养 鸭业的健康发展。因此对DHAV等鸭源病毒进行研究具有重要的社会和经济意义。
[0004] 对鸭肝炎及鸭肝炎病毒进行研究，离不开鸭肝炎病毒及其抗体的检测试剂及检测 方法。可用于DHV及其抗体检测的试剂及方法虽很多，如血凝实验、协同凝集实验、中和实 验、琼脂扩散、ELISA、荧光抗体、免疫组化、胶体金等。而目前最常用且可靠的方法仍是中和 试验，但因其操作复杂、费时、成本高，不能用于快速检测因而不适于基层推广应用。ELISA 法具有操作简便快速、特异性强、敏感性高、重复性好等优点。早在1991年，Zhao等运用中 和实验、琼脂扩散试验、ELISA法对DHV抗体进行检测，阳性检出率分别为18. 8%、68. 8%和 68. 8% ;杨萍萍等以氯仿去脂、0. 22 μ m孔径滤膜过滤、凝胶柱浓缩层析方法纯化得到的病 毒作为包被抗原，也建立了检测DHV血清抗体的间接ELISA方法。但该方法在具体使用中 受到限制，一致未能推广，其主要原因之一是检测DHV血清抗体的间接ELISA方法对抗原纯 度要求很高，但由于病毒必须依靠宿主细胞才能增殖，因此进行全病毒抗原纯化时难于与 宿主蛋白分离。
[0005] 随着对DHAV-1分子生物学研究的不断深入，将重组表达蛋白（特别是大肠杆菌原 核表达蛋白）抗原运用到鸭肝炎病毒抗体的检测中成为可能。大肠杆菌表达的重组蛋白抗 原易于制备和纯化，且表达重组蛋白抗原的宿主细胞大肠杆菌比制备DHV抗原的宿主细胞 (如鸭胚及鸭源细胞、鸡胚等）与DHV的宿主（鸭）亲缘关系更远，检测时由于抗原纯度而 产生非特异性的可能性也减少。但重组表达的蛋白抗原运用到鸭肝炎病毒抗体的检测还有 一个困难，就是大肠杆菌表达易形成不溶性的包涵体，包涵体由于杂蛋白含量较低、可避免 蛋白酶降解、难溶于水等特点而使其易于分离纯化。包涵体中的目标蛋白虽然其肽链是完 整的，但却是非天然形式、无生物学活性的表达蛋白，包涵体的溶解非常困难，需要用强变 性剂高浓度尿素、SDS等来打断分子内和分子间的非共价键、离子键等，为获得有活性的蛋 白，继而需要进行蛋白复性，而包涵体蛋白溶解后的复性不仅费时、费力，且复性率低。
[0006] DHAV具有微RNA病毒科成员相似的特点，为单股正链RNA，完整基因组长度约为 7. 7kb，由5'非翻译区、一个大的开放阅读框（ORF)、3'非翻译区组成，ORF含有6750nt，编 码2249AA的多聚蛋白，随后被病毒编码的蛋白酶切割，首先分解成PI、P2和P3产物，然后 PI、P2和P3(P1编码结构蛋白、P2和P3编码非结构蛋白）又进一步分别分解为VP0/VP1/ VP3、2A1/2A2/2A3/2B/2C和3A/3B/3C/3D蛋白，产生12个成熟的病毒蛋白。3D是DHAV的 一种非结构蛋白，虽然不是病毒粒子的组成成分，但在病毒生命循环中扮演着重要角色，在 合成负链RNA、合成复制酶过程中占有主导的作用，加之其本身的酶催化活性，使得3D蛋白 在病毒的生存过程中必不可少，因此，在病毒感染机体内可能产生3D抗体，但目前未见3D 蛋白是否可以作为抗原检测DHAV抗体的ELISA方法报道；同时，获得高纯度有活性的抗原 并应用于制备ELISA检测试剂盒，对于鸭病毒性肝炎抗体的检测的有重要的意义和推动作 用。
【发明内容】
[0007] 有鉴于此，本发明的目的之一在于提供可溶性I型鸭肝炎病毒3D蛋白在制备检测 I型鸭病毒性肝炎抗体ELISA试剂中的应用；本发明的目的之二在于提供检测I型鸭病毒 性肝炎抗体ELISA试剂盒。
[0008] 为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
[0009] 1、可溶性I型鸭肝炎病毒3D蛋白在制备检测I型鸭病毒性肝炎抗体的ELISA试 剂中的应用，所述可溶性蛋白的制备步骤如下：将SEQ ID N0. 3所示序列的第9?1376 位核苷酸连接于pET-32 (a) +载体的多克隆酶切位点处，然后以大肠杆菌Rosetta、BL21 或BL21 (DE3)PLYS为宿主菌，在Amp抗性的LB培养基中活化后，在IPTG终浓度为0. 2? 1. Ommol/L、温度为20?39°C条件下诱导表达4?12小时，收集菌液，离心后收集菌体，将 收集的菌体用20mmol/L、pH为8. 0的Tris-HCl悬浮，然后在冰浴下超声，破碎后进行离心， 上清用Ni2+-NTA琼脂糖凝胶柱纯化，透析，超滤得可溶性I型鸭肝炎病毒3D蛋白。
[0010] 优选的，所述宿主菌为大肠杆菌BL21 (DE3) PLYS。
[0011] 优选的，所述诱导表达为加入IPTG至终浓度为0. 8mmol/L，在温度为25°C条件下 诱导表达6小时。
[0012] 优选的，所述活化的具体步骤为：将表达菌株接种于Amp抗性的LB培养基中，在 37°C、120r/min条件下过夜培养，然后将培养液与Amp抗性的LB培养基按体积比为1 :100 扩大培养至〇D6(?为0. 6即可。
[0013] 更优选的，所述冰浴下超声为在冰浴条件下超声破碎6次，3〇SeC/次，每次间隔 30sec〇
[0014] 2、检测I型鸭病毒性肝炎抗体的ELISA试剂盒，所述试剂盒含有可溶性I型鸭肝 炎病毒3D蛋白包被的反应板。
[0015] 优选的，所述反应板的制备方法为将1 μ g/mL的可溶性I型鸭肝炎病毒3D蛋白按 每孔100 μ L加入反应板中，4°C过夜包被，次日PBST洗板5次，拍干即可。
[0016] 优选的，所述试剂盒还含有酶标抗体、显色液和终止液。
[0017] 更优选的，所述酶标抗体为HRP标记羊抗鸭IgG或HRP标记兔抗鸭IgG，所述显色 液为TMB，所述终止液为浓度为2mol/L的H 2S04。
[0018] 本发明的有益效果在于：本发明公开了可溶性I型鸭肝炎病毒3D蛋白在制备检测 I型鸭病毒性肝炎抗体ELISA试剂中的应用，且将其构建为检测试剂盒，获得的试剂盒具有 特异性强、重现性好、敏感度高，与用全病毒作包被抗原的ELISA试剂盒检测的符合率高， 对I型鸭病毒性肝炎的诊断具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
[0020] 图1为I型鸭肝炎病毒株DHAV-H的3D基因 PCR扩增产物电泳结果（M :DL 2000Marker，1 :3D 基因 PCR 扩增产物）。
[0021] 图2为I型鸭肝炎病毒株DHAV-H的3D基因载体构建过程中PCR鉴定和酶切 鉴定结果（A :pJET-l. 2+/DHAV-H-3D 质粒 PCR 鉴定，M :DL2000Marker，1 :PCR 产物；B : pJET-1. 2+/DHAV-H-3D 质粒酶切鉴定，M :DL15000Marker，1 :Kpn I /Xho I 双酶切条带，2 : Xho I 单酶切条带；C :pET-32(a)+/DHAV-H-3D 质粒的 PCR 鉴定，M :DL2000Marker，1 :PCR产 物；D :pET32a+/DHAV-H-3D质粒的酶切鉴定，1 :Kpn I /Xho I双酶切结果，2 :Xho I单酶 切条带）。
[0022] 图3为可溶性3D蛋白表达条件的优化（Μ为低分子量蛋白质标准品；A:表达菌 的筛选，1为pET-32 (a) +空载体表达产物，2-4分别为pET-32 (a) +/DHAV-H-3D重组质粒转 化Rosetta、BL21和BL21 (DE3)PLYS三种不同表达宿主菌的表达产物；B :诱导表达时间的 优化，1-5依次为诱导12h、10h、8h、6h和4h的BL21 (DE3) PLYS宿主菌表达产物；C :诱导表 达温度的优化，1-6 分别为 39°C、37°C、35°C、30°C、25°C和 20°C 的 BL21 (DE3)PLYS 宿主菌 表达产物；D :IPTG 浓度优化，1-5 分别为 0. 2mmol/L、0. 4mmol/L、0. 6mmol/L、0. 8mmol/L 和 1. Ommol/L的IPTG诱导的表达产物。
[0023] 图4为3D蛋白Western-blot检测及纯化蛋白电泳（A为3D蛋白的免疫印迹检测 结果，Μ为蛋白质Marker，1为3D蛋白印迹。B为SDS-PAGE检测纯化的3D蛋白，Μ为低分 子量蛋白质Marker, 1为纯化的3D蛋白）。
【具体实施方式】
[0024] 下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体 条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等 著）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0025] 实施例1、克隆I型鸭肝炎病毒株DHAV-H的3D基因
[0026] I 型鸭肝炎病毒株 H(DHAV-H) (GenBank JQ301467)、E. coli DH5 α 菌种和 pET-32(a) +载体均由四川农业大学禽病防治研究中心保存并提供。各种分子生物学试剂购 于生物试剂公司。
[0027] 根据DHAV-H的基因组序列（GenBank JQ301467)设计扩增3D基因的引物，具体引 物如下：
[0028] PI ：5, -gg￡gtaccgatcaagggaaagtagtgagcaag-3, (SEQ ID Ν0· 1)，下划线表示 Κρη I酶切位点；
[0029] P2 :5' -acgcctcgagtcagatcatcatgcaagctgt-3' (SEQ ID Ν0· 2)，下划线表不 Xho I酶切位点；然后将设计的引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。
[0030] 取保存的DHAV-H病毒液以灭菌PBS作5倍稀释，添加1/100体积的双抗（青霉 素、链霉素的终浓度分别为l〇〇IU/mL和100yg/mL)后于37°C温育lh，然后接种9日龄发 育良好、无母源抗体的鸭胚，弃去24h内死亡胚，收集24?72h死亡胚的尿囊液及胚体，按 照Trizol试剂盒说明书提取病毒RNA。
[0031] 将提取的病毒RNA反转录合成cDNA，然后以cDNA为模板进行PCR扩增，反转录和 PCR扩增体系如表1所示。
[0032] 表1反转录和PCR反应体系
[0033]
【权利要求】
1. 可溶性I型鸭肝炎病毒3D蛋白在制备检测I型鸭病毒性肝炎抗体的ELISA试剂中 的应用，其特征在于，所述可溶性蛋白的制备步骤如下：将SEQ ID NO. 3所示序列的第9? 1376位核苷酸连接于pET-32 (a) +载体的多克隆酶切位点处，然后以大肠杆菌Rosetta、 BL21或BL21 (DE3)PLYS为宿主菌，在Amp抗性的LB培养基中活化后，在IPTG终浓度为 0. 2?1. Ommol/L、温度为20?39°C条件下诱导表达4?12小时，收集菌液，离心后收集菌 体，将收集的菌体用20mmol/L、pH为8. 0的Tris-HCl悬浮，然后在冰浴下超声，破碎后进行 离心，上清用Ni2+-NTA琼脂糖凝胶柱纯化，透析，超滤得可溶性I型鸭肝炎病毒3D蛋白。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述宿主菌为大肠杆菌BL21 (DE3)PLYS。
3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述诱导表达为加入IPTG至终浓度为 0. 8mmol/L，在温度为25°C条件下诱导表达6小时。
4. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述活化的具体步骤为：将表达菌株接种 于Amp抗性的LB培养基中，在37°C、120r/min条件下过夜培养，然后将培养液与Amp抗性 的LB培养基按体积比为1 :100扩大培养至0D_为0. 6即可。
5. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述冰浴下超声为在冰浴条件下超声破 碎6次，30sec/次，每次间隔30sec。
6. 检测I型鸭病毒性肝炎抗体的ELISA试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有可溶性I 型鸭肝炎病毒3D蛋白包被的反应板。
7. 根据权利要求6所述的ELISA试剂盒，其特征在于：所述反应板的制备方法为将 1 μ g/mL的可溶性I型鸭肝炎病毒3D蛋白按每孔100 μ L加入反应板中，4°C过夜包被，次日 PBST洗板5次，拍干即可。
8. 根据权利要求6所述的ELISA试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还含有酶标抗体、显 色液和终止液。
9. 根据权利要求6所述的ELISA试剂盒，其特征在于：所述酶标抗体为HRP标记羊抗 鸭IgG或HRP标记兔抗鸭IgG，所述显色液为TMB，所述终止液为浓度为2mol/L的H 2S04。
【文档编号】G01N33/68GK104297493SQ201410606977
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年10月31日 优先权日:2014年10月31日
【发明者】汪铭书, 程安春, 曹乾大, 陈孝跃 申请人:四川农业大学