专利名称：：一种鸭病毒性肝炎灭活疫苗及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种鸭病毒性肝炎灭活疫苗及其制备方法，属于兽医生物制品
技术领域：
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背景技术：
：鸭病毒性肝炎(DuckViralH印atitis，DVH)是由鸭肝炎病毒(或称鸭病毒性肝炎病毒)(Duckh印atitisvirus,DHV)引起的雏鸭的一种高度致死性、传播迅速的病毒性疾病，其特征是病程短促，临床表现角弓反张，病变主要为肝脏肿大并有出血斑点。DVH不仅引起雏鸭发病，死亡率高，而且使成年鸭呈隐性感染，向外排毒，成为病原的传播者。在疾病严重爆发时，雏鸭死亡速度惊人，对该病如果不进行及时的控制，会给养鸭业带来极大的经济损失。鸭肝炎病毒的病毒颗粒无囊膜，属于微RNA病毒科。病毒粒子呈二十面体对称，直径2040nm，在电子显微镜下从肝脏超薄切片上观察到34nm的颗粒，目前对于鸭病毒性肝炎的分子生物学的研究相对较少。鸭肝炎病毒有3个血清型，即I、II、III型，3个血清型都可引起鸭病毒性肝炎，但是目前普遍存在的鸭病毒性肝炎是由鸭肝炎病毒I型引起的。据报道，n型病毒与i型病毒无抗原相关性；m型病毒与i型病毒之间无抗原关系。郭玉璞等根据病毒中和实验和血清被动保护实验结果，证实我国流行的DHV病原为I型鸭肝炎病毒。DHV-I型对外界环境的抵抗力特别强，可耐受乙醚、碳氟化合物、氯仿、胰酶及30%的甲醇和硫酸钱的处理，具有一定的热稳定性，在37"C条件下可存活21d，56。C加热23h才能使其完全失活，一些常用消毒剂对该病毒灭活效果也不明显。I型鸭病毒性肝炎，Levine和Hofstad于1945年在美国首次发现该病(Levine，P.P.，andM.S.Hofstad.1945.Duckdiseaseinvestigation.AnnuRepNewYorkStateVetCollIthaca,pp.5556)，1950年，Levine和Fabricant在纽约长岛首次用鸡胚分离出I型鸭肝炎病毒(Levine,P.P，andJ.Fabricant.1950.Ahitherto-undescribedvirusdiseaseofducksinNorthAmerica.CornellVet40:7186)。1954年，AsplinJ艮道了英国爆发流行病毒性肝炎(Asplin，F.D.1965.Duckhepatitis:vaccinationagainsttwoserologicaltypes.VetRec77:1529-1530)，随后德国、加拿大、法国、日本等国相继报道了DHV的流行。在我国，1963年，黄均建最早于上海报道了DVH的发生(黄均建等.小鸭病毒性肝炎研究.1963.上海农科院畜牧兽医研究所单行本)，1980年，北京大学王平等报道了北京地区DVH的流行(王平等.北京小鸭病毒性肝炎的研究(一)诊断与防治，北京大学自然科学学报.1980.1:56-74)。目前我国还没有商品化的鸭病毒性肝炎疫苗。近年来，不断有使用I型鸭病毒性肝炎弱毒疫苗或高免卵黄抗体进行预防或治疗无效的鸭群爆发疑似鸭病毒性肝炎，使得防制鸭肝炎病毒感染的难度不断增大。
发明内容本发明的目的是利用本发明人由野外分离到的一株拥有优良免疫原性的鸭肝炎病毒强毒株作为生产疫苗的病毒株，接种到易感鸡胚上，收获胚液，灭活后乳化，制成-种安全、有效的鸭病毒性肝炎疫苗，有针对性的防制鸭肝炎病毒感染。1疫苗生产用毒株(1)病毒来源本发明制备所用的生产病毒是一株鸭病毒性肝炎I型病毒，由本发明人从野外发病鸭体内分离到，命名为鸭肝炎病毒(DuckH印atitisvirus，DHV)QL株(2009年07月15日本株病毒(DHVQL株)已送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCCNo.3202)。(2)DHVQL株病毒株特性1)病毒形态DHVQL株病毒病毒粒子呈二十面体对称，直径2040nm，在电子显微镜下从肝脏超薄切片上观察到34nm的颗粒。2)分子生物学鉴定从组织毒提取RNA，经反转录后，根据Genbank发表的DHV全基因序列设计的一对特异性引物Pl:5'-ACAGGAGCCAAGGGTTAT-3，；P2:5'-GCCAGGTGGTTGATGTM-3'进行RT-PCR扩增，，将扩增后的产物经酶切显示出序列大小为488bp的目的条带，鉴定为DHV阳性。3)血凝性DHVQL株病毒对鸡、豚鼠、兔、猪红细胞均不凝集。4)对鸭胚的半数感染量(EIDso)经测定DHVQL株病毒3代组织的毒EID5。为107°EID5。/0.2ml。5)对雏鸭的致病力测定DHVQL株病毒3代组织毒对雏鸭的致病力测定结果显示当攻10"EIDs。时，可以使雏鸭100/100发病，即最小感染量(MID)为105°EID5。；半数感染量(瓜。)为10:"3;半数致死量(LD5。)为10278。6)稳定性将DHVQL株经尿囊腔内接种910日龄无特异性病原(SPF)鸡胚传10代，每0.2ml病毒含量均在10"EID5。以上，则DHVQL株在10代以内是稳定的，可以作为疫苗生产用种毒。7)免疫原性为了DHVQL株的疫苗研究，进行了免疫原性试验，结果显示DHVQL株E2E10代均具有良好的免疫原性。8)特异性将毒种稀释至10"EID5。/0.2ml，与等量抗鸭肝炎病毒特异性血清混合，室温放置l小时后，接种SPF鸡胚10个，观察120小时。在24120小时内不引起特异性死亡，且至少存活8个。2鸭病毒性肝炎灭活疫苗的制备步骤为-生产用种毒制备一制苗用毒液的制备一孵育与观察一收获一灭活一乳化—配苗一分装一28。C保存。1)生产用种毒制备将毒种用灭菌生理盐水稀释至l(T3，尿囊腔内接种910日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml，接种后96小时，置04'C冷却424小时，收获胚液，选择无细菌生长、病毒含量》106°EID5。/0.2ral的胚液作为生产用毒种。2)制苗用毒液的制备选择发育良好、910日龄的易感鸡胚作为制苗用材料。取生产用种毒，用灭菌生理盐水作10—2稀释，尿囊腔内接种910日龄非免疫鸡胚，每胚0.2ral，接种后密封针孔，置3637。C继续孵育。3)孵育与观察鸡胚接种后每日照蛋1次，24小时以前死亡的鸡胚弃去。以后每46小时照蛋1次，死亡的鸡胚随时挑出，置28。C保存，直至96小时，不论死亡与否，全部取出，气室向上直立，置于28。C冷却424小时。4)收获将冷却的鸡胚取出，用碘酊消毒气室部位，然后以无菌手术剥除气室部卵壳，揭去卵壳膜，剪破绒毛尿囊腔膜及羊膜(谨防卵黄破裂)，吸取胚液。对每个鸡胚在吸取胚液前均应注意检查，凡胎儿腐败、胚液混浊及有任何污染可疑者，弃去不用。每若干个鸡胚分为一组，吸取胚液放于同一灭菌的容器内，每组抽样，应无细菌生长，28'C保存。5)灭活将检验合格的鸡胚液分别进行灭活，加入甲醛至总量的0.2%。然后在37'C灭活40小时(以瓶内温度达到37卩开始记时)，期间振摇34次。灭活后2『C保存。6)乳化按常规方法制备油佐剂疫苗(参见《中国兽药典》)。油相制备取注射用白油94份，加司本-806份，混合后，加硬脂酸铝2份，随加随搅拌至透明为止，高压灭菌备用。水相制备取灭菌吐温-804份，加入灭活胚液96份，充分振摇，使吐温-80完全溶解。乳化取油相2份放于乳化缸内，开动电机慢速转动搅拌，同时缓慢加入水相l份，加完后再以10000r/min搅拌25分钟，在终止搅拌前加入1%硫柳汞溶液，使其最终浓度为0.01%。7)分装定量分装，加盖密封，28'C保存。3鸭病毒性肝炎灭活疫苗的检验方法(1)物理性状外观应为为乳白色乳状液。剂型为油包水型(W/0)。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，应呈油滴状，不扩散。粘度用lml吸管(出口内径为1.2mm)，吸取25。C左右的疫苗，令其垂直自然流出，记录流出0.4ml所需时间，应不超过8秒。稳定性在37'C左右条件下放置21日或将疫苗5ml加入离心管，经3000r/min离心15分钟，应不破乳。不符合规定者判为不合格。(2)无菌检验按《中国兽药典》规定进行，应为无菌生长。(3)安全检验用37日龄的樱桃谷鸭10只，各颈部皮下注射疫苗lml，观察14日，应不出现由疫苗注射引起的任何局部和全身不良反应。(4)效力检验用l日龄左右的樱桃谷鸭10只，各皮下注射疫苗0.3ml，21日时，连同条件相同的对照鸭5只，各腿部肌肉注射1(TEID5。强毒，观察7日，应全部健活。(5)甲醛、硫柳汞含量测定按《中国兽药典》的规定方法进行测定，其甲醛溶液量(40°/。甲醛)不应超过0.2%;汞类防腐剂残留量应不超过0.01%。本发明的优点本发明是利用本发明人由野外分离得到的一株拥有优良免疫原性的鸭肝炎病毒强毒株作为生产疫苗的病毒株，接种到易感鸡胚上，收获胚液，灭活后乳化，制成一种安全、有效的鸭病毒性肝炎疫苗。本发明有针对性的防制鸭肝炎病毒感染，拟补了市场上的空白，为控制养殖场鸭病毒性肝炎的扩散提供了条件。实施例以下实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。实施例1DHVQL株病毒种子病毒的纯净性检验1)无菌检验T.G、G.P小管和G.A斜面培养基均未观察到菌落。2)支原体检验在观察期内，未发现小瓶和小管培养物颜色出现明显变化，移植的液体培养物在固体培养基上无"煎蛋"状支原体菌落。3)外源病毒检验两组鸡胚7日内全部存活，剖检胎儿发育正常，绒毛尿囊膜无病变，鸡胚液无血凝性。DHVQL株病毒中未见细菌、霉菌和支原体生长，无外源病毒污染，证明其是纯净的。实施例2疫苗制备1毒种繁殖将毒种用灭菌生理盐水稀释至10—3，尿囊腔内接种910日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml，接种后96小时，置04'C冷却424小时，收获胚液，选择无细菌生长、病毒含量>l(TEID5。/0.2ml的胚液作为生产用毒种。2制苗用毒液的制备选择发育良好、910日龄的易感鸡胚作为制苗用材料。取生产用种毒，用灭菌生理盐水作10—2稀释，尿囊腔内接种910日龄非免疫鸡胚，每胚0.2ml，接种后密封针孔，置3637。C继续孵育。3孵育与观察鸡胚接种后每日照蛋l次，24小时以前死亡的鸡胚弃去。以后每46小时照蛋1次，死亡的鸡胚随时挑出，置28。C保存，直至96小时，不论死亡与否，全部取出，气室向上直立，置于28。C冷却424小时。4收获将冷却的鸡胚取出，用碘酊消毒气室部位，然后以无菌手术剥除气室部卵壳，揭去卵壳膜，剪破绒毛尿囊腔膜及羊膜(谨防卵黄破裂)，吸取胚液。对每个鸡胚在吸取胚液前均应注意检查，凡胎儿腐败、胚液混浊及有任何污染可疑者，弃去不用。每若干个鸡胚分为一组，吸取胚液放于同一灭菌的容器内，每组抽样，应无细菌生长，28'C保存。5灭活将检验合格的鸡胚液分别进行灭活，加入甲醛至总量的0.2%。然后在37'C灭活40小时(以瓶内温度达到37C开始记时)，期间振摇34次。灭活后28。C保存，应不超过一个月。6乳化油相制备取注射用白油94份，加司本-806份，混合后，加硬脂酸铝2份，随加随搅拌至透明为止，高压灭菌备用。水相制备取灭菌吐温-804份，加入灭活胚液96份，充分振摇，使吐温-80完全溶解。乳化取油相2份放于乳化缸内，开动电机慢速转动搅拌，同时缓慢加入水相l份，加完后再以10'000r/min搅拌25分钟，在终止搅拌前加入P/。硫柳汞溶液，使其最终浓度为0.01%。7分装定量分装，加盖密封，28'C保存。实施例3疫苗的成品检验(1)物理性状外观应为为乳白色乳状液。剂型为油包水型(W/0)。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，应呈油滴状，不扩散。粘度用lml吸管(出口内径为1.2mm)，吸取25'C左右的疫苗，令其垂直自然流出，记录流出0.4ml所需时间，应不超过8秒。稳定性在37。C左右条件下放置21日或将疫苗5ml加入离心管，经3000r/min离心15分钟，应不破乳。不符合规定者判为不合格。(2)无菌检验按《中国兽药典》规定进行，应为无菌生长。(3)安全检验用37日龄的樱桃谷鸭10只，各颈部皮下注射疫苗lml，观察14日，应不出现由疫苗注射引起的任何局部和全身不良反应。(4)效力检验用1日龄左右的樱桃谷鸭10只，各皮下注射疫苗0.3ml，21日时，连同条件相同的对照鸭5只，各腿部肌肉注射105°EID5。强毒，观察7日，应全部健活。(5)甲醛、硫柳汞含量测定按《中国兽药典》的规定方法进行测定，其甲醛溶液量(40%甲醛)不应超过0.2%;汞类防腐剂残留量应不超过0.01%。实施例4鸭病毒性肝炎灭活疫苗的安全性试验本发明人利用鸭肝炎病毒QL株研制出鸭病毒性肝炎灭活疫苗，我们对其进行了安全性试验的研究。1各种剂量对不同日龄樱桃谷雏鸭的安全性试验将3个批次(0704001、0704002、0704003)的疫苗，颈部皮下接种1日龄、3日龄、5日龄樱桃谷鸭雏鸭，每组10只，0.3ml/只。接种后观察14天内，所有雏鸭接种部位未出现肿胀，未见全身不良反应。2单剂量重复使用的安全性试验将0704001批次的疫苗颈部皮下接种3日龄樱桃谷雏鸭种鸭各10只，每周1次，每次0.3ml，重复3次；颈部皮下接种30周龄种鸭10只，每周1次，每次0.5ml，重复3次。最后1次接种后2周，鸭接种部位未出现肿胀，也未见全身不良反应。3—次超剂量接种的安全试验将3个批次(0704001、0704002、0704003)的疫苗，分别颈部皮下注射接种IO只3日龄雏鸭，1ml/只；10只种鸭2ml/只。超剂量接种的10只3日龄雏鸭和IO只种鸭，接种后观察14天，所有鸭未接种部位未出现肿胀，未见全身不良反应。4疫苗对产蛋鸭生产性能的影响试验取0704001批疫苗，将处于产蛋高峰期的28周龄产蛋鸭100只分为2组，每组50只，其中1组每只肌肉注射疫苗0.5ml，另外1组每只肌肉注射疫苗lml，另取50只同条件的鸭作为对照，肌肉注射生理盐水，每只0.5ml，同条件下饲养，观察2周，免疫鸭只对疫苗的应激反应很小，采食正常，精神良好，产蛋量和和体重未受影响，与对照组相比，各种生产性能指标无明显差异。具体结果见表L表l疫苗对产蛋高峰期蛋鸭的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>以3批疫苗进行安全性检验，颈部皮下或肌肉注射1日龄、3日龄和5日龄雏鸭，2周后观察，接种部位无肿胀，无全身不良反应；以0.3ml/只剂量连续3次接种3日龄鸭和以0.5ml/只剂量连续3次接种28周龄种鸭，接种后，接种部位无肿胀，无全身不良反应，说明疫苗对鸭只是安全的。以lnil/只剂量接种3日龄鸭和以2ml/只剂量连接种28周龄种鸭，接种后，接种部位无肿胀，无全身不良反应，说明超剂量接种疫苗对鸭只是安全的。以0.5ml剂量和lml剂量免疫处于产蛋高峰期的蛋鸭，观察结果表明，疫苗对鸭的应激反应小，对其体重产蛋量没有影响。实施例5鸭病毒性肝炎灭活疫苗效力试验本发明人利用鸭肝炎病毒QL株研制出3批(0704001、0704002、0704003)鸭病毒性肝炎灭活疫苗，经过实验室安全试验证明，疫苗对鸭是安全的，在此基础上我们又对其进行了免疫效力试验的研究。1.对雏鸭的效力试验将i日龄樱桃谷鸭分为IO个组，每组10只，其中1组作为对照。取3个不同批号的疫苗，每批疫苗分3个注射剂量，颈部皮下注射O.lml/只、0.3ml/只和0.5ml/只，21曰时，连同对照鸭10只，各肌肉注射106°EID5DHVQL株强毒，观察14日，0.lml剂量组攻毒保护在8/10以上，0.3ml剂量组和0.5ml剂量组攻毒保护均为10/10，对照组10/10发病或死亡，具体结果见表l。2.对种鸭的效力试验将产蛋前1个月左右的樱桃谷鸭分为10个组，每组10只，其中1组作为对照。取3个不同批号的疫苗，每批疫苗分3个注射剂量，颈部皮下注射0.5ml/只、lml/只和1.5m1/只。将种鸭生产时，将孵出的鸭蛋孵化至雏鸭7日龄时，连同对照鸭所孵7日龄雏鸭，每组均为10只，各肌肉注射105°EID5。QL株强毒，观察14日，0.5ml剂量组攻毒保护均在8/10以上，lml剂量组和1.5ml剂量组攻毒保护均为10/10，对照组10/10发病或死亡，具体结果见表2。表2鸭病毒性肝炎灭活疫苗效力试验结果疫苗批号雏鸭效力试验种鸭效力试验疫苗剂量鸭数攻毒剂量EID50攻毒保护数疫苗剂量鸭数攻毒剂量EID50攻毒保护数07040010.1ml101058/100.5ml101058/100.3ml1010510/101,0ml1010510/100.5ml1010510/101.5ml1010510/1007040020.1ml101058/100.5ml101059/100.3ml1010510/101.0ml1010510/100.5ml1010510/101.5ml1010510/1007040030.1ml101059/100.5ml101058/100.3ml1010510/101.0ml1010510/100.5ml1010510/101.5ml1010510/10对照组/101050/10/101050/10就次力试验表明，以O.lml剂量免疫l日龄樱桃谷雏鸭，攻毒保护率在80%以上，以0.3ml剂量和0.5ml剂量进行免疫，攻毒保护率为100%,对照组全部发病或死亡，保护率为O;以0.5ml剂量免疫产蛋前l个月左右的樱桃谷种鸭，所孵雏鸭攻毒保护率在80%以上，以1.Oml剂量和1.5ml剂量进行免疫，，所孵雏鸭攻毒保护率为100%，对照组全部发病或死亡，保护率为O。序列表<110>齐鲁动物保健品有限公司<120>—种鸭病毒性肝炎灭活疫苗及其制备方法<160>2<170〉<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>对人工序列的描述鸭肝炎病毒PCR引物P1<■>1ACAGGAGCCAAGGGTTAT18<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>对人工序列的描述鸭肝炎病毒PCR引物P2<400>2GCCAGGTGGTTGATGTAA18权利要求1.一种鸭病毒性肝炎灭活疫苗，其特征是将本疫苗含有保藏号为CGMCCNo.3202的经灭活的鸭病毒性肝炎病毒。2.—种鸭病毒性肝炎灭活疫苗的制备方法，其特征是将保藏号为CGMCCNo.3202的生产用种毒，用灭菌生理盐水作10—2稀释，经尿囊腔内接种910日龄的易感鸡胚，每胚0.2ml，密封针孔，37X:继续孵化96h，置于28'C冷却424h，无菌收获吸取胚液，将检验合格的鸡胚液加入甲醛至总量的0.2%，然后在37'C灭活40h，按常规法制备成油佐剂灭活疫苗。全文摘要本发明涉及一种鸭肝炎灭活疫苗及其制备方法。是利用本发明人由野外分离得到的一株拥有优良免疫原性的鸭肝炎病毒强毒CGMCCNo.3202株作为生产疫苗的病毒株，接种到易感鸡胚上，收获胚液，灭活后乳化，制成一种安全、有效的鸭病毒性肝炎疫苗。本发明有针对性的防制鸭病毒性肝炎病毒感染，拟补了市场上的空白，为控制养殖场鸭病毒性肝炎的扩散提供了条件。文档编号A61K39/29GK101612397SQ20091015792公开日2009年12月30日申请日期2009年7月17日优先权日2009年7月17日发明者徐龙涛,李秀娟,蕾王,禚宝山申请人:齐鲁动物保健品有限公司