抗乙型肝炎病毒的疫苗的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫原性HBV肽组合物以及使用该组合物来治疗HBV。
【背景技术】
[0002] 乙型肝炎病毒（HBV)感染是欧洲和全世界的肝脏相关的发病率和死亡率的一个 主因。估计每年有650000个个体死于肝功能衰竭或肝细胞癌。尽管疫苗接种计划已经在 许多国家使得HBV感染开始减少，但是由于来自流行地区的HBV携带者的移民，慢性乙型肝 炎（CHB)在欧洲是一个迅速增长的问题。
[0003] 从概念的观点来看，慢性HBV感染可分为三个阶段（或免疫应答类型）：免疫耐 受、免疫活性和非活性慢性携带者。这些不同的慢性感染的阶段对应于特性血清学图案并 且与患者对HBV的免疫应答相关。通常，患有持续免疫活性慢性HBV感染的患者接受HBV 治疗。
[0004] 有限的治疗方案可用于慢性乙型肝炎（CHB)。利用抗病毒药物（诸如，a-干扰素 和核苷/核苷酸类似物（NUC))来抑制病毒复制是降低慢性HBV感染的发病率和死亡率的 唯一途径，其终极目标是改善生存。然而，血清HBsAg的损失和抗HBs抗体的发展（血清转 化）是对HBV感染的成功免疫应答的标志和临床治愈的最接近结果。仅a-干扰素已经能 够诱导显著的HBsAg损失，但只对于相对较低比例（〈10%)的患者是这样的。干扰素具有 高成本、低耐受性，并且一些HBV基因型仍然很差地应答治疗。
[0005] 因此，NUC仍然是主要的治疗策略，其中在欧洲五个NUC被批准治疗CHB。最有效 的和优选的药物（替诺福韦和恩替卡韦）具有非常有利的副作用分布并且能够在几乎所有 的患者中诱导HBVDNA抑制。然而，在大多数国家和国际准则下，对于大多数患者需要终生 治疗。即使在NUC治疗的几年之后，只有极少数的HBeAg阳性患者，并且没有HBeAg阴性患 者，能够清除HBsAg。NUC治疗的长期安全性目前是未知的。因此，迫切需要能够及时停止 NUC疗法的概念。
[0006] 治疗性疫苗接种是对于乙肝的一种有前途的干预，以此来诱导对于疾病的免疫控 制。T细胞应答已被证明对于急性HBV感染的清除是至关重要的。然而，即使是在有效的抗 病毒治疗下，基于HBsAg的治疗性HBV疫苗尚未能示出出益处，这是因为来自高水平的循环 HBsAg的被诱导的免疫耐受性。
【发明内容】
[0007] 本发明人已经识别出HBV蛋白质组的一些区域，这些区域在不同的HBV基因型之 间具有高度保守性，并且与HBV蛋白的其它类似保守区域相比，具有预料不到的更好的免 疫原性性质。特别地，发明人使用体外测定出乎意料地表明，HBV聚合酶和HBV核心蛋白的 特定结构域内的肽序列能够在来自感染了不同HBV基因型的慢性感染HBV的患者和/或来 自不同种族的慢性感染HBV患者的PBMC中引发应答。特别地，本发明人已经令人惊讶地识 别了HBV聚合酶的末端结构域中的免疫显性区。
[0008] 因此，本发明提供了一种包含长度为15至60个氨基酸的至少两种肽的药物组合 物，所述肽选自包括SEQIDNOs. 1-4中所示的序列之一或与SEQIDNOs. 1-4中所示的序列 之一具有至少80%同一性的序列的至少15个连续氨基酸的序列的肽（或者所述肽选自包 括SEQIDNOs. 1-4中所示的序列之一的至少15个连续氨基酸的序列或与SEQIDNOs. 1-4 中所示的序列之一具有至少80%同一性的序列的肽），其中，每个肽包含至少一个⑶8+T细 胞表位和/或至少一个CD4+T细胞表位，并且其中，每个肽在体外测定中在来自至少一种慢 性感染HBV个体的外周血单核细胞（PBMC)中引发应答。
[0009] 所述组合物可以包括包含SEQIDNOs. 1-3中所示的序列之一的至少15个氨基酸 的至少一个肽以及包含在SEQIDN0 :4中所示序列的至少15个氨基酸的至少一个肽。
[0010] 所述肽中的至少一个可以包括SEQIDNOs. 24-33之一中所示的序列，或与SEQID NOs. 24-33中所示序列之一具有至少80%同一性的序列。所述肽中的一个或多个可以包括 位于N-末端和/或C-末端的一个或多个氨基酸以增加净正电荷和/或减少肽的疏水性。 因此，该组合物可以包括包含SEQIDNOs:34至38之一中所示的序列的肽。
[0011] 该组合物可以进一步包含衍生自表面蛋白的至少一个肽。衍生自HBV表面蛋 白的肽的长度可以是15至60个氨基酸，并且包括SEQIDN0 :55中所示的序列的至少15个 连续氨基酸的序列或与SEQIDN0 :55中所示序列的至少15个连续氨基酸具有至少80%同 一性的序列，其中，所述肽包含至少一个⑶8+T细胞表位和/或至少一个⑶4+T细胞表位， 并且在体外测定中在来自至少一个慢性感染HBV的个体的外周血单核细胞（PBMC)中引起 应答。
[0012] 组合物，其中所述组合物能够在来自不同种族的至少两个个体以及来自感染有不 同HBV基因型的两个个体的PBMC中引发免疫应答。
[0013] 该组合物能够在以下中引发免疫应答：(a)在来自感染HBV基因型A的个体、感染 HBV基因型B的个体、感染HBV基因型C的个体、和感染HBV基因型D的个体中的两个、三 个或全部的PBMC中；和/或在来自感染HBV的东方或印度个体、感染HBV的高加索人（白 人）个体、和感染HBV的非洲或阿拉伯个体中的两个、三个或全部的PBMC中。
[0014] 在本发明的组合物中的肽可以连接至碳氟化合物载体。该组合物可以进一步包括 HBc、HBe或HBs抗原和/或佐剂。
[0015] 本发明提供了本发明的用于HBV感染的治疗或预防的组合物，特别是用于HBeAg 阴性患者或HBeAg阳性患者的治疗。本发明的组合物可与以下组合使用：（i)a干扰素和 /或核苷/核苷酸类似物（NUC);和/或（ii)抗PD1阻断抗体、抗CTLA4阻断抗体、抗TOIL 阻断抗体、抗LAG3阻断抗体、抗TM3阻断抗体和/或环磷酰胺。利用该组合物的治疗可导 致HBsAg损失或HBsAg血清转换。
[0016] 本发明还提供了本发明的用于终末期肝病或肝细胞癌的治疗或预防或用于丁型 肝炎病毒（HDV)感染的治疗或预防的组合物。
[0017] 一种治疗或预防HBV感染的方法，该方法包括给予需要其的受试者治疗有效量的 根据本发明的组合物，并且还提供了根据本发明的组合物在制备用于治疗或预防HBV的药 物中的应用。
[0018] 此外，本发明提供了长度为15到60个氨基酸的肽，包含SEDIDNOs:1-4中任一 个中所示的序列，或与在SEDIDNOs:1-4中所示序列之一具有至少80%同一性的序列的 至少15个连续氨基酸，所述肽包含至少一个⑶8+T细胞表位和/或至少一个⑶4+T细胞表 位，并且能够在体外测定中在来自至少一个慢性感染HBV的个体的外周血单核细胞（PBMC) 中引发应答。该肽可以包含SEDIDNO:5、6、14或15所示的序列的至少15个连续氨基酸。
[0019] 本发明还提供了包含SEQIDNOs:24至38中所示的序列之一或与SEQIDNOs: 24至38所示的序列之一具有至少80%同一性的序列。
[0020] 本发明的肽可以被共价连接至碳氟化合物载体。
【附图说明】
[0021] 图1是处于免疫控制阶段或正在进行积极治疗的慢性HBV感染的受试者的IFNY 应答的比较。在利用HBV衍生的重叠短肽池库（0.1yg/肽/mL)进行10天培养之后，在 18h的IFNyELISpot(酶联免疫斑点）测定法中，对PBMC进行再刺激（5yg/肽/毫升）， 其中重叠肽的池1至23之一代表HBV蛋白质组的特异性区域。
[0022] 图2示出了对于在通过感染HBV基因型分组的HBV感染受试者中的HBV衍生的短 肽池的IFNy应答的特异性。在利用HBV衍生的重叠短肽池库（0. 1yg/肽/mL)的10天 培养之后，在18h的IFNyELISpot测定法中，对PBMC进行再刺激（5yg/肽/毫升），其中 重叠肽的池1至23之一代表HBV蛋白质组的特异性区域。
[0023] 图3示出了对于在通过种族背景分组的慢性HBV感染受试者中的HBV衍生短肽池 的IFNy应答。在利用HBV衍生的重叠短肽池库（0. 1yg/肽/mL)的10天培养之后，在 18h的IFN丫ELISpot测定法中，对PBMC进行再刺激（5yg/肽/毫升），其中重叠肽的池1 至23之一代表HBV蛋白质组的特异性区域。
[0024] 图4示出了在利用HBV聚合酶-和核心衍生的短肽池进行刺激之后，在来自慢性 HBV和健康对照受试者的PBMC中的⑶4和⑶8T细胞的IFNy生产的代表性点图。利用短 肽池库（0. 1Ug/肽/mL)对来自受试者的PBMC刺激10天，随后利用HBV衍生的短肽池2或 14进行过夜刺激（5yg/肽/mL)，分别代表HBV聚合酶和核心的区域。结果表示为IFNY 产生细胞，作为亲本⑶3/⑶4或⑶3/⑶8T细胞群的百分比。培养基或PMA/伊屋诺霉素中 的刺激分别被用作阴性和阳性对照，并且门控策略是基于阴性对照IFNY生产。
[0025] 图5是在来自健康受试者和免疫控制期或经受积极治疗的慢性HBV感染的HBeAg 阴性患者的PBMC中对于HBV衍生的短肽池的IFNy应答的比较，该短肽池代表35-40mer 肽。在利用HBV衍生的重叠短肽池库（0. 1yg/肽/mL)的10天培养之后，在18h的 IFN丫ELISpot测定法中，对PBMC进行再刺激（5yg/肽/毫升），其中重叠肽的池24至46 之一各自代表HBV蛋白质组的35-40mer区域。
[0026] 图6示出了对于在通过感染HBV基因型分组的HBV感染受试者中的表示35-40mer 肽的HBV衍生的短肽池的IFNy应答的特异性。在利用HBV衍生的重叠短肽池库（0. 1yg/ 肽/mL)的10天培养之后，在18h的IFNyELISpot测定法中，对PBMC进行再刺激，其中重 叠肽的池24至46之一各自代表HBV蛋白质组的特定区域。
[0027] 图7示出了对于在通过种族背景分组的慢性HBeAg阴性HBV感染的受试者中的 表示35-40mer肽的HBV衍生的短肽池的IFNy应答。在利用HBV衍生的重叠短肽池库 (〇? 1yg/肽/mL)的10天培养之后，在18h的IFN丫ELISpot测定法中，对PBMC进行再刺激 (5yg/肽/mL)，其中重叠肽的池24至46之一各自代表HBV蛋白质组的35-40mer区域。
[0028] 图8是由来自HBV感染的受试者的PBMC进行的对于代表35-40mer肽的各个短肽 池的的细胞因子应答的总结。在利用HBV衍生的短肽池库进行10天短期培养之后，来自 慢性eAg阴性HBV感染的受试者（n= 7-14)的PBMC被进行培养过夜，其中利用最终浓度 为 5yg/ 肽/mL的HBV肽池 25、38、26、39、42、43、28 和 31 (代表肽P113、P753、P151、P797、 P856、P877、P277和P376)之一。细胞被染色，用于⑶3、⑶4和⑶8的细胞外表达，接着是 IFNy、IL_2和TNFa的细胞内表达。通过流式细胞仪对细胞进行评估。细胞因子的表达 针对每个受试者被标准化为媒介阴性对照。数据表示针对每个被评价因子的平均表达。应 答的广度示出为在每个堆叠柱状图上。
[0029] 图9示出了IFNy斑点形成细胞的数量（平均值），其在来自慢性HBV感染（HBeAg 阴性无活性携带者（无活性载体）或HBeAg阴性治疗患者）的PBMC中测量。在利用九个未 共轭（未轭合）的 肽（NP113、NP151、NP277(K)、NP376、NP753(K)、NP797(K)、NP856(K)、 NP877和NP1266(K)) (0? 1yg/肽/毫升）进行10天培养之后，在18h的IFNyELISpot测 定法中，对PBMC进行再刺激，其中各个肽的浓度为5yg/ml。
[0030] 图10示出了响应于在来自慢性HBV感染（HBeAg阴性无活性携带者或HBeAg阴性 治疗受试者）的PBMC中测量的HBV肽的对于IFNyELISpot测定法的应答的频率。在利 用九个未共轭的 肽（NP113、NP151、NP277 (K)、NP376、NP753 (K)、NP797 (K)、NP856 (K)、 NP877和NP1266(K)) (0? 1yg/肽/毫升）进行10天培养之后，在18h的IFNyELISpot测 定法中，对PBMC进行再刺激，其中各个肽的浓度为5yg/ml。
[0031] 图11示出了IFNY斑点形成细胞的数量（平均值），其是在来自通过感染HBV基 因型分组的慢性HBV感染受试者的PBMC中测量的。在利用九个未共轭的HBV肽（NP113、 NP151、NP277(K)、NP376、NP753(K)、NP797(K)、NP856(K)、NP877 和NP1266(K))(0? 1yg/ 肽 /毫升）进行10天培养之后，在18h的IFN丫ELISpot测定法中，对PBMC进行再刺激，其中 各个肽的浓度为5yg/ml。
[0032] 图12示出了IFNy斑点形成细胞的数量（平均值），其是在来自通过种族背景分 组的慢性HBV感染受试者的PBMC中测量的。在利用九个未共轭的HBV肽（NP113、NP151、 NP277 (K)、NP376、NP753 (K)、NP797 (K)、NP856 (K)、NP877 和NP1266 (K)) (0? 1yg/ 肽 / 毫升） 进行10天培养之后，在18h的IFN丫ELISpot测定法中，对PBMC进行再刺激，其中各个肽的 浓度为5yg/ml。
[0033] 图13示出了在利用HBV衍生的肽进行刺激之后在来自慢性HBV的PBMC中的产 生细胞因子的⑶4+和⑶8+T细胞的频率。图13A、13B、13C、13D和13E对应于针对通过 HBV基因型A、B、C、D和非A/B/C/D感染的个体的群获得的结果。在利用九个未共轭的HBV 肽（NP113、NP151、NP277(K)、NP376、NP753(K)、NP797(K)、NP856(K)、NP877 和NP1266(K)) (0. 1yg/肽/毫升）进行10天培养之后，在18h的IFNyELISpot测定法中，对PBMC进行 再刺激，其中各个肽的浓度为5yg/ml。结果表示为产生细胞因子的细胞，作为亲本CD3/ CD4或CD3/CD8+T细胞群的百分比。在培养基或PMA/伊屋诺霉素中的刺激分别被用作阴性 和阳性对照，并且门控策略是基于阴性对照IFNy生产。
[0034] 图14示出了通过来自利用FP-02. 1或NP02. 1免疫的BALB/c小鼠（n= 7)的脾 细胞进行的IFNy生产。视图表示了每106个脾细胞IFNy斑点形成细胞的数量，其是在 疫苗的9个肽组分的应答中测量的。采用配对t检验（ns=不显著）来进行统计分析。
[0035] 图15示出了通过来自利用FP-02. 1或NP02. 1免疫的BALB/c小鼠（n= 7)的脾 细胞进行的IFNy生产。视图表示了每106个脾细胞IFNy斑点形成细胞的数量，其是在 疫苗的9个肽组分的应答中测量的。柱代表每个单独的肽的累积中位应答。
[0036] 图16示出，FP02. 1在单次免疫后促进了对于由MHCI类分子限制的CTL表位的T 细胞应答。
[0037] 图17示出了通过利用FP-02. 1或NP02. 1免疫的BALB/c小鼠进行的IFNy生产。 在对于九个肽的混合物的应答中产生IFNySFC/106脾细胞的数量，针对每个脾细胞种群。
[0038] 序列表的简要描述
[0039]SEQIDNOs:1至38和40至72是HBV聚合酶的SEQIDN0 :39中所示的参考HBV 序列的区域的氨基酸序列，如下面的表1中所示。
[0040]
[0041]
[0042]
[0043] SEQIDNO:39是通过聚合酶的末端结构域（位置1至181)、聚合酶的逆转录酶结 构域（位置182至549)、聚合酶的RNA酶结构域H(位置550至702)、核心蛋白（位置703 至914)、X蛋白（位置915至1068)和表面蛋白（位置1069至1468)的线性共组装建立的 虚拟HBV蛋白质序列。从由基因型A、B、C和D共有序列生成的共有序列的共有获得蛋白质 组序列。
[0044] SEQIDNOs:73至219是池1至46中的每一个内的短肽的氨基酸序列。SEQID NO: 220是池5的氨基酸序列。
【具体实施方式】
[0045] 肽组合物
[0046] 本发明提供了广泛包含免疫原性肽序列的组合物，该免疫原性肽序列能够引发多 表位⑶4+和⑶8+T细胞免疫应答，在人口覆盖和HBV基因型覆盖方面具有广泛应用。本发 明提供了一种药物组合物，包括：来自长度为15到60个氨基酸的至少一种肽，其中，所述肽 包含HBV聚合酶的末端结构域的至少15个连续氨基酸的片段、HBV聚合酶的逆转录酶结构 域、HBV聚合酶或HBV核心蛋白的RNA酶H结构域序列。所述肽的长度为15至60个氨基 酸，并选自包含在SEQIDNOs:1至4中所示的序列之一的至少15个连续氨基酸的序列的 肽。该肽包含至少一个CD8+T细胞表位和/或至少一个CD4+T细胞表位。该肽在体外测定 方法中在来自至少一个慢性感染的HBV个体的外周血单核细胞（PBMC)中引发应答。
[0047] 该组合物可包含具有上文定义的性质的多个肽。该组合物能够在来自不同种族的 至少两个个体和/或来自感染了不同HBV基因型的至少两个个体的外周血单核细胞（PBMC) 中引发免疫应答。
[0048] 肽序列
[0049] 本发明