的组合物可以包含一种或多种肽，其包含至少15个连续氨基酸，诸如，至 少 20、25、29、30、31、32、33、34或35个来自5￡〇10勵8:1到4之一的氨基酸。5￡〇10勵8: 1、2和3是HBV聚合酶序列。SEQIDN0:4是HBV核心蛋白序列。
[0050] 这些区域可被进一步细分，使得存在于本发明的组合物中的肽可包含来自SEQID NOs:5至13之一的至少15、20、25、30、32、33、34或35个氨基酸。优选地，来自这些子区域 内的肽包含SEQIDNOs: 14至23之一中的序列。
[0051]SEQIDNOs:1至4中的示例性短肽示出在SEQIDNOs:80至117和142至184 中。优选的示例性短肽示出在3￡〇10勵8:80至83、86至89、98至101、105到112、146至 150、163至166、169至181中。本发明的组合物可以包含肽，所述肽含有这些短序列中的一 个或多个。
[0052] 来自这些HBV聚合酶序列的特别优选的肽包括在SEQIDNOs:24至29中所示的序 列中的一个。SEQIDN0:24 是SEQIDN0s:l、5 和 14 的优选区域。SEQIDN0:25 是SEQ IDNOs:1、6 和 15 的优选区域。SEQIDNO:26 是SEQIDNOs:2、7 和 16 的优选区域。SEQ IDNO:27 是SEQIDNOs:2、8 和 17 的优选区域。SEQIDNO:28 是SEQIDNOs:2、9 和 18 的优选区域。SEQIDNO:29是SEQIDNOs:3和19的优选区域。
[0053] 来自上面的HBV核心蛋白序列（SEQIDN0:4)的特别优选的肽包含在SEQID NOs:30-33中所示的序列中的一个。SEQIDNO:30是SEQIDNOs:10和20的优选区域。 SEQIDN0 :31 是SEQIDNOs:11 和 22 的优选区域。SEQIDN0 :32 是SEQIDNOs:12 和 22的优选区域。SEQIDN0 :33是SEQIDNOs:13和23的优选区域。
[0054] 其它优选的肽包括在SEQIDNOs:24至33中所示的序列内，并且包括这样的肽， 该肽包含来自这些序列之一中的至少20个（诸如25、29、30、31、32、33或34个）连续氨基 酸。
[0055] 该组合物可以进一步包括长度为15至60个氨基酸的至少一个肽，其中，所述肽包 含HBV表面蛋白的至少15个连续氨基酸的片段。HBV表面蛋白肽典型地是15到60个氨基 酸的长度，并且选自包含SEQIDN0 :55中所示序列的至少15个连续氨基酸的序列的肽。
[0056]HBV表面蛋白肽可以包含来自SEQIDN0 :55之一，优选来自SEQIDN0 :71的至 少 15、20、25、30、32、33、34 或 35 个氨基酸。
[0057]SEQIDNOs:55和71中的示例性短肽分别示出在SEQIDNOs:204至210以及 205至209中。本发明的组合物可以包含肽，该肽含有这些短序列中的一个或多个。
[0058] 来自这些HBV表面蛋白序列的特别优选的肽包括在SEQIDN0 :221中所示的序列 中的一个。SEQIDN0 :221是SEQIDNOs:55和71的优选区域。
[0059] 可以包括在本发明的组合物中的更进一步的肽是包含这样的序列的肽，该序列含 有一个或多个（诸如两个、三个或四个）氨基酸取代、添加或缺失（优选取代）（在SEQID NOs:1至33、55、71和221之一中所示的序列中的一个中）。连续序列中的一个、两个、三个 或更多个氨基酸可以被取代。指定序列中的取代包括突变以去除半胱氨酸残基。例如，半 胱氨酸残基可被丝氨酸残基取代。
[0060] 典型地，这样的肽将与SEQIDNOs:1至33、55、71和221之一中的至少15或 20,诸如，25、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个连续氨基酸或与5￡01〇勵8: 24至33和221中所示的序列之一的整个长度具有至少80 %，诸如，至少85 %、90 %、95 % 或98%的序列同一性（例如，如使用可在国家生物技术信息中心（NationalCenterfor BiotechnologyInformation) (blast,ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上获得的BLAST所 确定的）。这样的肽包括匹配HBV聚合酶或核心蛋白的等效区域中的HBV基因型A、B、C、 D、E或F的氨基酸序列的序列。
[0061] 所述肽可以包括另外的序列，条件是它们的总长度不超过60个氨基酸。例如，所 述肽可以包含至少20,诸如，25、29、30、31、32、33、34或35个连续氨基酸，其来自3￡0 1〇NOs:1至33、55、71和221之一所示的序列中的一个，优选SEQIDNOs:24至33和221，并 且可以具有的长度为15、20或25个氨基酸至可达30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、 45、50、55或60个氨基酸。
[0062] 因此，所述肽通常具有的长度为15或20至60个氨基酸，诸如，25至50个氨基酸， 优选30至40个氨基酸，例如31，32, 33, 34, 35, 36, 37, 38或39个氨基酸。
[0063] 所述肽可以包括额外的序列。所述额外的序列可有利于肽的制造或配制或增强肽 的稳定性。例如，所述肽可以包括一个或多个额外的氨基酸，通常在N末端和/或C-末端， 以增强肽的净正电荷和/或减少该肽的疏水性。净正电荷可以被增加，使得该肽具有大于 或等于7的等电点。
[0064] 在本发明的一个方面，将一个或多个（诸如，两个或三个）带正电荷的氨基酸（精 氨酸和/或赖氨酸）加入到组合物中的所述肽中的一个或多个的N末端和/或C末端。例 如，三个赖氨酸残基可被加入到肽中的一个或多个的N末端和/或C末端。阳性氨基酸通 常在肽的一个或多个末端处加入，其具有超过65%的总疏水性、小于零的净电荷和/或包 括疏水性氨基酸簇。
[0065]SEQIDNOs:34至38和222中示出了包括N-和/或C-末端赖氨酸残基的肽的 具体实例。
[0066] 所述肽可以包括一个或多个表位，其不存在于共有HBV序列中。一个这样的实 例是融合肽的使用，其中，混杂的T辅助表位被共价地连接（可选地，通过多肽接头或间 隔物）至共有序列。作为一个实例，混杂的T辅助表位可以是PADRE肽、破伤风类毒素肽 (830-843)、或流感血细胞凝集素，HA(307-319)。
[0067]在所述肽被连接至碳氟化合物的情况下，肽的末端（诸如，未共轭至或通过其它 附接方式附接至碳氟化合物的末端）可以被改变，例如，以通过形成胶束而促进碳氟化合 物肽构建物的溶解度。为了便于大规模合成构建物，所述肽的N-或C-末端氨基酸残基可 以被改性。当期望的肽对于肽酶裂解特别敏感时，正常肽键可被不可切割的肽模拟物所代 替。这样的键以及合成方法在现有技术中是众所周知的。
[0068] 所述肽可以是天然肽。该肽可被修饰以增加寿命，诸如，体内的肽的半衰期或在给 药部位的存留，或将肽引导至抗原呈递细胞。例如，所述免疫原性肽可以包含一个或多个非 天然存在的氨基酸和/或非天然存在的共价键，以便共价地连接相邻的氨基酸。在某些实 施方式中，非标准的、非天然存在的氨基酸也可掺入到免疫原性肽中，条件是它们并不干扰 肽与MHC分子相互作用并保持与识别天然序列的T细胞的交叉反应的能力。非天然氨基酸 可被用于改进针对蛋白酶或化学稳定性的肽抗性。非天然氨基酸的实例包括D-氨基酸和 半胱氨酸修饰。
[0069] 所述肽可以结合至载体，诸如，蛋白质载体或递送载体。合适的递送载体包括脂 肽，例如，脂肪酰基链，诸如单棕榈链、病毒颗粒、脂质体和细胞穿透肽，诸如穿膜和转录的 反式激活物（TAT)。
[0070] 在本发明的组合物中的HBV肽中的一个或多个（优选全部）优选共价连接至碳氟 化合物载体。
[0071]肽的组合
[0072] 本发明的组合物可以包含多种肽。因此，该组合物可包含至少两个，诸如，至少 三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个肽，每一个包含如上所述的SEQID NOs:1至4之一的至少15个连续氨基酸的序列。该组合物可另外包含这样的肽，该肽包括 如上所述的SEQIDN0 :55的至少15个连续氨基酸的序列。
[0073] 在一个方面，所述组合物可以包含至少一种肽，其包含在SEQIDNOs:1至3所示 的序列之一的至少15个氨基酸和在SEQIDN0 :4所示的序列的至少15个氨基酸，以及可 选地包含在SEQIDN0 :55中所示的序列之一的至少15个氨基酸的至少一种肽。例如，该 组合物可以包含至少一种肽，所述至少一种肽包含在SEQIDNOs:24, 25, 26, 27, 28、29和 34中所示的序列之一的至少15个氨基酸以及在SEQIDNOs:30至33和35至38中所示 的序列之一的至少15个氨基酸。
[0074] 在另一个方面，所述组合物可以包括如上所述的包含SEQIDNOs:1和/或2的 至少15个连续氨基酸的序列的至少一种肽以及如上所述的包含SEQIDN0 :3或4的至少 15个连续氨基酸的序列的至少一种肽。例如，所述组合物可以包括如上所述的包含SEQID NO:1或2的至少15个连续氨基酸的序列的肽（或包含SEQIDNOs:5和6两者的序列的 肽）以及如上所述的包含SEQIDNOs: 10-13中的任一个的至少15个连续氨基酸的肽。本 发明可以包括如上所述的包含SEQIDNOs:5、6、7、8和9中的任何两个、三个、四个、五个、 或全部的至少15个连续氨基酸的序列的肽，和/或可以包括如上所述的包含SEQIDNOs: 10至13中的任何两个、三个、或全部的至少15个连续氨基酸的序列的肽。
[0075] 存在于本发明的组合物中的肽可以由或基本上由SEQIDNOs:24至38中所示的 序列之一组成。存在于本发明的组合物中的HBV表面蛋白肽可以由或者基本上由在SEQID NOs:221和222中所示的序列中的一个组成。因此，本发明提供了一种药物组合物，所述药 物组合物包含至少一种肽，诸如，两种或更多种肽，其由或基本上由SEQIDNOs:24至38之 一中所示的氨基酸序列组成，或者包括所述氨基酸序列；以及可选地至少一种肽，其由或基 本上由SEQIDNOs:221或222中所示的氨基酸序列组成，或者包括所述氨基酸序列。所述 组合物可以包含至少两种，诸如，三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种肽，其包含 SEQIDNOs:24至33和221中所示的序列。在一个实施方式中，包含SEQIDNOs:24至33 和221之一的肽中的一种或多种可以包括N-或C-末端赖氨酸残基。更具体地，包含SEQ IDNOs:26、29、30、31、32和221的肽可以分别具有在SEQIDNOs:34到38和222中所示 的序列。
[0076] 例如，组合物可以包括至少两种，诸如三种，四种，五种，六种，七种，八种，九种或 十种肽，其包含SEQIDNOs:24、25、27、28、33、34、35、36、37和38中所示的序列，由所述序 列组成或者基本上由所述序列组成，或者至少两个，诸如三个、四个、五个、六个、七个或八 个肽，其包含SEQID勵8:24、25、28、33、34、36、37和38，由其组成或基本上由其组成。这 些肽的任何可能的组合可以存在于本发明的组合物。优选的组合包括SEQIDNOs:24、25、 28、33和31/37中的一个或多个，诸如，任意两个、任意三个、任何四个或所有，优选地SEQ IDNO: 24和/或25。例如，SEQIDNO: 24和33的组合产生了包含结合至7个I类等位基 因和7个II类等位基因的表位的组合物。该组合物可进一步包括这样的肽，其包含SEQID NO:221或222,由其组成或者基本上由其组成。
[0077] 例如，所述组合物可以包含8个肽，其包含以下序列：SEQIDNOs:24、25、26、28、 30、31、32和33,以及可选的第九个肽，其包含SEQIDN0:222。
[0078] 这些肽中的一个，诸如，包含SEQIDNO:28的肽，可以由包含SEQIDNO:27的肽 所取代；和/或一种肽可以由包含SEQIDNO:29的肽所取代。如上所述，可以用较短的肽 (例如，一种具有取代肽的至少20个连续氨基酸的肽），或者用与取代肽的氨基酸序列在其 整个长度上具有至少80%同一性的肽来取代这些肽中的一个或多个。
[0079] 优选地，如上所述，该组合物包含来自HBV聚合酶，更优选地来自HBV聚合酶的末 端结构域的至少一种肽。在一个特别优选的实施方式中，HBV聚合酶肽包含SEQIDN0 :1内 的至少一个氨基酸序列，诸如，SEQIDN0:5、6、14、15、24或25中的至少一个序列。例如， 这样的肽可以包含在SEQID勵8:80、81、82、83、86、87、88、89、24或25之一中所示的氨基 酸序列。
[0080]HBV基因型
[0081] 组合物中的肽序列的组合提供了表位，优选CD8+和CD4+表位两者，其存在于多种 HBV基因型中。HBV基因型包括基因型A、B、C、D、E和F。例如，长肽可以包含来自至少两个 HBV基因型的表位，该HBV基因型诸如A和D(在欧洲最流行的基因型）或B和C(在亚洲最 流行的基因型）。更优选地，所述组合物包含来自至少三个HBV基因型的表位，诸如，例如， A、B和C，A、B和D，A、C和D或B、C和D。最优选地，该组合物包含来自至少HBV基因型A， B，C和D的表位。除了包括来自基因型A、B、C和D中的一个或多个的任意组合的表位的任 何组合，该组合物还可以包含基因型E、F和/或G的表位。例如，这可以通过任何合适的手 段，通过使用体外PBMC测定法来确定，如本文描述的。
[0082] 因此，本发明提供了一种组合物，其能够在来自感染HBV基因型A的个体、感染HBV 基因型B的个体、感染HBV基因型C的个体、感染HBV基因型D的个体和感染另外的HBV基 因型的个体中的两个、三个、四个或所有的PBMC中引发免疫应答。
[0083] 能够在感染HBV基因型A的个体、感染HBV基因型B的个体、感染HBV基因型C的 个体和感染HBV基因型D的个体中的两个、三个或所有中引发免疫应答的本发明的组合物 可以包括选自下列组中的至少两个，优选三个或所有的至少一种肽：
[0084] (1)包含5￡〇10勵：14、15、20、21、67、22或23的至少15个连续氨基酸的肽；
[0085] (ii)包含SEQIDN0 :14、17、18、21或67的至少15个连续氨基酸的肽；
[0086] (iii)包含SEQIDN0:14、16、60、19、20或22的至少15个连续氨基酸的肽；
[0087] (^)包含5￡〇10勵：14、15、20、21、67、22或23的至少15个连续氨基酸的肽 ；
[0088] 该组合物可进一步包括这样的肽，其包含SEQIDN0 :55或SEQIDN0 :71的至少 15个连续氨基酸。
[0089] 例如，这样的组合物可以包含选自下列组中的至少两个，优选三个或所有的肽：
[0090] ⑴包含SEQIDN0 :20、21、67、22或23的至少15个连续氨基酸的肽；
[0091] (ii)包含SEQIDN0:17或18的至少15个连续氨基酸的肽；
[0092] (iii)包含SEQIDN0 :16、60或19的至少15个连续氨基酸的肽；
[0093] (iv)包含SEQIDN0:14或15的至少15个连续氨基酸的肽；
[0094] 该组合物可以进一步包括包含SEQIDN0 :55或SEQIDN0 :71的至少15个连续 氨基酸的肽。
[0095] 包括指定序列的至少15个氨基酸的合适的肽在本文中更详细地描述，并且特别 是包括表4中提到的SEQIDNOs:24至38的肽以及SEQIDNOs:221和222的肽。
[0096] 在一个方面，本发明的组合物在来自慢性感染HBV基因型的至少一个个体、慢性 感染HBV基因型B的一个个体、慢性感染HBV基因型C的一个个体和慢性感染HBV基因型D 的一个个体的外周血液单核细胞（PBMC)中引起体外应答。这可以通过任何合适的方法来 确定，如在本文实施例中所描述的方法。所述个体可以是相同或不同种族的，优选地来自至 少两个不同的种族。所述个体可以是相同或不同的HLA亚型，优选地至少两个不同的HLA 亚型。
[0097] 种族
[0098] 本发明提供了一种能够引发至少两种，诸如三种或更多种不同种族的个体中的免 疫应答的组合物。这可以使用如在实施例中所描述的体外PBMC测定进行评估。本发明的 组合物能够在来自以下的两种、三种或所有的PBMC中引发免疫应答：感染HBV的东方或印 度人个体、感染HBV的高加索人个体、以及感染HBV的非洲或阿拉伯人个体。
[0099] 能够在感染HBV的东方或印度人个体、感染HBV的高加索人个体以及感染HBV的 非洲或阿拉伯人个体中的两种、三种或所有中引发免疫应答的本发明的组合物可以包含选 自以下组中的至少两个，优选三个或所有中的至少一个肽：
[0100] (i)包括SEQIDN0:14、16、60、17、18、20、21、67 或 22 的至少 15 个连续氨基酸的 肽；
[0101] (ii)包括SEQIDN0:14、15、19、20、22或23的至少15个连续氨基酸的肽；以及
[0102] (iii)包括SEQIDN0:14、15、20、21、67、22