一种人源抗乙肝病毒表面抗体及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种人源抗乙肝病毒表面抗体及其制备 方法和应用。
【背景技术】
[0002] 乙型肝炎病毒（HBV)感染引起的急、慢性乙型肝炎是严重危害人类健康，并有可 能诱发肝癌的严重传染病之一，至今仍未有特异性药物可以用来完全控制其传染和流行爆 发。抗乙肝病毒的抗血清曾被证实具有抗病毒感染的作用，尤其在阻断母婴传播及预防肝 移植后HBV再感染方面疗效显著，但血源性抗血清存在着传播其它疾病的隐患，同时还有 特异性不强，中和效果差等缺点，因此抗乙肝病毒重组抗体的研宄具有重要的社会应用价 值。
[0003] 现有基因工程抗体主要包括两种：一是人源化抗体（嵌合或CDR移植抗体），即仅 保持抗体的CDR区为鼠源序列，将抗体包括骨架区在内的其它部分均换成人的序列，目前 市售的绝大多数抗体属此种类型。改建后的"人源化"抗体在理论上既保留了亲代抗体的 抗原特异性，又更大程度的消除了鼠抗体的抗原性。但由于它们还含有10%?30%的鼠源 蛋白，因而在临床应用时，或多或少会存在一些免疫排斥反应。另一种则是消除抗原性的人 源抗体，但与原亲本抗体相比，构建的人源化抗体和小分子抗体片段其亲合力和特异性通 常较原亲本抗体低，完全人抗体更是低于人源化鼠单抗。因此筛选获得低抗原性高亲和活 性的人源抗体具有重要应用价值。
[0004] 目前抗体工程最常用的两种技术方法是抗体文库筛选和蛋白同源模建技术，其中 抗体文库筛选更为常用，技术方法也从噬菌体抗体文库发展到核糖体展示、无细胞表达系 统。
[0005] 由于抗体的亲合力和特异性主要是由抗体的可变区决定的，因而对抗体进行亲合 力成熟也主要是对可变区进行突变。保留抗体骨架结构，人工合成并替换部分CDR区，即可 获得针对不同特异抗原不同亲和力的抗体。在轻、重链可变区中，与抗原结合最密切的是其 六个CDR区，其中HCDR3和LCDR3对抗原结合的贡献最大，且HCDR3的多样性变化也最多， 因此选择某一个或某几个CDR区，尤其是HCDR3和LCDR3进行突变是最常用的方法。利用 不同的突变方法在CDR中引入突变并获得成功的报道很多，在体外通过控制突变引物的合 成也可以满足不同的要求。但一个分子内发生突变较多时，除有些对抗体的性能有改善外， 还有些是对抗体无影响的，甚至有些对抗体性能起破坏作用。突变的位点越多，产生的组合 数量就越大，会远远超过抗体库的构建能力；此外，碱基突变方法往往容易引起多个密码子 编码同一氨基酸或出现终止密码子而产生一些多余的寡核苷酸等现象，抗体库容量过大， 目标抗体含量过少这都使抗体库筛选、鉴定工作变得更加困难。
[0006] 另一种蛋白同源模建技术是基于蛋白质结构与功能之间的关系。目前，计算机数 字化分析系统已经成为蛋白质工程研宄中必不可少的工具，同源模建技术在蛋白质结构预 测中发挥着举足轻重的作用。随着蛋白质组学的发展和海量数据的积累，与已知结构蛋白 质有30%以上同源性的蛋白质的结构即可被较精确预测。人们可以根据已知的蛋白质一级 序列信息，应用计算机技术对蛋白质二维及三维结构进行模拟预测，蛋白质的三维结构又 在很大程度上决定了蛋白质的功能，该项技术也被研宄者们应用于抗体研宄。抗体作为空 间结构较为保守的蛋白，可以根据已知抗体结构序列对已有的抗体分子加以改造，得到性 能更符合人类要求的非天然免疫球蛋白结构。但由于已有蛋白空间结构数据积累远远小于 一级序列的数据，不同抗体之间又仅存在微小差异，对模拟计算的精度要求较高，因此单纯 采用计算方式获得的抗体还存在误差，不能完全代表抗体的特异性和亲和性。
[0007] 由于抗体亲和力成熟过程中基因突变并不随机发生于可变区内，而是倾向性集中 在CDR区的某些位点，即突变热点。而如何利用突变热点来筛选亲和力高的抗体是目前亟 待解决的问题。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供一种人源抗乙肝病毒表面抗体及其制备方法和应用。本发 明将计算机分析技术与抗体的筛选、鉴定工作结合起来，以氨基酸为突变单位，借助于生物 信息学技术分析抗体突变热点，再对CDR3的突变热点随机化，构建小容量的突变库，进而 筛选出了具有高亲和力的抗体。
[0009] 为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
[0010] 第一方面，本发明提供了一种人源抗乙肝病毒表面抗体，所述抗体轻链可变区的 氨基酸序列如SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 2所示，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No. 3 或 SEQ ID No. 4 所示。
[0011] 本发明中，所述抗体轻链可变区的氨基酸序列SEQ ID No. 1为：(ELVM) TQSPSSLSA SI⑶RVTITCRAGQSI2DYLNWYQQKPGKAPMLLIYIASSLQSGVPSRFSGGGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ SYSTPFTFGQGTKVEIKR〇
[0012] 本发明中，所述抗体轻链可变区的氨基酸序列还可以选自SEQ ID No. 2 : (ELVM)TQ SPSSLSASI⑶RVTITCRAGQSI2DYLNWYQQKPGKAPMLLIYflASSLQSGVPSRFSGGGSGTDFTLTISSLQPEDF ATYYCQQSYSTPFTFGQGTKVEIKR 〇
[0013] 本发明中，所述抗体重链可变区的氨基酸序列SEQ ID No. 3为：QVDLVESGAEVKKPG ASVKLSCKASGYTLTRYYIHWVRQAPGQGLAWMGIINPSGGSTTYAQKFQDRVLMTTDISTSTVYLELSGLRSEDTA MYYCAEGNYHDSSGHQYADWQLAPNWLDSWGQGTLVTVSSASTKGo
[0014] 本发明中，所述抗体重链可变区的氨基酸序列还可以选自SEQ ID No. 4 :QVDLVESG AEVKKPGASVKLSCKASGYTLTRYYIHWVRQAPGQGLAWMGIINPSGGSTTYAQKFQDRVLMTTDISTSTVYLELSG LRSEDTAMYYCADGNYHDSSGHQYADWQLAPNWLDSWGQGTLVTVSSASTKGo
[0015] 本发明的上述序列中，下划线加粗的氨基酸残基表示所述抗体轻链和重链上的突 变热点。
[0016] 本发明中所述的抗体序列，还可以选自所述序列经替换、或添加一个或几个氨基 酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0017] 第二方面，本发明还提供了一种DNA片段，其包含编码如第一方面所述的轻链可 变区和重链可变区的核苷酸序列。
[0018] 第三方面，本发明还提供了一种表达载体，所述表达载体含有至少一个拷贝的如 第二方面所述的DNA片段。
[0019] 第四方面，本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如第三方面所述的 表达载体。
[0020] 第五方面，本发明还提供了一种如第一方面所述的人源抗乙肝病毒表面抗体的制 备方法，包括以下步骤：
[0021] (1)生物学文库的构建和人源抗体序列的筛选：在基础载体上重组抗体恒定区序 列并加入能够让可变区连接进去的内切酶位点，构建适合抗体表达的载体；再以免疫后个 体为对象，对抗体可变区基因克隆重组；通过抗原抗体结合活性筛选乙肝抗体序列；
[0022] (2)抗体优化：在已知抗体来源和所针对抗原基础上，对病毒MHBs抗原表位和目 标抗体进行同源模建，得到抗原和目标抗体的三维结构，再通过蛋白质-蛋白质之间相互 作用计算分析，确定乙肝表面抗体亲和力成熟的关键氨基酸；再以生物学筛选技术构建小 规模饱和突变文库，进行生物学验证，即得。
[0023] 作为优选的技术方案，本发明所述的制备方法具体包括以下步骤：
[0024] (1)抗体筛选表达平台的构建：利用PCR介导的定位突变技术在引物中引入限制 性内切酶位点，重组到表达载体上；克隆重链及轻链抗体恒定区基因，并设计能与可变区相 连的限制性内切酶位点，构建具有恒定区的单链抗体表达载体；插入人工合成的寡核苷酸 序列，设计供可变区与酵母天然信号肽进行连接的内切酶位点，构建可表达各种重链及轻 链抗体的通用表达载体；
[0025] (2)人抗乙肝表面抗体的筛选与表达：以免疫后个体为对象，RT-PCR扩增全部抗 体可变区，重组入步骤（1)中所述的载体，构建抗体表达文库，对人抗乙肝表面抗体CDNA进 行克隆和筛选，得到具有乙肝表面抗原结合活性的