猪流行性腹泻病毒抗体捕获elisa检测方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于动物免疫学技术领域。具体涉及一种猪流行性腹泻病毒抗体捕获 ELISA检测方法及应用，本方法适用于临床猪群中猪流行性腹泻病毒血清抗体的快速检测。
【背景技术】
[0002] 猪流行性腹泻（Porcine Epidemic Diarrhea,简称PED)是由猪流行性腹泻病毒 (Porcine Epidemic Diarrhea Virus，简称PEDV)引起的一种急性高度接触性肠道传染病， 以水样腹泻、呕吐和脱水为主要特征，不同日龄和品种的猪均易感，其中对10日龄以内仔 猪的危害最为严重，发病率和病死率均可达100%。该病于1791年首次发生于英国并在欧 洲普遍流行，被称作"流行性病毒腹泻（epidemic viral diarrhea, EVD)"。1976年英国猪 群中再次出现了病毒性腹泻，所有日龄的猪均可感染发病，为了与1971年所发生的EVD相 区别，将这次发生的腹泻称为EVD 2型。1978年比利时学者从一份标记为CV777的粪便样 品中分离到病毒，证实该病毒能引起哺乳仔猪和育肥猪发病，于是将这一疾病命名为猪流 行性腹泻（PED)，并沿用至今。我国1973年在猪群中发生传染性腹泻，1984年证实PEDV在 我国存在，2006年在国内出现PED流行，给我国养猪业造成了巨大的经济损失。2010年以来 PED在包括我国在内的多个亚洲国家爆发流行，严重制约了亚洲国家养猪业的健康发展。即 使在之前从未出现过PED流行的美国也在2013年出现了 PED的流行，给美国养猪业造成了 严重的经济损失。
[0003] 血清抗体水平检测在PEDV流行病学调查、疫苗免疫效果评价等方面具有广泛的 应用，目前检测PEDV血清抗体的方法主要有中和试验、间接免疫荧光试验和酶联免疫吸 附试验（ELISA)，3种检测方法均具有特异敏感的特点，其中中和试验是最经典最可靠的方 法，但中和试验和间接免疫荧光试验均存在实验周期长、技术要求高和检测成本高的问题， 且两种方法不适合大规模样品的检测和基层使用，而酶联免疫吸附试验（ELISA)的操作简 单快速、成本低廉、可以同时检测大量样品，对技术条件要求较低，因此发展PEDV抗体的 ELISA检测方法将为我国猪流行性腹泻的快速准确诊断提供有力的工具，从而为养猪业的 健康发展保驾护航。
[0004] 目前已经公布的PEDV抗体检测方法的专利文献有两个，分别是黄伟坚等的"检测 猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA试剂盒"（专利【申请号】201310701145X)和李彬等的 "检测猪流行性腹泻病毒抗体的ELISA试剂盒"（专利【申请号】2014102242274)。黄伟坚等 采用的是间接ELISA方法，所用的抗原蛋白是PEDV N蛋白内部的主要亲水区序列135-319 位氨基酸；李彬等也是采用的间接ELISA方法，而所用抗原是原核表达的PEDV完整N蛋白。 但是上述文献还存在如表1所述的缺陷，这正是本发明需要解决的技术问题。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是克服现有间接ELISA存在的非特异性反应问题，用制备的针对 PEDV N蛋白的单克隆抗体包被ELISA板，捕获原核表达的PEDV完整N蛋白，建立一种检测 猪流行性腹泻病毒（PEDV)抗体的捕获ELISA方法，用于猪流行性腹泻病毒抗体的检测、流 行病学调查及疫苗免疫效果的评价等。
[0006] 本发明采用抗PEDV N蛋白的单克隆抗体包被ELISA板，再捕获原核表达的PEDV 完整N蛋白作为抗原，在检测方法的建立、抗原选择、抗原吸附方式等方面与黄伟坚、李彬 等的报道的方法均有本质的不同。本发明通过单克隆抗体主动吸附N蛋白可以最大程度上 减少杂质蛋白和无活性蛋白的结合，从而减少非特异性反应，提高检测方法的特异性和灵 敏性。
[0007] 本发明应用分子生物学技术和免疫学技术，获得表达纯化的PEDV N蛋白并制备了 针对PEDV N蛋白的单克隆抗体，在此基础上建立了猪流行性腹泻病毒（PEDV)抗体捕获酶 联免疫吸附（ELISA)检测方法，并对其性能进行了测定。所建立的方法特异性好、灵敏度 高、检测结果可靠，适用于猪群中猪流行性腹泻病毒（PEDV)抗体的检测。
[0008] 本发明的技术方案如下所述：
[0009] 1.本发明构建了 PEDV完整N蛋白的重组表达菌株，表达纯化了 PEDV N蛋白：
[0010] 以猪流行性腹泻病毒（PEDV) AJ1102株病毒基因组为模版进行RT-PCR扩增获得 PEDV N基因，扩增用上下游引物中分别引入了 BamH I和Hind III酶切位点，将扩增的N基 因经BamH I和Hind III双酶切后连接到pET-30a载体的相应酶切位点，构建了 pET-30a-N 重组质粒，并经双酶切鉴定，将鉴定正确的pET-30a-N质粒转化BL21 (DE3)感受态细胞，挑 取阳性菌落。将阳性菌于37°C培养，待菌液OD值达到0. 4-0. 6时加入终浓度为0. 8mmol/L 的IPTG进行诱导，7h后收集菌体，低温高压破碎，分别对沉淀和上清进行SDS-PAGE电泳鉴 定。根据鉴定结果，对上清中的N蛋白通过Ni柱亲和纯化，获得纯化的PEDV N蛋白。
[0011] 2.本发明制备了一株针对PEDV N蛋白的单克隆抗体：
[0012] 以纯化的PEDV N蛋白为免疫原，免疫BALB/c小鼠，经两次免疫后检测小鼠血清效 价，取达到免疫效价要求的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，用原核表的的PEDV N蛋白 包被ELISA板，建立ELISA方法对获得的杂交瘤细胞进行筛选，经过三轮筛选，获得一株可 以稳定分泌抗PEDV N蛋白抗体的杂交瘤细胞株N2D1，申请人将该杂交瘤细胞株命名为杂 交瘤细胞株N2D1，于2014年9月23日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中 心保藏，其保藏号为：CCTCC NO !C2014174。
[0013] 3.本抗体捕获ELISA检测方法的相关试剂材料：
[0014] (I)ELISA板：以杂交瘤细胞株N2D1分泌的单克隆抗体包被ELISA板，用2%牛血 清白蛋白（BSA)封闭Ih后加入原核表达并经纯化的N蛋白进行吸附结合，在超净工作台中 风干后密闭封装，4°C保存。
[0015] (2)洗涤液：含0· 05 %吐温20的磷酸盐缓冲液（PBST)
[0016] (3)血清稀释液：含5% (m/v)脱脂奶的PBST
[0017] (4)封闭液：含