一种兔瘟病毒抗体快速检测卡及其制备方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及一种兔瘟病毒抗体快速检测卡及其制备方法，属于免疫检测技术领域。
【背景技术】
[0002]兔瘟是由病毒引起的一种急性、热性、败血性和毁灭性的传染病。一年四季均可发生，各种家兔均易感。3月龄以上的青年兔和成年兔发病率和死亡率最高(可高达95%以上)。
[0003]目前，兔瘟病毒抗体的检测方法有血凝法、RT-PCR法、酶联免疫法，其中，RT-PCR法、酶联免疫法需要大型仪器和专业人员，而血凝法操作简单，但需要人红细胞，红细胞价格较贵，不宜长期保存，本研究利用免疫胶体金原理，研制出一种兔瘟病毒抗体快速检测卡制备方法，为快速、灵敏、准确的检测兔瘟病毒抗体减少了时间和成本。
【发明内容】
[0004]本发明提供了一种兔瘟病毒抗体快速检测卡及其制备方法，本发明为快速、灵敏、准确的检测兔瘟病毒抗体减少了时间和成本。本发明的技术方案如下:
一种兔瘟病毒抗体快速检测卡的制备方法，具体步骤为:
(I)抗兔瘟病毒VP60单克隆抗体的制备 ①免疫程序
将昆虫细胞表达蛋白VP60免疫原与501佐剂按体积比1:0.5-1.5的比例混合，优选为按体积比1: 0.8-1.3的比例混合，对8-10周龄Balb/c小鼠进行免疫，腿部肌肉注射，50yg/只，以后每隔两周免疫一次，免疫剂量、部位同上;5免后加强免疫，腹腔注射，不加佐剂，剂量加倍。
[0005]②细胞融合
将Balb/c小鼠体内的脾细胞与其腹腔内的骨髓瘤细胞按照细胞数量20:0.5-1.5的比例混合，800rpm离心5-8min，优选为将Balb/c小鼠体内的脾细胞与其腹腔内的骨髓瘤细胞按照细胞数量20:0.8-1.3的比例混合，800rpm离心6min，弃去上清，于30S内加入lmL50%PEG(W/W)，静置Imin，在第一个Imin内缓慢加入ImL无血清的DMEM培养基，在第二个Imin内缓慢加入2mL无血清的DMEM培养基，在第三个Imin内缓慢加入2mL无血清的DMEM培养基，在第四个Imin内缓慢加入5mL无血清的DMEM培养基，在第五个Imin内缓慢加入1mL无血清的DMEM培养基，800rpm离心1min，弃上清，用含20%小牛血清(购自Gibico公司，货号H1565)的完全培养基重悬细胞，细胞计数为3-6 X 15个/mL铺于含饲养细胞(2-6 X 14个/mL)的细胞培养板，置于CO2培养箱中。
[0006]③杂交瘤筛选及克隆化
待细胞长至孔底的1/3时，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔，将阳性孔采用有限稀释法进行亚克隆，第6天，取细胞上清检测，最终选取抗兔瘟病毒VP60杂交瘤细胞株2F4，将杂交瘤细胞冻存于液氮罐中，所述的杂交瘤细胞株2F4于2015年6月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C201582，保藏地址为中国武汉武汉大学。
[0007]④抗体制备及纯化
单克隆抗体的生产:采用动物体内腹水诱生法；
单克隆抗体的纯化:采用SPA柱法对腹水进行纯化，即得本发明抗兔瘟VP60单克隆抗体。
[0008](2)兔瘟病毒抗体快速检测卡的制备
①胶体金溶液的熬制
本发明检测卡是采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，方法为量取99 mL的超纯水装入250 mL的圆底烧瓶，放入搅拌子，置于磁力搅拌器上，加入1%氯金酸溶液I mL，适当速度搅拌，打开加热开关，待溶液沸腾后迅速一次性加入1.6 mL 1%柠檬酸三钠溶液，氯金酸溶液由灰色逐渐变为酒红色，颜色稳定后继续加热10 min，待溶液冷却后，用微孔滤膜过滤，4°C保存备用，紫外扫描得到最大吸收峰为523nm的胶体金颗粒。
[0009]②抗兔瘟病毒VP60单克隆抗体的标记
用0.1 mol/L的KAO3调节胶体金pH值为9.0。每I mL胶体金溶液加入6yg抗兔瘟病毒VP60单克隆抗体，室温下120rpm摇30 min，加入10%牛血清白蛋白20yL，室温下120rpm摇30min，12000rpm离心20 min，弃上清，用0.0lMPBS溶解沉淀，即得到标记好的抗兔痕病毒VP60单克隆抗体。
[0010]③金标垫处理
选择聚脂纤维6613作为金标结合垫。将金标垫浸泡在处理液A中5min，处理液A为0.0lMpbs，pH7.4，0.2%Triton X-100，取出37°C烘干，备用。
[0011]④样品垫处理
选择DL42为样品垫，将样品垫浸泡在处理液B中5min，处理液B为0.01 Mpbs，pH7.4,1%Triton X-100，l%BSA+0.05% NaN3), 5min，取出37°C烘干，备用。
[0012]⑤C，T线确定
选择Sartorius Cn 140膜，分别将兔瘟病毒VP60蛋白和羊抗鼠二抗作为T线和C线划在NC膜上，浓度分别为1.3mg/mL和0.6mg/mL。
[0013]本发明还包括通过上述方法制备的兔瘟病毒抗体快速检测卡。
[0014]本发明与现有技术相比具有以下优点:
本发明可以快速、灵敏、准确的检测兔瘟病毒抗体，克服了国内检测兔瘟抗体主要以红细胞血凝，酶联免疫检测的问题。
【附图说明】
[0015]图1为本发明兔瘟病毒抗体快速检测卡结构示意图；
图2-图4为本发明兔瘟病毒抗体快速检测卡结果判定图。
[0016]符号说明:
1.样品垫、2.PVC板、3.金垫、4.检测线、5.质控线、6.NC膜、7.吸水垫。
【具体实施方式】
[0017]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0018]实施例1一种兔瘟病毒抗体快速检测卡制备方法 (I)抗兔瘟病毒VP60单克隆抗体的制备
①免疫程序
将昆虫细胞表达蛋白VP60免疫原(山东省滨州畜牧兽医研究院)与501佐剂(山东绿都生物科技有限公司，货号LD003)按体积比1:1的比例混合，对8-10周龄Balb/c小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)进行免疫，腿部肌肉注射，50yg/只，以后每隔两周免疫一次，免疫剂量、部位同上;5免后加强免疫，腹腔注射，不加佐剂，剂量加倍；
②细胞融合
将Balb/c小鼠体内的脾细胞与其腹腔内的骨髓瘤细胞按照细胞数量20:1的比例混合，800rpm离心7min，弃去上清，于30S内加入lmL50%PEG(W/W)，静置Imin，在第一个Imin内缓慢加入ImL无血清的DMEM培养基(购自Gibico公司，货号H390)，在第二个Imin内缓慢加入2mL无血清的DMEM培养基，在第三个Imin内缓慢加入2mL无血清的DMEM培养基，在第四个Imin内缓慢加入5mL无血清的DMEM培养基，在第五个Imin内缓慢加入1mL无血清的DMEM培养基，800rpm离心1min，弃上清，用含20%小牛血清(购自Gibico公司，货号H1565)的完全培养基重悬细胞，细胞计数为3-6 X 15个/mL铺于含饲养细胞(2-6 X 14个/mL)的细胞培养板，置于CO2培养箱中。
[0019]③杂交瘤筛选及克隆化
待细胞长至孔底的1/3时，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔，将阳性孔采用有限稀释法进行亚克隆，第6天，取细胞上清检测，最终选取抗兔瘟病毒VP60杂交瘤细胞株2F4，将杂交瘤细胞冻存于液氮罐中，所述的杂交瘤细胞株2F4于2015年6月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C201582，保藏地址为中国武汉武汉大学。
[0020]④抗体制备及纯化
单克隆抗体的生产:采用动物体内腹水诱生法；
单克隆抗体的纯化:采用SPA柱(购自杭州纽龙生物科技有限公司)法对腹水进行纯化，即得本发明抗兔瘟VP60单克隆抗体。
[0021 ] (2)兔瘟病毒抗体快速检测卡的制备 ①胶体金溶液的熬制
量取99 mL的超纯水装入250 mL的圆底烧瓶，放入搅拌子，置于磁力搅拌器上，加入1%氯金酸(上