生菜作为宿主在表达蛋白和/或多肽中的应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，特别涉及生菜作为宿主在表达蛋白和/或多肽中的应用。

背景技术：

植物作为药物蛋白质的表达和生产系统，已经研究了近三十年。除了低成本和产量高等的优点外，基于植物的表达系统还降低了人和动物病原体从产生蛋白质的过程中传播到人类的风险。此外，植物真核蛋白内膜表达系统和分泌途径类似于哺乳动物细胞。植物表达系统可大量生产大分子量以及多亚基的药物蛋白质，且大大优于原核生物表达系统，比如大肠杆菌表达系统。如需要翻译后修饰的，糖基化的蛋白，以及需要组装的单克隆抗体，其不能用原核系统实现。利用植物生产的药用蛋白作为生物试剂已经商业化，或用作家禽的疫苗添加剂。2012年，美国食品和药物管理局(fda)批准了用于治疗遗传疾病1型戈谢病的蛋白elelyso^tm(taliglucerasealfa)，而这种蛋白是利用胡萝卜生产的。在过去十年中，人们对药物蛋白质的需求急剧增加，所以fda批准用于临床试验的植物药用蛋白质的数量也在不断增加。

绿色荧光蛋白最早是由下村修等人在1962年在一种学名aequoreavictoria的水母中发现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。这个发光的过程中还需要冷光蛋白质aequorin的帮助，且这个冷光蛋白质与钙离子(ca²⁺)可产生交互作用。

蚯蚓在中国，日本和其他远东国家已经被用作传统药物数千年。口服干蚯蚓粉被认为有利于血液循环系统。蚓激酶(lumbrokinase)是从不同种类的蚯蚓分离和纯化的一组酶。这些酶被认为可用于治疗与血栓形成相关的各种病症的纤维蛋白溶解剂。好多蚓激酶基因已经克隆。遗传技术的进步提供了生产重组蚓激酶的能力，并且已经用于临床试验以及用于口服健保产品。至今位置，genbank已经存储了24个蚓激酶基因序列。在大肠杆菌，山羊乳腺，酵母巴斯德毕赤酵母和植物中已经成功地表达蚓激酶。由于其易于处理和快速生长，大肠杆菌表达系统具有以低成本高产量的生产蚓激酶的潜力。然而，在大肠杆菌中产生的重组lks多为包涵体。因此，复性过程是恢复和重建酶活性所必需的。由于原核细胞不能进行翻译后修饰，大肠杆菌可能无法进行适当的折叠，加工和糖基化来表达真核蚓激酶蛋白。研究表面，植物已经成为除细菌，酵母或哺乳动物细胞生产药物的方便和经济的替代品。植物具有实现蛋白质稳定性和生物活性必需的翻译后修饰所需的机制。植物中的蛋白质合成途径也与动物细胞非常相似。利用植物系统生产药物蛋白质的成本比使用哺乳动物细胞培养物和微生物发酵系统便宜得多。一般来说，利用植物系统生产重组人类药物蛋白质及其衍生产品的成本仅为利用哺乳动物细胞培养系统的0.1％和微生物系统的2％-10％。更重要的是，植物不是人类病原体的宿主。因此，来自植物的重组蛋白质不太可能将致病剂传播给人类。

植物中表达重组蛋白有两种主要方法：开发稳定遗传的转基因植物品系或在植物中瞬间表达外源蛋白质。第一个策略是将编码该蛋白质的dna克隆到表达载体中，并将其递送至植物的细胞核或质体基因组中。外源dna在植物中的稳定整合使得该蛋白在后代的表达，而且可在野外或温室大规模生产。然而，在植物中稳定表达蛋白耗费人力物力。而且筛选表达量高，遗传稳定，农艺性状好的纯合子品系通常需要几年时间。另外，关于生物安全问题，如基因漂移、花粉污染和病虫害防治也会引起生物技术监管机构的关注。而第二种方法是瞬时表达外源蛋白。外源基因不直接整合到植物基因组中，只在宿主细胞中瞬时表达所需的蛋白质。与稳定转化相比，瞬时表达在较短的时间内(一周内)可产生高含量的蛋白质。这种方法最大限度地减少了生物安全问题，因为处理过的植物或组织通常是在完全封闭的设施或容器中开发，不存在生物污染问题。

植物瞬时表达系统还可以用来生产重组蛋白以应对紧急情况。2014年，唯一用于有效抵抗埃博拉病毒爆发的抗体治疗药物，zmapp^tm，就是利用农杆菌渗透方法在烟草叶片中生产。zmapp的功效和安全性为推动植物制药业的行业开辟了道路。目前，烟草是瞬间蛋白表达最常见的宿主植物，并且已经开发了各种载体和农杆菌渗透方法，用于在短时间内进行大规模生产。然而，烟草具有高纤维含量和潜在的有毒化合物，如生物碱尼古丁，显著增加了下游纯化过程中的成本，极大地阻碍了植物外源蛋白药物的进一步发展。

现阶段有利用转基因植物生产疫苗，蛋白。但是转基因植物生产过程长，大概两年，而且转基因植物存在基因污染的问题，而且植物中含有大量蛋白，淀粉，多糖等，对下游纯化要求比较高。目前有利用烟草叶片来瞬间表达药用蛋白的技术，周期大概7天。烟草含有尼古丁，烟碱，各种有毒酚类物质，造成下游纯化工艺困难。

与烟叶系统相比，生菜中含有更少的酚类和有毒化合物，因此提供一种生菜系统表达医用蛋白或多肽具有重要的现实意义。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供生菜作为宿主在表达蛋白和/或多肽中的应用。本发明利用两种蛋白绿色荧光蛋白(gfp)以及蚓激酶来证明在温和的条件下生菜表达平台可以用来生产其他外源多肽和蛋白质。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了生菜作为宿主在表达蛋白和/或多肽中的应用。

在本发明的一些具体实施方案中，所述蛋白为医用蛋白。

在本发明的一些具体实施方案中，所述医用蛋白选自抗体、酶、生长因子或疫苗。

在本发明的一些具体实施方案中，所述蛋白为绿色荧光蛋白或蚓激酶。

本发明还提供了一种表达载体，包括双元植物载体以及所述应用中的蛋白和/或多肽的核苷酸序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述蛋白为蚓激酶，所述表达载体的构建方法包括如下步骤：

本发明选择了蚓激酶pi239作为候选基因，其从双歧杆菌(l.bimastus)中克隆。pi239先前在大肠杆菌和酵母系统表达并被证明中具有优异的抗血栓形成特征。

步骤1：在蚓激酶核苷酸序列的5’末端分别加入xbal限制性酶切位点，在3’末端分别加入bamh1限制性酶切位点，克隆到puc57载体中，获得puc-lum克隆载体；蚓激酶pi239cdna序列(genbank:af433650.1)如seqidno.1所示；蚓激酶蛋白pi239全序列的氨基酸序列如seqidno.2所示；成熟蚓激酶蛋白pi239序列的氨基酸序列如seqidno.3所示；加入酶切位点的pi239dna序列如seqidno.4所示；

步骤2：通过kpnl/sacl从所述puc-lum克隆载体中获得基因片段pi239，克隆至双元植物载体pcam35s，获得表达载体p35-lum。

在本发明的一些具体实施方案中，所述蛋白为绿色荧光蛋白，所述表达载体为含有gfp的植物双元载体pcambia1302。

本发明还提供了所述的表达载体在表达蛋白和/或多肽中的应用。

本发明还提供了一种生菜作为宿主表达蛋白和/或多肽的方法，将所述的表达载体转化到农杆菌中，通过农杆菌介导真空渗透入生菜组织后，提取、分离蛋白质，获得蛋白和/或多肽。作为优选，所述农杆菌选自根瘤农杆菌；更优选的，根瘤农杆菌为lba4404。

在本发明的一些具体实施方案中，所述农杆菌介导真空渗透包括如下步骤：

步骤1：抽真空25～45s；

步骤2：保持真空(-95kpa)压力30～60s；

步骤3：释放压力使得渗透液渗入所述植物组织；

重复上述步骤2～3次，避光处理4d。

用于真空农杆菌渗透的烟草植物的生长时间通常为4至6周。而本发明消除了植物生长周期，大大节省了前期培育植物的时间。本发明利用生菜来瞬时表达在较短的时间内(4d)可产生高含量的蛋白质。这种方法最大限度地减少了生物安全问题，因为处理过的生菜组织通常是在完全封闭的设施或容器中开发，不存在生物污染问题。生菜基本不含有植物有毒物质，而且其本身纤维少，利于下游的蛋白纯化。

本发明利用两种蛋白绿色荧光蛋白(gfp)以及蚓激酶来证明在温和的条件下生菜表达平台可以用来生产其他外源多肽和蛋白质。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示植物双元pcambia1302；

图2(a)示生菜农杆菌真空渗透的方法演示；

图2(b)示无土栽培生菜；

图2(c)示倒转浸入含有农杆菌的渗透液中整个系统密闭真空处理；

图3(a)示农杆菌真空渗透4天后；

图3(b)示在紫外光照射下，绝大多数生菜组织在真空渗透4d后显示强烈的绿色荧光(gfp)；相反，非农杆菌渗透生菜则在紫外光照射下显示红色(叶绿体)；

图4示粗提物(a)中gfp表达的可视化，最终纯化(b)；其中wt:非渗透生菜；gfp：农杆菌真空渗透生菜；

图5示sds-page分析；泳道1：来自大肠杆菌的gfp；野生型生菜匀浆(泳道2，3)或纯化后的gfp蛋白(4)；箭头显示gfp(27kd)的大小

图6示gfp浓度通过荧光光谱法测定gfp产量为0.37mg/g叶片重量；

图7示植物瞬间表达载体示意图；其中，35s，具有烟草花叶病毒(tmv)5‘utr的camv35s启动子；nptii，用于卡那霉素抗性的编码nptii基因的表达；nos3’，终止子；

图8示sds-page(a)和western印迹(b)分析重组pi239；-ck：来自非渗透叶的阴性对照；

图9示纤维蛋白平板测定；图9(a)在纤维蛋白板上测试纯化的洗脱液；图9(b)裂解晕圈直径；其中-ck：非渗透叶的洗脱(阴性对照)；wt：pi239；lk：标准蚓激酶(18,000u/mg)；值代表平均值±se；不同的字母表示显着差异(p≤0.05；n＝4；单因素方差分析测试)；

图10示体外人血液凝块溶解试验；图10(a)重组pi239溶解人体血块；图10(b)血块溶解百分比；pbs：1×磷酸盐缓冲盐水；-ck：非渗透假的洗脱(阴性对照)；lk：标准蚓激酶(18,000u/mg)；值代表平均值±se；不同的字母表示显着差异(p≤0.01；n＝3；单向方差分析测试)。

具体实施方式

本发明公开了生菜作为宿主在表达蛋白和/或多肽中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明结果表明，生菜系统可以是更有效的表达平台，为快速，瞬时表达重组蛋白质提供了方法。本文描述的真空农杆菌渗透方法简单，快速，减少叶片坏死，而且可以提高重组蛋白产量。生菜可以通过承受真空压力而增加蛋白质产量，并允许每片叶子更完整的渗透。由于生菜易于生长并且可商业上大量生产，因此比其他瞬时表达植物，如烟草等更容易获得并且更便宜。并且由于不需要特殊设备或液氮，成本效益更高。本研究证明该方法可以用于短时间内大规模生产重组蛋白质。

本发明提供的生菜作为宿主在表达蛋白和/或多肽中的应用中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1利用生菜系统生产绿色荧光蛋白(gfp)

组织和根瘤土壤杆菌准备：

从当地蔬菜店购买了成熟生菜(红叶，绿叶和长叶)，放在标准生长台灯下培养12h；或者将生菜种进行无土栽培如图2(b)所示。将含有双元植物载体pcambia1302(含有gfp，图1)的根瘤农杆菌菌株lba4404接种到0.5lyeb(酵母提取物肉汤，5g/l蔗糖，5g/l胰蛋白胨，6g/l酵母提取物，0.24g/lmgso4，ph7.2)并补充抗生素液体培养基(50mg/l卡那霉素)。将接种的培养物在振荡器(220rpm)中以25-28℃孵育72h。通过添加yeb培养基测量od600值并调节至3.5～4.5。然后收集培养液，离心(4500转速)10min。将农杆菌细胞重悬在渗透培养基(10mmmes，10mmmgso4)中至o.d.600为0.5。

农杆菌介导的真空渗透：

优化了农杆菌真空渗透的方法(图2)。将制备好的农杆菌培养悬浮液置于2l烧杯，并置于干燥器中。用刀将前10％的生菜切除，将其倒置(核心向上)并轻轻地旋转于细菌悬浮液中，将干燥器密封，如图2(c)所示。将真空泵(welchvacuum，niles，il，usa)打开以抽空，保持压力状态30～60s。然后打开该系统以释放压力，使渗透液渗入组织内的空间。该过程重复2～3次，直到清晰可见渗透液在生菜组织中有明显扩散。然后将生菜组织从渗透液中轻轻取出，并用蒸馏水连续冲洗三次，然后转移到塑料膜覆盖的容器中。将处理的样品在黑暗中保持4d，在uv光(395nm)下监测并拍照。实验重复至少5次。

渗透后，绝大多数生菜组织在真空浸润过程中淹没，除了坚固的中肋区域外，其余部分均在真空渗透4d后显示强烈的绿色荧光(图3)。通过多次试验观察，该系统被证明非常有效。本发明优化了农杆菌浸润，降低叶片坏死，增加蛋白质表达，提取，回收和纯化过程。

蛋白质提取和分离：

经农杆菌真空渗透的生菜样品用搅拌器搅拌，并用体积比为1:1比例的提取缓冲液(100mmkpi，ph7.8；5mmedta；10mmβ-巯基乙醇)搅拌机中高速匀浆1～2min。将匀浆物调节至ph为8.0，用纱布过滤，过滤物在4℃以10,000g离心15min以除去细胞碎片。收集上清液，与硫酸铵(50％)混合，并在冰上摇动孵育60min。通过离心机(10,000g)在4℃下再次分离15min。将得到的上清液进行第二轮硫酸铵(70％)沉淀，冰上摇动悬浮60min，再次在4℃下以10,000g离心15min。然后，弃去上清液，将处理样品沉淀蛋白质溶于5ml缓冲液(20mmkpi，ph7.8；2mmedta；10mmβ-巯基乙醇)中并在4℃下储存。gfp的产量通过分光荧光计(perkinelmerenspire2300multilabelreader，ma，usa)定量，发射峰在470～506nm之间。

植物来源的重组蛋白质的下游加工通常难于并且昂贵，因为纤维素细胞壁难以裂解以及次级植物代谢产物。搅拌机混合提取样品中gfp的荧光肉眼可见(图4)。用sds-page凝胶确认从真空渗透的生菜中检测出重组gfp条带(图5)。此外，使用分光荧光分析(图6)纯化样品的蛋白含量为0.37mg。

gfp可视化和sds-page分析：

为了证实gfp表达真实存在，收集粗制植物提取物和纯化的最终蛋白质的样品(5μl)，并在黑暗的室内在uv光下显现。将室温或者热变性(95℃)gfp加载缓冲液(biorad，hercules，ca，usa)在4～12％bis-trisplussds-凝胶(thermofisherscientific，waltham，ma，usa)跑电泳。然后用考马斯蓝g250(biorad)染色后再次对凝胶进行拍照。

通过荧光分光光度计进行gfp定量：

使用perkinelmerenspire2300multilabelreader来测量细菌对照gfp和生菜转化的gfp，以比较次方法获得的蛋白质量。使用来自商业样品的已知量的gfp开发了标准曲线。通过对来自同种生菜(野生型wt)样品的比较分析，从含有gfp的样品中除去除背景蛋白荧光。将每个样品的背景蛋白浓度的rfu绘制在标准曲线上，以确定每个样品中gfp的近似量。使用从406-460nm之间的单个激发峰的发射数据计算相对荧光单位，发射峰在470-506nm之间。在这些参数内进行重复测量(n＝12)。

实施例2利用生菜系统生产蚓激酶

植物表达构建体：

基于genbank(accessionno：af433650)的全长pi239dna序列，我们将限制性位点xbai位点连接到pi239的5'末端，在片段的3'末端加上bamh1位点，由genscriptinc(piscataway,nj，usa)合成，克隆到puc57载体中，得到克隆载体puc-lum。通过kpni/saci从puc-lum中分离出片段pi239，并克隆入植物双元载体pcam35s(本实验室保存)，以生成植物表达载体p35-lum。随后将植物表达载体p35-lum通过multiporator(eppendorf，hamburg，germany)电穿孔转化到根瘤农杆菌ba4404中，用于随后在生菜中的瞬时表达测定。利用sds-page凝胶电泳观察纯化重组蚓激酶蛋白的大小。

纤维蛋白溶解活性测定：

将琼脂糖(0.2g)置于40ml的磷酸盐缓冲盐水(1xpbs)中，通过在微波中煮沸然后冷却至约40℃。凝胶固化之前，将32mg人纤维蛋白原(sigma-aldrich，st.louis,mo，usa)，10单位人纤溶酶原(rpeptidellc，bogart，ga，usa)和10单位人类凝血酶(biopharmlaboratoriesllc，bluffdale，ut，usa)加入到凝胶中并轻微旋转混合以防止引入气泡。然后将混合物倒入培养皿中并使其在室温下固化。随后在固化凝胶中制成孔(3mm直径)。将10μl浓缩样品(1μg/μl)稀释在40μl的1xpbs缓冲液中，装入凝胶孔中，并在室温下孵育过夜。使用标准的蚓激酶(doctor'sbestinc，irvine，ca，usa)作为阳性对照(10μg)，将来自非农杆菌渗透转化的生菜叶片洗脱液用作阴性对照。测量清晰晕圈的实际直径(mm)。与标准lk产品(18,000u/mg)相比，计算重组pi239的纤维蛋白溶解活性。平均值±se(n＝4)通过单因素方差分析进行了分析。

本发明克隆了双元植物表达载体p35-lum。在构建完成后，用特异性限制酶消化证实基因片段完整(图7)。重组pi239经过sds-page分离(图8a)。我们在泳道中观察到估计分子量大约为37kda的条带。在阴性对照泳道中没有明显的对应条带。另外，通过hisprobe-hrp方法的western印迹分析也检测到大约37kda的条带(图8b)。观察到的分子量(37kda)大于pi239-his6链(32kda)的预测大小，这种差异最有可能是由于pi239蛋白的糖基化导致的。基于bradford测定法和sds-page上的条带强度计算出得到的蛋白含量大概为135μg/g叶鲜重(lfw)。

血凝块分析测定：

进行体外血液凝块裂解测定。将购买的血块(interstatebloodbank，memphis，tn，usa)切片成小片，并用1xpbs缓冲液彻底清洗。随后，将血凝块(约50mg/凝块)转移到24孔板中，并用1xpbs缓冲液冲洗两次。将40μl浓缩样品(1μg/μl)稀释在460μl的1xpbs缓冲液中，并加入含有血块的孔中。在37℃下孵育过夜后，测量未溶解的样品，并在处理前后测定样品的重量差异。pbs缓冲液和非转染叶片的洗脱液用作阴性对照。标准蚓激酶(40μg)用作阳性对照。以重量差/未处理样品的百分比计算凝块裂解。平均值±se(n＝3)通过单因素方差分析进行分析。

蚓激酶能够通过直接溶解纤维蛋白来降解血块。它还可以增强内源性t-pa活性，将纤溶酶原转化为纤溶酶，导致纤维蛋白溶解。在本研究中，纤维蛋白平板测定显示植物来源的蚓激酶具有明显溶解纤维蛋白(图9)。在商用蚓激酶和重组蛋白质的周围显示半透明的晕圈区域(图9a)。重组蚓激酶pi239的裂解直径分别为8.8mm，活性低于商业蚓激酶(18,000u/mg)，其溶解直径为12.25mm(图9b)。重组pi239的相对纤维蛋白溶解活性计算为约13,400u/mg。植物来源的蚓激酶pi239体外可以溶解人血凝块(图10a)。通过凝块自溶过程，在pbs孔和非渗透叶提取物中观察到轻微裂解。当用标准蚓激酶和重组pi239处理凝块时观察到明显的裂解。标准蚓激酶和重组蚓激酶分别显示92％和76％的凝块裂解(图10b)。与标准蚓激酶相比，重组蚓激酶pi239的较低活性可能是由于来自纯化过程中的植物成分或残留洗脱液。在以前报道的研究中，最终洗脱液中存在的残留植物污染物显着干扰纤维溶解蛋白酶的酶活性。因此，只需要进一步优化纯化策略获得高纯度的重组蚓激酶pi239，即可有效地增加血纤维蛋白溶解活性。

实施例3

对照组：利用烟叶生产绿色荧光蛋白和蚓激酶；

实验组：本发明提供的生菜生产绿色荧光蛋白和蚓激酶；

表1绿色荧光蛋白和蚓激酶

^*示与对照组相比p≤0.05；^#示与对照组相比p≤0.01；

由表1可知，与对照组的烟叶系统相比，生菜瞬时表达绿色荧光蛋白和蚓激酶，显著(p≤0.05)缩短了生产周期，显著(p≤0.05)提高了蛋白含量，显著(p≤0.05)提高了蛋白活性，简化了蛋白纯化的难易程度，极显著(p≤0.01)降低了生产成本。

综合上述试验结果表明，植物系统尤其是生菜系统是更加经济、高效的表达平台。能够快速瞬时表达重组蛋白质，可以在短时间内大规模生产绿色荧光蛋白和蚓激酶。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

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<110>深圳惠升生物科技有限公司

<120>生菜作为宿主在表达蛋白和/或多肽中的应用

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<213>成熟蚓激酶蛋白pi239序列

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<213>加入酶切位点的pi239dna序列

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