一种在医疗器械表面固定乙肝抗体的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于医疗检测技术领域，尤其涉及一种在医疗器械表面固定乙肝抗体的方法。
【背景技术】
[0002]生物芯片技术将蛋白质、细胞、组织、生长因子、抗体等固定在支持物或医疗器械表面，进而与带荧光标记的DNA样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息，是目前应用前景最好的DNA分析技术之一。乙肝抗体是乙肝病毒表面抗原(HBsAg)刺激人体免疫系统后产生的保护性或中和性抗体，它能中和掉乙肝病毒的感染力，保护人体免受乙肝病毒再度袭击。目前，预防乙肝的最有效方法是注射乙肝疫苗，使人体产生乙肝抗体，然而人体内乙肝抗体存活量的大小难以确定，换言之间隔多长时间注射乙肝疫苗难以确定，因此，检测人体内乙肝抗体成为关键。近年来，随着生物芯片技术的发展，体外诊断试剂已经广泛应用，但将乙肝抗体固定在医疗器械表面，并且不破坏抗体活性成为限制体外诊断的重要因素。此外，尚未检索到有关在医疗器械表面固定乙肝抗体方法的报道。
[0003]专利CN 101310778A公开了一种在医疗器械表面固定抗体的方法，该报道披露的固定方法是:“①将支架浸没在⑶34抗体磷酸盐缓冲溶液中，在25?37°C温育20?30分钟后取出用磷酸盐缓冲溶液清洗支架，吹风干燥后4°C保存；③将带有抗体的支架浸没在牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲溶液中，温育后空气中晾干；④将支架放入人重组CD34抗原的磷酸盐缓冲溶液中，温育后空气中晾干；⑤将支架放入FITC标记的CD34抗体的磷酸盐缓冲溶液中，或HRP标记的山羊抗小鼠IgG的磷酸盐缓冲溶液中，温育后取出；⑥将支架用磷酸盐缓冲溶液清洗后晾干”。该方法的优点是抗体在医疗器械表面牢固程度高不易脱离，并且抗体在医疗器械表面具有很高的活性。然而，该方法是先将抗体固定在支架上，再通过清洗步骤，并且使用对酸碱值要求苛刻的磷酸盐缓冲溶液，这样存在以下缺陷:1)对支架未进行预处理(未用磷酸盐缓冲溶液浸泡或喷淋)，将支架浸没在抗体的磷酸盐缓冲溶液中，无疑稀释了磷酸盐缓冲溶液的浓度，改变了原有的酸碱值，对抗体温育不利；2)将带有抗体的支架用磷酸盐缓冲溶液清洗，会使已经附着的抗体脱离，这样就降低了支架上固定的抗体数量；3)磷酸盐缓冲溶液在pH值为7.5以上时失去缓冲能力，而且会与重金属离子发生反应而以磷酸盐的形式沉淀出来，也会对检测产生影响。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于:克服上述技术存在的不足，提供一种在医疗器械表面固定乙肝抗体的方法。
[0005]为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
[0006]一种在医疗器械表面固定乙肝抗体的方法，主要包括:1)器械本体表面的预处理、2)制备孔洞、3)器械本体表面的后处理、4)固定抗体工艺步骤，其特征在于:所述的固定抗体工艺步骤为:
[0007]①将表面带孔的的支架浸没在柠檬酸盐缓冲溶液中，在40?42°C条件下，超声分散25?30分钟；
[0008]②将支架浸没在0.3?0.7ug/ml的乙肝抗体柠檬酸盐缓冲溶液中，在5?10°C条件下温育15?20分钟，然后以0.1?0.5°C的幅度逐渐升温至35?39°C，继续温育20?30分钟；
[0009]③将表面带有乙肝抗体的支架进行常温吹风干燥，待其干燥后O?3°C保存；
[0010]④将冷藏后的支架浸没在500ul5%无钙血清白蛋白的柠檬酸盐缓冲溶液中，在温度为35?39°C，转速为12?36转/分钟的条件下，温育25?27分钟后取出支架，空气中晾干；
[0011]⑤将支架放入500ul0.01ng/ul乙肝抗体的柠檬酸盐缓冲溶液中，采用循环变温方法温育30?35分钟，变温幅度0.1?0.3°C /分钟，变温范围为35?39°C ;
[0012]⑥将支架放入500ullug/ml荧光素标记的乙肝抗体的柠檬酸盐缓冲溶液中，35?39°C条件下温育20?30分钟后取出支架；
[0013]⑦将支架用柠檬酸盐缓冲溶液清洗2?3次，每次10分钟后晾干，进行抗体活性检测。
[0014]由于钙离子对柠檬酸缓冲溶液影响大，配置缓冲溶液时分离掉钙离子，所述的缓冲溶液妈浓度为O?0.0001mol/mlo
[0015]为了提高医疗检测准确性，保证支架具有较好的物化特性，选择石英作为支架基材。
[0016]与现有固定抗体方法相比，本发明具有以下有益效果:
[0017]1、本发明在固定抗体前先用柠檬酸盐缓冲溶液浸泡支架，并且浸没过程中进行超声分散，使得柠檬酸盐缓冲溶液分布于支架上，保证固定抗体前后缓冲溶液浓度尽可能不变，进而提高检测准确性；本发明在抗体附着于支架上后，采用与人体血液温度接近的温度(35?39°C )进行培育，提高抗体活性和适应性；本发明采用适应性更好的柠檬酸盐缓冲溶液取代磷酸盐缓冲溶液，其适应性更广更好，解决了 PH值在7.5以上缓冲能力下降，进而影响检测准确性的问题。
[0018]2、本发明在配置缓冲溶液时分离掉钙离子，避免钙离子对检测的影响，同时也避免了钙离子与缓冲溶液反应沉淀的现象。
[0019]3、本发明的支架采用物化性能更稳定，透明度更好的石英作基材，提高检测准确性。
[0020]4、本发明具有抗体固定的牢固程度高不易脱离，并且抗体在支架上活性高的优点，还具有检测准确性高的优点。
【具体实施方式】
[0021]下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明，旨在帮助同领域技术人员理解本发明。
[0022]实施例1
[0023]—种在医疗器械表面固定乙肝抗体的方法，主要包括:1)器械本体表面的预处理、2)制备孔洞、3)器械本体表面的后处理、4)固定抗体工艺步骤，具体操作步骤如下:
[0024]I)器械本体表面的预处理
[0025]利用超声波对器械本体表面清洗清除杂质，使用浓度为99.5%的丙酮分析纯溶液，或浓度为75%的医用乙醇溶剂，利用频率为28?10khz超声波清洗支架本体材料，清洗5?15分钟，去除本体材料表面的杂质，将清洗后的本体材料放置在干燥机中，温度设定在35?39°C，干燥30?60分钟后取出备用。
[0026]2)制备孔洞
[0027]采用化学腐蚀、电化学腐蚀、阳极氧化、微弧氧化、微弧氮化方法在器械本体上直接制备大小均一的多晶相结构孔洞；将器械本体材料浸泡在O?100°C温度的腐蚀液中，所述的腐蚀液优选浓度为1.38 %的盐酸，或含有I?38 %的盐酸混合I?98 %的硫酸成分的盐酸混酸溶液，腐蚀时间根据浓度、温度不同控制在I分钟?480小时后形成单尺寸纳米级孔洞。
[0028]3)器械本体表面的后处理
[0029]将上述处理好的器械本体材料先使用浓度为99.5Y0的丙酮分析纯溶液，再经蒸馏水利用频率为28?10khz超声波清洗本体材料5?15分钟；最后将清洗后的本体材料放置在干燥机中，温度设定在30?40°C，干燥30?60分钟后取出备用；或用蒸馏水配制浓度为I?38%的盐酸溶液，将本体材料浸泡在配好的溶液中，放置在恒温箱中，温度设定在20°C左右，放置30分钟?48小时取出。
[0030]4)固定抗体，通过以下步骤进行:
[0031]①将表面带孔的的支架浸没在柠檬酸盐缓冲溶液中，在40?42°C条件下，超声分散25?30分钟；
[0032]②将支架浸没在0.3?0.7ug/ml的乙肝抗体柠檬酸盐缓冲溶液中，在5?10°C条件下温育15?20分钟，然后以0.1?0.5°C的幅度逐渐升温至35?39°C，继续温育20?30分钟；
[0033]③将表面带有乙肝抗体的支架进行常温吹风干燥，待其干燥后O?3°C保存；
[0034]④将冷藏后的支架浸没在500ul5%无钙血清白蛋白的柠檬酸盐缓冲溶液中，在温度为35?39°C，转速为12?36转/分钟的条件下，温育25?27分钟后取出支架，空气中晾干；
[0035]⑤将支架放入500ul0.01ng/ul乙肝抗体的柠檬酸盐缓冲溶液中，采用循环变温方法温育30?35分钟，变温幅度0.1?0.3°C /分钟，变温范围为35?39°C ;
[0036]⑥将支架放入500ullug/ml荧光素标记的乙肝抗体的柠檬酸盐缓冲溶液中，35?39°C条件下温育20?30分钟后取出支架；
[0037]⑦将支架用柠檬酸盐缓冲溶液清洗2?3次，每次10分钟后晾干，进行抗体活性检测。
[0038]由于钙离子对柠檬酸缓冲溶液影响大，配置缓冲溶液时分离掉钙离子，所述的缓冲溶液妈浓度为O?0.0001mol/mlo
[0039]为了提高医疗检测准确性，保证支架具有较好的物化特性，选择石英作为支架基材。
[0040]5)抗体活性检测
[0041]采用人工模拟血液动力学和支架表面抗体活性检测方法验证固定生物制品抗体的有效性，通过荧光显微镜对支架进行荧光照相，或采用3-氨基-9-己基一咔唑(AEC)染色试剂盒，免疫组化染色后拍照。
【主权项】
1.一种在医疗器械表面固定乙肝抗体的方法，主要包括:1)器械本体表面的预处理、2)制备孔洞、3)器械本体表面的后处理、4)固定抗体工艺步骤，其特征在于:所述的固定抗体工艺步骤为: ①将表面带孔的的支架浸没在梓檬酸盐缓冲溶液中，在40?42°C条件下，超声分散25?30分钟； ②将支架浸没在0.3?0.7ug/ml的乙肝抗体柠檬酸盐缓冲溶液中，在5?10°C条件下温育15?20分钟，然后以0.1?0.5°C的幅度逐渐升温至35?39°C，继续温育20?30分钟； ③将表面带有乙肝抗体的支架进行常温吹风干燥，待其干燥后O?3°C保存； ④将冷藏后的支架浸没在500ul5%无钙血清白蛋白的柠檬酸盐缓冲溶液中，在温度为35?39°C，转速为12?36转/分钟的条件下，温育25?27分钟后取出支架，空气中晾干； ⑤将支架放入500ul0.01ng/ul乙肝抗体的柠檬酸盐缓冲溶液中，采用循环变温方法温育30?35分钟，变温幅度0.1?0.3°C /分钟，变温范围为35?39°C ; ⑥将支架放入500ullug/ml荧光素标记的乙肝抗体的柠檬酸盐缓冲溶液中，35?39°C条件下温育20?30分钟后取出支架； ⑦将支架用柠檬酸盐缓冲溶液清洗2?3次，每次10分钟后晾干，进行抗体活性检测。
2.如权利要求1所述的一种在医疗器械表面固定乙肝抗体的方法，其特征在于:所述的缓冲溶液钙浓度为O?0.0001mol/mlo
3.如权利要求1所述的一种在医疗器械表面固定乙肝抗体的方法，其特征在于:所述的支架为血管支架，基材为石英。
【专利摘要】本发明公开了一种在医疗器械表面固定乙肝抗体的方法，主要包括：1)器械本体表面的预处理、2)制备孔洞、3)器械本体表面的后处理、4)固定抗体工艺步骤，其特征在于：所述的固定抗体工艺步骤为：带孔支架用柠檬酸盐缓冲溶液处理；固定乙肝抗体并温育；干燥后低温保存；提供血清白蛋白营养缓冲溶液并温育；循环变温温育；荧光标记并温育；清洗后晾干。与现有技术相比，本发明具有抗体固定的牢固程度高不易脱离，并且抗体在支架上活性高的优点，还具有检测准确性高的优点。
【IPC分类】A61L31-16, A61L31-02
【公开号】CN104826177
【申请号】CN201510287830
【发明人】巩晓东, 李宏奎, 王珍娥, 路遥, 雪洲
【申请人】巩晓东
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2015年6月1日