专利名称：：鸭肝炎Ⅰ型病毒间接血凝诊断抗原的制备及试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种鸭肝炎I型病毒间接血凝诊断抗原的制备方法，具体涉及一种通过鸭肝炎I型病毒抗原致敏双醛化绵羊红细胞制备间接血凝诊断抗原的方法。
背景技术：
：鸭病毒性肝炎又称鸭肝炎，俗称"背脖病"，主要发生于三周龄以下雏鸭，是一种传播迅速、高度致死性的传染病，该病可由三种不同的病原引起，分别称为DHV-I、DHV-II禾BDHV-III型；3个血清型之间无交叉保护性。其中DHV-I主要侵害4周龄以内的雏鸭。特别是不足1周龄的雏鸭最易感染，死亡率可达90%以上，且其引起的鸭病毒肝炎呈世界性分布，是危害养鸭业最为严重的传染病之一。我国流行的主要为I型鸭病毒肝炎。1998年至1999年间，程安春在我国首次发现有II型DHV的存在。随着集约化养殖水平的提高，该病的流行趋势在增强，因而建立快速、灵敏和特异的血清学诊断方法势在必行。目前，鸭病毒肝炎检测技术主要有病毒分离技术和血清学检测技术等。中和试验是检测鸭病毒肝炎的经典方法。该法检测结果准确可靠，是目前公认的一种权威方法。但其繁琐、费时、成本高，不能用于快速检测，不适于基层的推广应用。近年来，间接血凝试验(IHA)经过不断改进后己广泛应用于检测血清中各种病原的抗体，与ELISA相比，间接血凝试验操作过程简便、节省时间，且不需要特殊仪器。本研究采用DHV-I抗原致敏双醛化绵羊红细胞，且对间接血凝诊断抗原工艺进行优化，旨在建立一种简便、稳定、敏感、特异性强、保存期长的用于检测鸭病毒性肝炎流行病学调査及抗体水平检测的方法。
发明内容本发明的要解决的技术问题在于提出一种鸭肝炎I型病毒间接血凝诊断抗原的制备方法。本发明的要解决的又一技术问题在于提出一种诊断鸭肝炎I型病毒的试剂品-O本发明要解决上述技术问题所采用的技术方案为本发明的鸭肝炎I型病毒间接血凝诊断抗原的制备方法，包括以下步骤1、双醛化绵羊红细胞的制备取质量百分比浓度为8%绵羊红细胞悬液1重量份，边搅拌边滴加质量百分浓度为3%丙酮醛1重量份，2426。C搅拌1518小时，3000r/min离心1520分钟，弃上清，红细胞用PBS溶液洗涤，用PBS溶液配制成质量百分比浓度为8%的红细胞悬液；取上述红细胞悬液1重量份，边搅拌边滴加质量百分浓度比为3%甲醛溶液l重量份，2426。C搅拌1518小时，3000r/min离心1520分钟，取红细胞用PBS溶液洗涤，用PBS溶液配制成质量百分比含量为8。/。的红细胞悬液，添加质量百分比浓度为0.2%的叠氮钠；2、双醛化红细胞的鞣酸化取质量百分比含量为8%的双醛化红细胞40毫升，用pH7.0，0.01mol/LPBS溶液洗涤，加入体积为质量百分比含量为8%的双醛化红细胞溶液的5倍的pH7.0，0.01mol/LPBS溶液，混匀后搅拌，加热至37。C，加入体积为质量百分比含量为8%的双醛化红细胞溶液1.25倍的质量体积比为0.01%的鞣酸溶液，全部加完后搅拌3060分钟，离心，弃上清，红细胞泥用O.15mo1/L，pH6.4的PBS洗涤，离心后在沉淀物内加入体积为质量百分比含量为8%的双醛化红细胞溶液的3.925倍的0.15mol/L，pH6.4的PBS即为2%的双醛化鞣酸化红细胞；3、鸭肝炎I型病毒抗原致敏双醛化鞣酸化绵羊红细胞将鸭肝炎I型病毒抗原贮存液用0.15mo1/L、pH为6.4的PBS溶液稀释10倍，将稀释后的鸭肝炎I型病毒抗原溶液加入2倍体积的质量百分比浓度为8%双醛化鞣酸化红细胞悬液，充分混合，37。C水浴致敏6090分钟，1500r/min离心1015分钟，沉淀加3倍体积的质量百分比浓度为0.25%的血清白蛋白悬浮，37'C水浴3060分钟，1500r/min离心1015分钟，沉淀用0.15mol/L、pH为6.4的PBS溶液洗涤，加入体积为鸭肝炎I型病毒抗原贮存液160倍的0.01mol/L、pH为7.0的PBS溶液，即成鸭肝炎I型病毒间接血凝诊断抗原。在步骤(l)中绵羊红细胞悬液的制备方法为在1重量份的健康青年公绵羊血中加入阿氏液11.2重量份，混匀，14。C存放35d后过滤；过滤后的血液每重量份中加入生理盐水9重量份，混匀，1000r/min离心1015分钟，取红细胞加入9倍重量的生理盐水洗涤46次，用含有质量百分比含量为0.85%氯化钠、pH值为7.2的PBS配成重量百分比为8%红细胞悬液。其中，在本发明方法的步骤(1)中采用的PBS溶液为含氯化钠质量百分比含量0.85%、pH值为7.2的PBS溶液；在步骤(1)中加入丙酮醛溶液后25'C搅拌优选16小时，加入甲醛溶液后25'C搅拌优选16小时。在本发明方法的步骤(2)中鞣酸采用pH7.0，0.01mol/L的PBS溶液配制。在本发明方法的步骤(3)中鸭肝炎I型病毒抗原贮存液的制备方法为将疑似鸭病毒性肝炎病例中分离到的病变肝组织制成悬液接种于易感雏鸭，接种后2448h后易感雏鸭死亡，且具有鸭病毒性肝炎的典型临床症状和体征、病理变化，再从死亡雏鸭组织中分离病毒，制成悬液接种12日龄鸭胚后4天取尿囊液，离心，浓縮提纯后通过电镜检测看到病毒颗粒，呈类晶格状排列，颗粒近似圆形，直径在3540nm，即得鸭肝炎I型病毒溶液，并测定鸭胚半数致死量。取对10日龄鸭胚的半数致死量为10"/0.2ml的鸭肝炎I型病毒溶液，加入体积比为鸭肝炎I型病毒溶液O.P/。的质量百分比含量为37。/。的甲醛溶液37。C灭活24小时，透析，待鸭肝炎I型病毒抗原溶液的体积浓縮为原体积的l/5时，即为鸭肝炎I型病毒抗原ie存液。其中，透析优选聚乙二醇-ioooo的透析袋。在鞣酸化之前对双醛化绵羊红细胞进行自凝性检测，其方法为在血凝板上任选3L，分别滴入0.01mol/LpH7.0PBS溶液、4倍稀释的鸭肝炎I型病毒阴性血清和鸭肝炎I型病毒阳性血清各50tx1;取双醛化鞣酸化的绵羊红细胞0.1ml加0.01mol/L和pH7.0的PBS溶液0.9ml混匀，在上述三个孔中分别滴加25U1，混匀，盖上玻片室温下放置2h观察红细胞是否凝集。本发明还提供了一种鸭肝炎I型病毒间接血凝诊断的试剂盒，包括(1)鸭肝炎I型病毒间接血凝诊断抗原血凝抗原；(2)稀释液0.01mol/L，pH7.0的PBS溶液;(3)阳性对照鸭肝炎I型病毒抗原贮存液；(4)说明书和96孔板。本发明的鸭肝炎I型病毒间接血凝诊断的试剂盒的使用方法为在96孔板上每孔加O.Olmol/L，pH7.0的PBS溶液25uL，加入25ul血清样本于第一孔中，吸吹混匀，取出25ul加于第二孔中，如此连续稀释至第ll孔，混合后弃掉25ul，最后一孔不加血清样本作为阴性对照；每一血清样本按同法稀释两排，每一样本的第一排滴加制备的DHV-I间接血凝诊断抗原25ul，第二排的最后一孔不加血清样本，加阳性对照25ul;将反应板置室温放置30分钟，待空白对照孔红血球全部沉于孔底，即可判定结果。本发明通过采用了双醛化和鞣酸化绵羊红细胞和PBS缓冲液的浓度和pH值的调节，所具有的有益效果为1.本发明的制备的鸭肝炎I型病毒间接血凝诊断抗原经检验证明其有效期在4。C可达8个月以上，而常规的间接血凝诊断液如4。C3个月后就会失效。2.本发明的制备的鸭肝炎I型病毒间接血凝诊断抗原的反应速度快，30分钟即可得到结果，而常规的间接血凝诊断抗原要2小时后才能得到结果。3.本发明的制备的鸭肝炎I型病毒间接血凝诊断抗原的及其试剂盒使用方便简单，适用于在实际生产中的推广与应用。4.本发明的制备方法步骤简单，适用于大规模生产。具体实施例方式下面的实施例用来进一步说明本发明，但这并不意味着对本发明的任何限制。实施例l1、绵羊红细胞的制备取健康青年公绵羊血l份加阿氏液l份，混匀，置4。C冰箱存放5d，使幼稚或脆弱的红细胞自行破裂。用脱脂棉过滤血液以除去血浆中的纤维蛋白。取过滤的血液l份加生理盐水9份混匀1000r/min离心10分钟，弃上清，并去其表层白细胞，再加生理盐水重悬血球泥，如此反复洗涤5次，以除去红细胞表面的黏附的杂质，后用含质量百分比浓度为0.85。/。NaCl、pH值为7.2的PBS溶液配成8。/。红细胞悬液备用。阿氏液(Alsever'sSolution)配方为葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g加蒸馏水至100ml，加热溶解后将pH值调到6.1，经过69kPa、15分钟的高压灭菌，4'C条件下保存备用。质量百分比浓度为0.85。/。NaCl、pH值为7.2的PBS溶液配方为NaCl8.5g、KC10.2g、Na2HP04*12H202.85g、KH2P040.27g加蒸馏水至1000ml，加热溶解后，经过103kPa、15分钟灭菌，4'C条件下保存备用。2、双醛化绵羊红细胞的制备取上述绵羊红细胞悬液l份，倒入带有磁棒的容器内，置磁力搅拌器上搅拌，并逐滴加入重量百分比含量为3。/。丙酮醛l份，25。C磁力搅拌器上连续搅拌16小时后，以3000r/min离心15min，弃上清，红细胞泥用质量百分比为0.85。/。NaClpH值为7.2PBS溶液洗5次，重悬成8%的红细胞悬液；取上述红细胞悬液l份倒入带有磁棒的容器内，置磁力搅拌器上搅拌，并逐滴加入质量百分比3%的甲醛溶液1份，25。C磁力搅拌器上连续搅拌16小时，3000r/min离心15分钟，弃上清，红细胞泥用质量百分含量为0.85。/。NaCl、pH值为7.2的PBS溶液洗5次，重悬成重量百分比含量8%的红细胞悬液，力叫.2%的叠氮钠4"贮存备用。3、双醛化绵羊红细胞的自凝性检测双醛化绵羊红细胞放置时间过久或储存条件不当或被污染等因素可能会出现自凝现象。其自凝性检测操作方法为在96孔V型血凝板上任选3孔，分别滴入0.01mol/L、pH7.0PBS溶液、4倍稀释的DHV-I阴性血清及DHV-I阳性血清各50ul;取双醛化的绵羊红细胞0.1ml加pH为7.0的0.01mol/LPBS溶液0.9ml混匀后滴入25ul，置振荡器上混匀，盖上玻板室温下放置2h观察红细胞是否凝集，若不出现凝集现象则备下一步使用。4、双醛化红细胞的鞣酸化取质量百分比含量为8%的双醛化红细胞40ml，用pH7.0，O.Olmol/LPBS溶液洗3次，每次均用2000r/m离心3分钟，去上清，加入pH7.0，O.Olmol/LPBS溶液200ml，混匀后倒入带有磁棒的容器内，置磁力搅拌器上搅拌，置37。C水浴容器内，待红细胞溶液温度升至37。C后逐滴加入质量体积比为0.01%鞣酸溶液50ml，鞣酸采用使用pH7.0，0.01mol/LPBS配制，全部加完后再搅拌30分钟，以2000r/min离心15min，弃上清，红细胞泥用0.15mol/L，pH6.4的PBS洗3次，每次3000r/min离心15分钟，最后一次去上清，往沉淀物内加入157ml的0.15mo1/L，pH6.4的PBS溶液即为质量百分比浓度为2%的双醛化鞣酸化红细胞。pH7.0，O.Olmol/LPBS溶液配制方法为称取Na2HP0412H202.185g,NaH2P042H200.69g，加热溶解后，经过103kPa、15分钟灭菌，放置在4。C条件下，保存备用。pH6.4，0.15mo1/LPBS溶液的配置方法为Na2HP04'2H207.126g，KH2P0412.698g加热溶解后，经过103kPa，15分钟灭菌，放置在4。C条件下，保存备用。5、鸭肝炎I型病毒抗原致敏双醛化鞣酸化绵羊红细胞鸭肝炎I型病毒抗原贮存液取对10日龄鸭胚的半数致死量为10"/0.2ml的鸭肝炎I型病毒抗原溶液加入1/1000的分析纯甲醛溶液37"C24小时灭活后，装入透析袋用聚乙二醇-10000进行透析，待鸭肝炎I型病毒抗原溶液的体积浓縮为原体积的l/5时，将浓縮的鸭肝炎I型病毒抗原溶液分装储存即为鸭肝炎I型病毒抗原贮存液。将鸭肝炎I型病毒抗原贮存液用0.15mol/L，pH6.4的PBS稀释10倍，取稀释的鸭肝炎I型病毒抗原溶液lml与质量百分比浓度为8。/。的双醛化鞣酸化红细胞悬液2ml充分混合，37。C水浴致敏60min，1500r/min离心10min，弃上清，沉淀物用质量百分比浓度为0.25%的血清白蛋白(BSA)悬浮，沉淀物的体积同质量百分比浓度为0.25%的血清白蛋白的体积比为1:3;37"C水浴保存30min，以使鸭肝炎I型病毒抗原致敏的双醛化鞣酸化溶液绵羊红细胞紧密结合不宜脱落；1500r/min离心10min，弃上清，用0.15mol/L、pH6.4PBS溶液洗一次，加0.01mol/L、pH7.0PBS溶液16ml摇匀即成DHV-I间接血凝诊断抗原。5、鸭肝炎I型病毒诊断抗原的使用操作步骤及结果判定使用方法为将96孔反应板横置，每孔用25ul移液器加0.01mol/L、pH7.0的PBS25ul，加入25ul血清样本于第一孔中，吸吹混匀，取25ul于第2孔中，如此连续稀释至第ll孔，混合后弃掉25ul，最后一孔留作红血球对照。每一血清样本按同法稀释两排，每一样本的第一排滴加制备的鸭肝炎I型病毒间接血凝诊断抗原25ul。将反应板置室温放置30min，待空白对照孔红血球全部沉于孔底(一般需时间为30min)，即可判定结果。结果判定红血球均匀铺于孔底，呈伞状或荷叶状巻边表示为"++++";红血球均匀铺于孔底，呈毛玻璃状表示为"+++";孔底中心有少量红血球沉积，周围有不均匀的分散红血球表示为"++";红血球大部分沉于孔底中心，周围有少量分散红血球表示为"+";红血球完全沉积于孔底中心，呈小圆点状表示为"一"。以出现"++"以上的最大稀释倍数为血清样本的血凝价(也即血清样本中所含DHV-I抗体的间接血凝价)。实施例2鸭肝炎I型病毒间接血凝诊断抗原检测鸭肝炎I型病毒抗体的特异性检测实验一将鸭肝炎I型病毒(DHV-I)抗原贮存液按1:8稀释后与按1:64稀释的DHV-I阳性血清等量混合，37X:水浴保温30min，取上述混合液滴入96孔血凝板孔内，每孔25iU，共滴加6孔，然后再加制备的DHV-I间接血凝诊断抗原，每孔25tU，混合后静置30min，观察凝集现象；实验结果见表1。实验二将按l:64的DHV-I阳性血清，37X:水浴保温30min，取上述混合液滴入96孔血凝板孔内，每孔25u1，共6孔，然后再加制备的DHV-I间接血凝诊断抗原，每孔25tU,混合后静置30min，观察凝集现象；实验结果见表l。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>从上述结果可以看出，鸭肝炎I型病毒抗原贮存液与鸭肝炎I型病毒阳性血清结合后不再与鸭肝炎I型病毒间接血凝诊断抗原结合，结果全为阴性；而鸭肝炎I型病毒阳性血清同鸭肝炎I型病毒间接血凝诊断抗原结合后全部出现凝集现象。实施例2鸭肝炎I型病毒诊断抗原与10种畜禽常见传染病阳性血清反应将大肠埃希氏菌Oh02、057抗原阳性血清(分别标记为A、B、C)、鸡马立克氏病毒阳性血清(标记为D)、鸡法式囊病毒阳性血清(标记为E)、鸡枝原体病毒阳性血清(标记为F)、鸡鼻炎杆菌阳性血清(标记为G)、猪瘟病毒阳性血清(标记为H)，猪细小病毒阳性血清(标记为I)，猪链球菌阳性血清(标记为J)作为样本，将每个样本均按如下方法操作，取样本滴入96孔血凝板孔内，每孔25u1，共滴加6孔，然后再加制备的鸭肝炎I型病毒(DHV-I)间接血凝诊断抗原，每孔25ul，混合后静置30min;观察凝集现象。实验结果见表2:表2<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>从表中结果可以看出DHV-I诊断抗原与这10种畜禽常见传染病的阳性血清没有交叉反应。结果表明DHV-I间接血凝诊断抗原的特异性较强。实施例3鸭肝炎I型病毒间接血凝诊断抗原的敏感性检测取10份免疫过DHV-I抗原的鸡血清同制备的DHV-I诊断抗原按照前面介绍的间接血凝试验的方法检测DHV-I抗体水平；同时将这10份血清通过琼脂扩散试验的方法检测DHV-I抗体水平的高低,以便比较其敏感性。试验结果见结果见表3;表3实验方法不同样本IHA和AGP检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>试验结果从表中可以看出间接血凝试验(IHA)的敏感度大大高于琼脂扩散试验(AGP)的敏感度，为3264倍。实施例4、批间重复性试验用三批不同的诊断抗原同时检测鸭肝炎I型病毒(DHV-I)阳性血清和阴性血清，观察检测结果是否一致，结果见表4。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>实验结果证明制备的DHV-I间接血凝诊断抗原的工艺流程是稳定的。实施例5保存期试验将实施例1制备的诊断抗原分装20份，分别置28'C普通冰箱、37'C恒温保存；同时将鸭肝炎I型病毒阳性血清样本分装20份冰箱冻存，每隔2周取其中的l份鸭肝炎I型病毒诊断抗原及鸭肝炎I型病毒阳性血清检测血清中鸭肝炎I型病毒抗体的变化情况。结果如表5。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>从表中可以看出28。C保存的诊断抗原从24周以后检测的血清效价开始出现不稳定现象；37。C恒温保存的诊断抗原从第8周后检测的血清效价开始出现不稳定现象；据此将28r保存期定为9个月以内，将37X:保存期定为3个月以内。实施例6免疫鸭群的检测用实施例l制备的鸭肝炎I型病毒油乳剂灭活疫苗对河南省荥阳一鸭场100只35日龄小鸭进行免疫试验。同时设100只为对照。具体操作如下试验组于接种鸭肝炎I型病毒疫苗前随机抽取样本15个采血取血清，用实施例1制备的鸭肝炎I型病毒间接血凝诊断抗原检测血清的鸭肝炎I型病毒抗体水平。然后在每只鸭的胸肌内接种鸭肝炎I型病毒疫苗0.2ml/只，于第1次接种后两周再接种l次，0.5ml/只，于第一次接种后的四周分别随机抽取样本15只采血分离血清，用鸭肝炎I型病毒间接血凝诊断抗原检测血清效价。对照组用生理盐水代替疫苗，试验方法同试验组。结果如表6。表6随机抽取的不同鸭只血清样本的DHV-I抗体水平o周血样4周血样2o2"2o2o2(j2o2o2o2u2u2"2o2o2o2o272727272524262526272423262627对照组随机抽取的不同鸭只血清样本的DHV-I抗体水平O周血样4周血样202"2U2U2U2U202"2G2"2U2°202Q2。2°2°2°2G2Q202。2G2G20从结果可以看出用鸭肝炎I型病毒疫苗接种的鸭群，用制备的鸭肝炎I型病毒间接血凝诊断抗原测其血清中鸭肝炎I型病毒的抗体水平均有不同程度的上升，而未接种鸭肝炎I型病毒疫苗组用制备的鸭肝炎I型病毒间接血凝诊断抗原测其血清中鸭肝炎I型病毒的抗体水平前后没有变化。权利要求1.一种鸭肝炎I型病毒间接血凝诊断抗原的制备方法，包括以下步骤(1)双醛化绵羊红细胞的制备取质量百分比浓度为8％绵羊红细胞悬液1重量份，边搅拌边滴加质量百分浓度为3％丙酮醛1重量份，24～26℃搅拌反应15～18小时，3000r/min离心15～20分钟，弃上清，红细胞用PBS溶液洗涤，用PBS溶液配制成质量百分比浓度为8％的红细胞悬液；取上述红细胞悬液1重量份，边搅拌边滴加质量百分浓度比为3％甲醛溶液1重量份，24～26℃搅拌15～18小时，3000r/min离心15～20分钟，取红细胞用PBS溶液洗涤，用PBS溶液配制成质量百分比含量为8％的红细胞悬液，每100毫升质量百分比含量为8％的红细胞悬液中添加0.2克的叠氮钠；(2)双醛化红细胞的鞣酸化取质量百分比含量为8％的双醛化红细胞40毫升，用pH7.0，0.01mol/LPBS溶液洗涤，加入体积为质量百分比含量为8％的双醛化红细胞溶液的5倍的pH7.0，0.01mol/LPBS溶液，混匀后搅拌，加热至37℃，加入体积为质量百分比含量为8％的双醛化红细胞溶液1.25倍的质量体积比为0.01％的鞣酸溶液，全部加完后搅拌30～60分钟，离心，弃上清，红细胞泥用0.15mol/L，pH6.4的PBS洗涤，离心后在沉淀物内加入体积为质量百分比含量为8％的双醛化红细胞溶液的3.925倍的0.15mol/L，pH6.4的PBS即为2％的双醛化鞣酸化红细胞；(3)鸭肝炎I型病毒抗原致敏双醛化鞣酸化绵羊红细胞将鸭肝炎I型病毒抗原贮存液用0.15mol/L、pH为6.4的PBS溶液稀释10倍，将稀释后的鸭肝炎I型病毒抗原溶液加入2倍体积的质量百分比浓度为8％双醛化鞣酸化红细胞悬液，充分混合，37℃水浴致敏60～90分钟，1500r/min离心10～15分钟，沉淀加3倍体积的质量百分比浓度为0.25％的血清白蛋白悬浮，37℃水浴30～60min，1500r/min离心10～15min，沉淀用0.15mol/L、pH为6.4的PBS溶液洗涤，加入体积为鸭肝炎I型病毒抗原储存液160倍的0.01mol/L、pH为7.0的PBS溶液，即成鸭肝炎I型病毒间接血凝诊断抗原。2.—种如权利要求1所述的鸭肝炎I型病毒间接血凝诊断抗原的制备方法，其特征在于，在步骤(l)中绵羊红细胞悬液的制备方法为在l重量份的健康青年公绵羊血中加入阿氏液11.2重量份，混匀，14。C存放35d后过滤；过滤后的血液每重量份中加入生理盐水9重量份，混匀，1000r/min离心1015分钟，取红细胞加入9倍重量的生理盐水洗涤，用含有质量百分比含量为0.85%氯化钠、pH值为7.2的PBS溶液配成重量百分比为8%红细胞悬液。3.—种如权利要求l所述的鸭肝炎I型病毒间接血凝诊断抗原的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中采用的PBS溶液为含氯化钠质量百分比含量0.85。/。、pH值为7.2的PBS溶液。4.一种如权利要求l所述的鸭肝炎I型病毒间接血凝诊断抗原的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中加入丙酮醛溶液后25。C搅拌16小时，加入甲醛溶液后25'C搅拌16小时。5.—种如权利要求l所述的鸭肝炎I型病毒间接血凝诊断抗原的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中鞣酸采用pH7.0，0.01mol/L的PBS溶液配制。6.—种如权利要求l所述的鸭肝炎I型病毒间接血凝诊断抗原的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中鸭肝炎I型病毒抗原贮存液的制备方法为取对10日龄鸭胚的半数致死量为10"0.2ml的鸭肝炎I型病毒溶液，加入体积为鸭肝炎I型病毒溶液O.1%的质量百分比含量为37%的甲醛溶液371:灭活24小时，透析，待鸭肝炎I型病毒抗原溶液的体积浓縮为原体积的l/5时，即为鸭肝炎I型病毒抗原贮存液。7.—种如权利要求6所述的鸭肝炎I型病毒间接血凝诊断抗原的制备方法，其特征在于，透析采用聚乙二醇-ioooo的透析袋。8.—种如权利要求l所述的鸭肝炎I型病毒间接血凝诊断抗原的制备方法，其特征在于，在进行鞣酸化之前对双醛化绵羊红细胞进行自凝性检测，其方法为在血凝板上任选3孔，分别滴入0.01mol/LpH7.0PBS溶液、4倍稀释的鸭肝炎I型病毒阴性血清和鸭肝炎I型病毒阳性血清各50u1;取双醛化的绵羊红细胞0.1ml加0.01mol/L和pH7.0的PBS溶液0.9ml混匀，在上述三个孔中分别滴加25ul，混匀，盖上玻片室温下放置2小时观察红细胞是否凝集。9.一种鸭肝炎I型病毒间接血凝诊断的试剂盒，其特征在于，试剂盒包括(1)鸭肝炎I型病毒间接血凝诊断抗原血凝抗原；(2)稀释液0.01mol/L，pH7.0的PBS溶液；(3)阳性对照鸭肝炎I型病毒抗原贮存液；(4)说明书和96孔板。10.—种如权利要求9所述的鸭肝炎I型病毒间接血凝诊断的试剂盒的使用方法为在96孔板上每孔加0.01mol/L，pH7.0的PBS溶液25uL，加入25ul血清样本于第一孔中，吸吹混匀，取出25ul加于第二孔中，如此连续稀释至第ll孔，混合后弃掉25ul，最后一个孔不加血清样本作为阴性对照；每一血清样本按同法稀释两排，每一样本的第一排滴加制备的DHV-I间接血凝诊断抗原25ul，第二排的最后一个孔不加血清样本，加阳性对照25ul;将反应板置室温放置30分钟，待空白对照孔红血球全部沉于孔底，即可判定结果。全文摘要本发明涉及一种鸭肝炎Ⅰ型病毒间接血凝诊断抗原的制备方法，具体涉及一种通过鸭肝炎Ⅰ型病毒抗原致敏双醛化绵羊红细胞制备间接血凝诊断抗原的方法。本发明的方法生产的鸭肝炎Ⅰ型病毒间接血凝诊断抗原保存时间长，可达半年；而且缩短了诊断时间，仅需要半个小时，使用方便简单，适于在实际生产中的推广与应用。文档编号C07K14/005GK101423548SQ20081023965公开日2009年5月6日申请日期2008年12月12日优先权日2008年12月12日发明者陶海静申请人:陶海静