新型抗体框架的制作方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及具有有利特性的新型抗体框架。
【背景技术】
[0002] 本发明涉及新型嵌合人抗体轻链框架，其包含来自Vk的框架区I至III和来自νλ的 框架区IV，具有有利特性诸如高稳定性和减小的聚集倾向。
[0003] 在过去四十年，从开发出第一批单克隆抗体（"mAb" ； K0hler &Mi 1 ste in， Nature.256(1975)495-7)开始，抗体已成为用于研究、诊断和治疗目的的越发重要的一种 生物分子类别。最初，抗体唯一地是用目的对应抗原对动物进行免疫来获得。虽然非人来源 的抗体可以用在研究和诊断中，但在治疗方法中，人抗体可能将非人抗体识别为外来物，并 且产生针对非人抗体药物产品的免疫应答，从而使得所述非人抗体药物产品效力下降或无 效。因此，已经建立重组方法以使非人抗体具有较低的免疫原性。
[0004] 将非人mAbs转化为免疫原性较低的治疗剂的最初工作需要将由动物(例如，啮齿 动物）的可变结构域和人恒定区组成的嵌合抗体工程化(Bou 1 ianne等，Nature 312，（ 1984) 643-646)。另外的方法专注于通过引入人可变结构域支架中的⑶R( Jones等，Nature 321 (1986)522-525 ;Riechmann等，Nature 332(1988)323-7)或通过表面重建可变结构域 (Roguska等，Proc · Natl .AcacL Sci · USA 91 (1994)969-973)来使啮齿动物的mAb人源化。
[0005] 对于通过CDR环移植来人源化，人受体框架是基于与供体框架的同源性（例如， Roguska等，Protein Engineering 9(1996)895-904;W0/2008/144757(针对兔））或基于优 选的稳定性特征(Ewert等，Methods 34(2004) 184-199)来选择。后一概念已被用于将兔抗 体人源化到通用可变结构域框架中(US 8，193，235)。
[0006] 在任何选定方法的情况下，所得mAb或功能片段理想地保留供体mAb的所需药效学 特性，同时显示类似药物的生物物理特性和最小的免疫原性。对于mAb或其功能片段的生物 物理特性，聚集倾向已成为治疗分子的可开发性的主要问题，主要是出于以下三个原因：
[0007] 首先，蛋白质聚集体通常显示在宿主体内引发免疫反应的较高可能性，这会导致 形成抗药抗体并且最终形成药物中和抗体（Joubert等，J.Biol.Chem. 287(2012)25266-25279)。
[0008] 第二，聚集体因其去除的工作量增加而影响生产产率(Cromwell等，AAPS Journal 8(2006)，Article 66)。
[0009] 第三，可观察到脱靶效应。有关低聚物形成的问题对于其中单价结合是优选的应 用(包括每个靶标和构建体仅具有单价的双特异性(或多特异性)抗体形式)而言是更为明 显的，因为在这些情况下形成低聚物会产生具有多价结合特性的蛋白质聚结体，其可能导 致脱靶效应。这种非特异性活性的实例是双特异性抗体形式的具有单个CD3e_结合结构域 的构建体的使用。这种形式可以例如将其两个结合结构域中的一个结合至癌抗原，并且将 其第二CD3e_结合结构域结合至募集细胞毒性T细胞。由于需要单价CD3e_结合部分的交联 来诱导通过CD3e的信号传导，T细胞将只在通过结合至靶细胞表面的多个双特异性构建体 衔接时才会受刺激，并且因此采用交联分子的特性，从而导致排他地针对癌细胞的特异性τ 细胞应答。相反，这种构建体的低聚物将展现出交联双特异性抗体的特性，并且因此使细胞 毒性Τ细胞活化(甚至是在未结合至癌细胞的情况下），从而引起Τ细胞的系统性活化。Τ细胞 的这种非特异性和系统性活化会导致细胞因子水平升高，从而引起不利作用。
[0010]另外，可靠的且普遍适用的受体框架有益于实现一种使非人抗体人源化的稳健方 法，因为克隆、表达和纯化方法可以被标准化。
[0011 ]为了满足上文所述的针对非人rnAb的人源化标准，已公开的方法提出将人共有可 变结构域框架序列用作受体支架以用于移植非人互补决定区的建议。基于以下假定:对于 蛋白质中的每个氨基酸位置，对蛋白质稳定性有贡献的残基在进化过程中已富集于种系序 列池中，普遍接受的是，所得人源化可变结构域越接近相应的可变结构域家族中的人种系 共有序列，则预期的稳定性就越高。如由Steipe(Steipe等，J.Mol. Biol. 1994240(1994) 188-92)描述和由 W0ni (W6m 等，J.Mol .Biol. 305(2001)989-1010)综述的这个概念已被 广泛接受并且获得了广泛的应用。非限制性实例是：（a)将共有序列可变结构域用于非人抗 体的人源化(Carter等，Proc.Natl .AcacL Sci .USA 89(1992)4285-4289) ;(b)使用共有序列 可变结构域来构建C D R文库以用于体内筛选稳定的祀结合抗体（K n a p p i k等， J.Mol.Biol. 296(2000)57-86);以及(c)基于知识的方法:通过将非共有残基交换为共有 残基来改进抗体可变结构域的稳定性(Steipe，上述引文）。
[0012]此外，不同的可变结构域家族的稳定性是用VH3来描述，所述VH3是最稳定的可变 重链结构域。重要的是，在可变轻链结构域的情况下，优选的是Vk家族，而不是νλ家族 (Ewert，上述引文）。具体来说，VH3和VkI的人共有序列已被描述为具有有利的生物物理特 性(Ewert，上述引文)并且特别适于来自非人来源的抗体的人源化(在Carter的上述引文中 使用）。
[0013]根据这一点，存在若干出版物，其中人Via-VH3共有框架hu-4D5已被用于啮齿动物 和兔抗体的人源化（Rader，J. Biol. Chem. 275(2000) 13668-13676 ;W0/2005/016950;W0 2008/004834)。或者，与hu-4D5属于同一家族的天然存在的序列已被用于从兔来源产生稳 定的人源化单链（scFv)片段（US 8,293，235;Borras等，J.Biol.Chem.285(2010)9054-9066)〇
[0014] 重要的是，已注意到自然选择在全长抗体的背景下总是进化出稳定的可变结构 域，其中可变结构域邻近并接触恒定结构域1。因此，某些非共有残基完全可以使分离的可 变结构域具有更好的稳定性，例如在单链Fv( SCFv)片段的背景下。为了支持这一假设，对稳 定性有贡献的非共有突变已在美国专利申请US 2009/0074780中进行描述。
[0015] 此外，抗体稳定性对于抗体治疗剂产品的制备、纯化、保存期以及随后的成本是至 关重要的。这些参数的一个或多个的甚至微小改进对于以下问题可能是高度适当的：抗体 药物的研究和开发是否正变得商业可行。
[0016]因此，虽然事实是已经就解决从非人抗体获得人源化抗体药物的问题进行了许多 尝试，但对开发具有有利特性诸如高稳定性和减小的聚集倾向的新型人抗体框架仍有大的 未能满足的需要，其中在与天然存在的序列相比时，人抗体框架含有尽可能少的突变，理想 情况是不含突变，以便尽可能降低产生免疫原性序列的风险。这类稳定的人框架还可以用 于例如通过环移植或简单地通过在亲本抗体与稳定框架之间交换对稳定性有贡献的组分 来使完全人抗体或其片段稳定。
[0017] 现有技术目前尚未实现或提出已由本发明提供的这个问题的解决方案，即新型嵌 合人抗体轻链框架，其包含来自Vk的框架区I至III和来自νλ的框架区IV，其具有有利特性 诸如尚稳定性和减小的聚集倾向。
【发明内容】
[0018] 本发明涉及新型嵌合人抗体轻链框架，其包含来自VK的框架区I至III和来自νλ的 框架区IV，其具有有利特性诸如高稳定性、减小的聚集倾向以及极小免疫原性潜力。
[0019] 因此，在第一方面，本发明涉及一种抗体VL结构域，其包含：（i)人Vk框架区I至 III;(ii)⑶R结构域⑶R1XDR2以及⑶R3;以及(iii)框架区IV，其选自： a. 用于框架区IV的人νλ种系序列，特别是选自以下列表的νλ种系序列：SEQ ID N0.16 至SEQ ID N0.22; b. 基于νλ的序列，其为(bi)来自用于框架区IV的人νλ种系序列的共有νλ序列，特别是 SEQ ID Ν0.17;或(bii)来自用于框架区IV的重排人νλ序列的共有νλ序列，特别是选自以下 列表的Vλ共有序列：SEQIDN0.16和SEQIDN0.17 ;以及 c. 基于νλ得到序列，其与用于框架区IV的最接近的人νλ种系序列相比具有一个或两个 突变，特别是一个突变； 条件是，如果在b.或c.的情况下，框架区IV具有序列FGQGTKLTVLG(SEQ ID Νο.15)， (w) 所述人Vk框架区I至III不同于以下克隆列表中所列的框架区：FW1.4gen(SEQ ID N0:4)、375-FW1.4opt、435-FWl.4opt、509-FWl.4opt、511-FWl.4opt、534-FWl.4opt、567-FW1.4opt、578-FW1.4opt、l-FW1.4opt、8-FW1.4opt、15-FW1.4opt、19-FW1.4opt、34-FW1 · 4opt、35-FW1 · 4opt、42-FW1 · 4opt 以及43-FW1 · 4opt; (x) 所述人Vk框架区I至III不同于通过可从以下克隆列表中所示的框架区序列重新排 列而获得的序列：FW1 · 4gen(SEQ ID NO: 4)、375-FW1 · 4opt、435-FW1 · 4opt、509-FW1 · 4opt、 511-FW1·4opt、534-FW1·4opt、567-FW1·4opt、578-FW1·4opt、1-FW1·4opt、8-FW1·4opt、15-FW1 · 4opt、19-FW1 · 4opt、34-FW1 · 4opt、35-FW1 · 4opt、42-FW1 · 4opt 以及 43-FW1 · 4opt; (y) 所述人Vk框架区I至III不同于可通过使序列FW1.4gen(SEQ ID N0:4)在15、22、48、 57、74、87、88、90、92、95、97以及99以!1〇编号）中的一个或多个位置处进行突变而获得的序 列;或 (z) 与SEQ ID N〇:8的人Vk序列中的相应区域相比，所述人Vk框架区I至III包含不超过 五个的突变，特别是与SEQ ID N〇:8的人Vk序列相比，少于五个、少于四个、少于三个、特别 是仅一个或没有突变。
[0020] 在第二方面，本发明涉及一种分离的抗体或其功能片段，其包含包括根据本发明 的抗体VL结构域。
[0021] 在第三方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含本发明的分离的抗体或其功能 片段，以及任选地药学上可接受的载体和/或赋形剂。
[0022] 在第四方面，本发明涉及一种核酸序列或核酸序列集合，所述核酸序列编码本发 明中的任一个的抗体VL结构域、或本发明的分离的抗体或其功能片段;和/或涉及一种或多 种通过根据本发明的第九方面的方法可获得的核酸序列。
[0023] 在第五方面，本发明涉及一种载体或载体集合，所述载体包含本发明的核酸序列 或核酸序列集合。
[0024] 在第六方面，本发明涉及一种宿主细胞(特别是一种表达宿主细胞），所述宿主细 胞包含本发明的核酸序列或核酸序列集合、或本发明的载体或载体集合。
[0025] 在第七方面，本发明涉及一种用于产生本发明中的任一个的抗体VL结构域、本发 明的分离的抗体或其功能片段的方法，其包括以下步骤:表达本发明的核酸序列或核酸序 列集合、本发明的载体或载体集合、或本发明的宿主细胞(特别是表达宿主细胞）。
[0026] 在第八方面，本发明涉及一种用于产生人源化兔抗体的方法，其包括以下步骤： a) 用目的抗原使兔免疫； b) 分离