专利名称：甲型、乙型肝炎联合疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及甲型、乙型肝炎联合疫苗，属于医学生物技术领域。
背景技术：
病毒性肝炎是由多种肝炎病毒引起的以肝脏损害为主的全身性急性或持续性传染病，在世界各地均有流行。我国大部分地区属于甲肝高流行区，每年疫情报告超过百万例，绝大多数为学龄前儿童。随着近年来经济的发展和卫生条件的改善，甲肝流行出现了发病年龄上移，病情严重，病死率增加的特点。乙肝是世界性的公共卫生问题，我国属于乙肝高流行区，人群携带率高，有1.2亿乙型肝炎表面抗原携带者，每年新发病人多达900万。疫苗的使用，有效地降低了甲、乙肝的发生率。1991，WHO将乙肝疫苗接种纳入扩大免疫计划，对婴儿和成人实施普遍的免疫接种。我国于1992年将乙肝疫苗的免疫接种纳入国家计划免疫项目，并取得了良好的效果。但随着疫苗种类的不断增加，婴幼儿接种次数也随之增多。目前的美国疫苗接种程序要求儿童从出生到16岁共接种43剂疫苗抗原，需要注射次数从1988年的8次增加到1998年的14-20次。我国儿童一岁内需接种10剂疫苗抗原7次。儿童免疫负担之重可想而知，不仅如此，接种疫苗也增加了交叉感染的机会，且在生产上增加生产成本及运输、贮存、使用等多种费用，尤其在人口众多的我国，医务人员的工作量以及造成的经济损失都是极为罕见的。因此，有必要研制更加科学、合理、经济的疫苗。甲乙肝联合疫苗具有甲、乙型肝炎双重特异性保护性能，同时预防这两种疾病，它符合当今世界疫苗研究的发展方向——制备多价联合疫苗。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能同时预防甲肝与乙肝这两种疾病的联合疫苗，降低生产成本以及运输、贮存、使用等环节的多种费用，减轻患者尤其是婴幼儿的免疫负担与痛苦，减少医务人员的工作量，减少交叉感染的机会。
本发明通过下列技术方案实现一种甲型、乙型肝炎联合疫苗，其特征在于它由下列成分组成吕-8株HAV抗原 320～1280ELU/mlHBs抗原 5～10ug/ml氢氧化铝 0.5～1.5mg/ml2-苯氧基乙醇 4.0～6.0mg/ml吐温-20 0.04～0.06mg/ml甘氨酸2.0～4.0mg/ml氯化钠0.8～0.9mg/ml。
本发明提供的甲型、乙型肝炎联合疫苗由下列工艺方法制得A、将甲肝病毒毒种HAV吕-8株的P26代毒种经冻融超声后，按1∶5～50的体积比接种于人胚肺二倍体细胞(KMB17)上，在35℃培养12～16天收获病毒液；B、将上述病毒液经冻融、超声破碎、核酸酶消化、氯仿抽提、PEG浓缩、DEAE Sepharose FF层析，用1∶4000的甲醛37℃灭活12～15天获得甲型肝炎纯化抗原；C、在上述甲肝纯化抗原中加入0.5～1.0mg/ml的Al(OH)3振摇吸附1～4小时，调整离子强度氯化钠含量0.8～0.9mg/ml和溶液酸碱度的pH值7.0～8.0，制成含量为640～2560EU/ml的吸附甲肝灭活抗原，待用；D、将重组酵母表达的含量为20～30ug/ml的吸附乙肝表面抗原和C步骤所得的吸附甲肝灭活抗原以及疫苗用辅料按上述配比混合后，在20～40℃振摇1～4小时，即得甲肝抗原含量为320～1280EU/ml，乙肝抗原含量为5～20ug/ml的联合疫苗。
所述重组酵母表达抗原来自深圳康泰生物制品有限公司，菌种号为2150-2-3 PHBS56-GAP347/33。
本发明提供的联合疫苗具有下列优点1)吸附完全，理化性质稳定，未发生相互干扰作用。用现有方法在上清中未检出甲肝抗原和乙肝表面抗原，pH值、铝含量、游离甲醛含量稳定。结果见表1。
2)良好的安全性。依据生物制品异常毒性试验规程接种小鼠和豚鼠，符合规程要求，在7天的观察期内，小鼠和豚鼠全部健存，到期体重增加，结果见表2、表3。甲乙肝联合疫苗006批(HAAg 640EU/ml，HBsAg10ug/ml)接种恒河猴，以甲肝疫苗、乙肝疫苗、史克甲乙肝联合疫苗作为对照，3天内，所有动物的注射局部均无肿胀、硬结，亦未见厌食、呕吐及活动异常等全身反应；接种疫苗后2-32周丙氨酸转氨酶(ALT)、天门冬氨酸转氨酶(AST)无异常升高；接种前，接种后4、8、24、28周肝脏穿刺，取活组织进行病理检测，无组织病理学改变，见表4。
3)良好的免疫原性。小鼠效力结果表明二者混合后，不影响其效力，达到了单价疫苗的免疫效果，达到或超过了国外甲乙肝联合疫苗的免疫效果，结果见表5。
4)良好的稳定性。37℃放置27天后，上清未检出抗原，理化性质稳定，小鼠效力未见显著改变。长期稳定性良好，4℃放置6、12、18、24、30月后，理化性质稳定，小鼠效力未见显著改变。说明其有效期达到2年以上。结果见表6、7。
表1甲乙肝联合疫苗理化检测结果疫苗批号甲肝:乙肝 pH值 铝含量游离甲醛(EU:ug)(mg/ml) (ug/ml)甲乙联苗001 320:10 6.95 0.66 0.181甲乙联苗002 640:10 6.93 0.76 0.184甲乙联苗003 1280:10 6.41 0.66 0.181甲乙联苗004 2560:10 6.57 0.86 0.189甲乙联苗005 1280:5 6.68 0.74 0.188甲肝疫苗 640 6.76 0.70 0.190乙肝疫苗10 6.54 1.37 0.186表2 甲乙肝联合疫苗豚鼠安全实验结果观察天数 体重(g)疫苗批号 甲肝:乙肝 动物 1 2 3 4 5 6 7 注射 到期 结果(EU:ug) 号 前甲乙联苗 640:101 - - - - - - - 242.5 248.5 健存006-1 2 - - - - - - - 275.5 284.5 健存甲乙联苗 640:101 - - - - - - - 266.5 280.0 健存006-2 2 - - - - - - - 227.5 239.5 健存甲乙联苗 320:101 - - - - - - - 301.0 315.0 健存007-1 2 - - - - - - - 188.5 197.5 健存甲乙联苗 320:101 - - - - - - - 278.5 285.5 健存007-2 2 - - - - - - - 178.5 199.0 健存对照1 - - - - - - - 297.5 302.0 健存2 - - - - - - - 277.5 287.5 健存注“-”表示无异常，“+”表示异常表3甲乙肝联合疫苗小鼠安全性实验结果
注“-”表示无异常，“+”表示异常表4甲乙肝联合疫苗恒河猴安全性实验结果疫苗 检测项目时间(周)0 2 4 6 8 12 16 20 24 28 32甲乙联苗 ALT/GPT(U/L)10.5 19.0 20.8 20.0 20.3 19.024.325.316 31.529.5AST/GOT(U/L)27.3 24.5 30.3 25.0 22.3 17.526.821.023.825 21.5P.C - - - - -史克甲乙联苗 ALT/GPT(U/L)26.0 30.0 25.5 15.3 19.3 35.521.523.033.525.823.3AST/GOT(U/L)37.0 36.0 34.8 30.8 31.3 30.532.537.330.531.024.0P.C - - -甲肝疫苗 ALT/GPT(U/L)22.0 23.5 22.0 26.0 38.0 26.039.526.019.532.013.0AST/GOT(U/L)37.0 36.5 38.5 32.5 38.0 27.530 33.524.526.532.5P.C - - - - -乙肝疫苗 ALT/GPT(U/L)15.0 24.5 14.5 18.0 20.5 15.512.014.016 21.541.0AST/GOT(U/L)30.5 25.5 28.0 30.5 32.5 27.026.528.531.534.027.5P.C - - - - -“-”表示肝组织无病理改变表5甲乙肝联合疫苗效力实验结果分组 甲肝ED50乙肝ED50(EU:ug)稀释倍数 EU稀释倍数 ug甲乙联苗(1280:10) 23.6 54.2 10.7 0.94甲乙联苗(640:10) 18.0 35.6 18.0 0.56甲乙联苗(320:10) 7.9 40.5 13.0 0.77甲肝疫苗(1280) 21.5 59.5甲肝疫苗(640) 14.83 43.16史克甲乙联苗(720:20) 9.8 73.5 22.3 0.90乙肝疫苗(10) 19.3 0.52Al(OH)3对照表6甲乙联苗37℃加速稳定性ED50检测结果疫苗批号 37℃放置时 甲肝ED50乙肝ED50间(天) 稀释倍数EU 稀释倍数 ug甲乙联苗 11 31.62 20.24 27.630.36成人装量 15 7.9480.61 31.620.32006-1 19 31.62 20.24 45.200.2227 19.81 32.31 35.350.28甲乙联苗 11 29.28 21.86 31.620.32儿童装量 15 11.79 54.28 10.770.93006-2 19 ＞6456.090.1827 26.48 24.17 11.850.84表7甲乙联苗长期稳定性ED50检测结果疫苗批号 4℃放置时间 甲肝ED50 乙肝ED50(月) 稀释倍数 EU 稀释倍数ug甲乙联苗 6 50.79 12.60 45.80 0.22成人装量 1248.33 13.24 25.08 0.40006-1 1838.31 16.71 49.17 0.202420.35 31.45 ＞64308.83 72.48 43.07 0.23甲乙联苗 6 39.42 16.24 32 0.31儿童装量 1230.20 21.19 12.70 0.78006-2 1820.43 31.32 19.46 0.512414.32 44.69 49.75 0.20307.89 81.12 16 0.635)因二者共同吸附于Al(OH)3上，可使接种者注射的Al(OH)3总含量减少一半，总体上减轻了接种者因铝佐剂所致的局部反应，增加了含铝疫苗接种的可接受性。
6)本疫苗采用2-苯氧乙醇作为防腐剂，避免了硫柳汞对婴儿具有的低度神经发育毒性的潜在危险性。
7)本方法制备工艺简单，适合于大规模生产。
综上所述，本发明提供的甲乙肝联合疫苗具有甲、乙型肝炎双重特异性保护性能，是同时预防这甲、乙肝炎两种疾病的联合疫苗。接种本疫苗时，减少了接种针次，简化了免疫程序，提高了接种率，给医务工作者和接种者都带来了极大的方便。接种本疫苗后，二者互为佐剂，免疫原性得到增强，全程免疫达到或超过单价疫苗的免疫效果。本发明提供的制备方法稳定可行，用该法制备的多批甲乙肝联合疫苗具有良好的安全性、免疫原性和稳定性，完全达到国家生物制品的要求。
本发明接种小鼠和恒河猴进行免疫原性的进一步研究，结果表明1、小鼠接种后抗体产生早，抗体水平高于单价疫苗。接种后2周甲乙联苗为100％阳转，乙肝单价疫苗仅有60％阳转。联合疫苗所诱导的抗体水平均高于单价对照如
图1、2所示。
2、合疫苗接种恒河猴2周后，甲肝抗体和乙肝抗体均100％阳转；接种史克联合疫苗后，第2周，甲肝抗体和乙肝抗体均只有75％阳转，4周后甲肝抗体100％阳转，6周即加强免疫一次后乙肝抗体联100％阳转；接种甲肝疫苗后，第二周甲肝抗体未阳转，第4周完全阳转；接种乙肝疫苗后，2周阳转率为0，4周为50％，6周即加强免疫一次后完全阳转。联合疫苗免疫恒河猴后所诱导的甲肝抗体产生水平与国外同种疫苗对照和甲肝对照相当；所诱导的乙肝抗体水平高于单价乙肝疫苗，和国外同种疫苗对照相当，见表8、表9。
表8恒河猴免疫后甲肝抗体产生情况时间抗体阳转率(％) 甲肝抗体GMT(周)甲乙 史克甲 甲肝甲乙联苗史克甲乙联苗 甲肝疫苗联苗 乙联苗 疫苗2 100 75 0 14 100 100 100 1:32.00 1:32 1:32.006 100 100 100 1:362.041:512 1:512.008 100 100 100 1:608.871:430.54 1:256.0012 100 100 100 1:256.001:304.44 1:512.0016 100 100 100 1:107.631:90.51 1:128.0020 100 100 100 1:64.00 1:64.00 1:45.2524 100 100 100 1:53.82 1:53.82 1:64.0028 100 100 100 1:1024.00 1:2896.31 1:2048.0032 100 100 100 1:1024.00 1:1448.15 1:1448.1536 100 100 100 1:512.001:861.08 1:512.00
表9恒河猴免疫后乙肝抗体产生情况时间 抗体阳转率(％) 乙肝抗体GMT(周) 甲乙 史克甲 乙肝疫 甲乙联苗 史克甲乙联乙肝疫苗联苗 乙联苗 苗苗2 100 75 0 14 100 75 50 1:22.63 1:1.411:6.736 100 100 100 1:724.08 1:512.00 1:215.278 100 100 100 1:430.54 1:362.04 1:107.6312100 100 100 1:608.87 1:256.00 1:430.5416100 100 100 1:128.00 1:90.51 1:256.0020100 100 100 1:128.00 1:22.63 1:181.0224100 100 100 1:107.63 1:22.63 1:128.0028100 100 100 1:1024.00 1:512.00 1:1439.5932100 100 100 1:427.99 1:181.02 1:512.0036100 100 100 1:362.04 1:128.00 1:430.具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步描述。
实施例1按下列工艺方法制备甲型、乙型肝炎联合疫苗A、先将人胚肺二倍体细胞株(KMB17)种子批细胞接种转瓶培养，至细胞长成单层，再将甲肝病毒毒种HAV吕-8株的P26代工作种子批毒种经冻融超声后，按1∶5的体积比接种于人胚肺二倍体细胞(KMB17)上，在35℃培养16天收获病毒液，其抗原滴度1∶1024，感染性滴度7.73CID50/ml；B、将上述病毒液经冻融、超声破碎、核酸酶消化、氯仿抽提、PEG浓缩、DEAE Sepharose FF层析，用1∶4000的甲醛37℃灭活12天获得甲型肝炎纯化抗原，其滴度为1∶512～1∶1024；C、在上述甲肝纯化抗原中加入0.5mg/ml的Al(OH)3振摇吸附2小时，调整离子强度氯化钠含量0.8mg/ml和溶液酸碱度的pH值7.0，制成含量为640～2560EU/ml的吸附甲肝灭活抗原，待用；D、将重组酵母表达的含量为20～30ug/ml的吸附乙肝表面抗原和C步骤所得的吸附甲肝灭活抗原以及疫苗用辅料按下列配比混合后，在20℃振摇2小时，即得甲肝抗原含量为320EU/ml，乙肝抗原含量为10ug/ml的联合疫苗吕8株HAV抗原 320EU/mlHBs抗原 10ug/ml氢氧化铝 0.5mg/ml2-苯氧基乙醇 4.0mg/ml吐温-20 0.04mg/ml甘氨酸 2.0mg/ml氯化钠 0.8mg/ml。
实施例2按下列工艺方法制备甲型、乙型肝炎联合疫苗A、先将人胚肺二倍体细胞株(KMB17)种子批细胞接种转瓶培养，至细胞长成单层，再将甲肝病毒毒种HAV吕-8株的P26代毒种经冻融超声后，按1∶10的体积比接种于人胚肺二倍体细胞(KMB17)上，在35℃培养16天收获病毒液，其抗原滴度1∶1024，感染性滴度7.73CID50/ml；B、将上述病毒液经冻融、超声破碎、核酸酶消化、氯仿抽提、PEG浓缩、DEAE Sepharose FF层析，用1∶4000的醛37℃灭活12天获得甲型肝炎纯化抗原，其滴度为1∶512～1∶1024；C、在上述甲肝纯化抗原中加入1.0mg/ml的Al(OH)3振摇吸附4小时，调整离子强度氯化钠含量0.85mg/ml和溶液酸碱度的pH值7.5，制成含量为640～2560EU/ml的吸附甲肝灭活抗原，待用；D、将市售的含量为20～30ug/ml的吸附乙肝表面抗原和C步骤所得的吸附甲肝灭活抗原以及疫苗用辅料按下列配比混合后，在40℃振摇4小时，即得甲肝抗原含量为1280EU/ml，乙肝抗原含量为5ug/ml的联合疫苗吕8株HAV抗原 1280EU/mlHBs抗原 5ug/ml氢氧化铝1.5mg/ml2-苯氧基乙醇6.0mg/ml吐温-200.06mg/ml甘氨酸 4.0mg/ml氯化钠 0.85mg/ml。
实施例3制备方法同实例1，按下列配比混合后，在20～40℃振摇1小时，即得甲肝抗原含量为640EU/ml，乙肝抗原含量为10ug/ml的联合疫苗吕8株HAV抗原 640EU/mlHBs抗原 10ug/ml氢氧化铝 1.0mg/ml2-苯氧基乙醇 5.0mg/ml吐温-20 0.05mg/ml甘氨酸3.0mg/ml氯化钠0.9mg/ml。
权利要求
1.一种甲型、乙型肝炎联合疫苗，其特征在于它由下列成分组成吕-8株HAV抗原 320～1280ELU/mlHBs抗原 5～10ug/ml氢氧化铝 0.5～1.5mg/ml2-苯氧基乙醇 4.0～6.0mg/ml吐温-20 0.04～0.06mg/ml甘氨酸2.0～4.0mg/ml氯化钠0.8～0.9mg/ml。
2.一种制备甲型、乙型肝炎联合疫苗的工艺方法，其特征在于采用下列工艺步骤制得A、将甲肝病毒毒种HAV吕-8株的P26代毒种经冻融超声后，按1∶5～50的体积比接种于人胚肺二倍体细胞(KMB17)上，在35℃培养12～16天收获病毒液；B、将上述病毒液经冻融、超声破碎、核酸酶消化、氯仿抽提、PEG浓缩、DEAE Sepharose FF层析，用1∶4000的甲醛37℃灭活12～15天获得甲型肝炎纯化抗原；C、在上述甲肝纯化抗原中加入0.5～1.0mg/ml的Al(OH)3振摇吸附1～4小时，调整离子强度氯化钠含量0.8～0.9mg/ml和溶液酸碱度的pH值7.0～8.0，制成含量为640～2560EU/ml的吸附甲肝灭活抗原，待用；D、将重组酵母表达的含量为20～30ug/ml的吸附乙肝表面抗原和C步骤所得的吸附甲肝灭活抗原以及疫苗用辅料按上述配比混合后，在20～40℃振摇1～4小时，即得甲肝抗原含量为320～1280EU/ml，乙肝抗原含量为5～20ug/ml的联合疫苗。
全文摘要
本发明提供一种甲型、乙型肝炎联合疫苗，它具有甲、乙型肝炎双重特异性保护性能，是同时预防这甲、乙肝炎两种疾病的联合疫苗。接种本疫苗时，减少了接种针次，简化了免疫程序，提高了接种率，给医务工作者和接种者都带来了极大的方便。接种本疫苗后，二者互为佐剂，免疫原性得到增强，全程免疫达到或超过单价疫苗的免疫效果。本发明提供的制备方法稳定可行，用该法制备的多批甲乙肝联合疫苗具有良好的安全性、免疫原性和稳定性，完全达到国家生物制品的要求。
文档编号A61K39/295GK1596978SQ200410040308
公开日2005年3月23日 申请日期2004年7月23日 优先权日2004年7月23日
发明者褚嘉祐, 张华远, 陈统球, 汪恩浩, 史荔, 毛群颖, 黄小琴 申请人:中国医学科学院医学生物学研究所