集成蛋白质前处理和多肽高pH值反相分级的蛋白质组反应器及其应用
【专利摘要】本发明涉及集成蛋白质前处理和多肽高pH值反相分级的蛋白质组反应器及其应用，所述蛋白质组反应器包括移液枪枪头(1)、强阳离子交换树脂填料(2)和固相萃取膜(3)；固相萃取膜(3)填充于移液枪枪头(1)的下端，强阳离子交换树脂填料(2)填充于移液枪枪头(1)下端并位于固相萃取膜(3)之上。本发明提供的蛋白质组反应器集成了蛋白质的预富集、还原、烷基化、酶解、多肽的除盐、洗脱和高pH值反相分级等操作，可用于少量细胞或者组织样品的蛋白质大规模鉴定和定量蛋白质组学中；此外，本发明提供的蛋白质组反应器技术可实现基于自动液体处理平台(例如安捷伦Bravo平台等)的自动化操作，提高样品处理通量和定量分析准确性。
【专利说明】
集成蛋白质前处理和多肽高pH值反相分级的蛋白质组反应器 及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及定性和定量蛋白质组学技术领域，尤其涉及一种集成蛋白质前处理和 多肽高pH值反相分级的蛋白质组反应器及其应用。
【背景技术】
[0002] 蛋白质组学研究中，通过将样品中的蛋白质酶解成多肽后，用于液相色谱-质谱分 析以获得蛋白质信息，该分离鉴定方法是目前使用最广泛的蛋白质组学研究手段。
[0003] 蛋白质组学样品前处理步骤主要包括蛋白质的预富集、还原、烷基化、酶解以及多 肽的除盐、分级。传统方法在处理蛋白样品时涉及多次样品转移，容易造成样品污染和损 失。近年来发展的蛋白质组反应器将上述步骤进行有效地集成，大大提高了少量蛋白样品 的处理效率。稀有细胞蛋白质组反应器(Rare Cell Proteomic Reactor,RCPR)基于强阳离 子交换树脂(Strong Cation Exchange,SCX)毛细管整体柱，实现了蛋白质的预富集、还原、 烷基化、酶解以及多肽的分级，从5,000和50,000个细胞中分别鉴定至1」409和2,281个蛋白质 (Mol · Cel 1 · Proteomics 2011,10，Μ110· 000679)。离心的蛋白质组反应器（Centrifugal Proteomic Reactor)使用离心管和SCX填料在离心机内完成了蛋白质的前处理步骤，显著 地提高了膜蛋白的鉴定数量(Mol.CellProteomics 2011，10,0111.008425)。狭小封闭空 间的蛋白质样品前处理方法（in-StageTip method)在封闭的小管内实现了蛋白质的样品 前处理，并通过小管下端的SCX膜、强阴离子交换（Strong Anion Exchange,SAX)膜等实现 多肽的分级，从20yg蛋白样品中鉴定到大于7,000个蛋白质(Nat.Methods 2014,11,319)。
[0004] 然而，由于RCPR的蛋白酶解和多肽分级都在SCX树脂上完成，影响了分级的效果； 并且，基于盐浓度在线分级也会影响质谱的检测效率。离心的蛋白质组反应器在1.5mL的离 心管内进行操作，操作体积大，易造成微量样品的损失。In-StageTip method采用SCX膜进 行多肽分级时使用的盐浓度较高，影响质谱检测;采用SAX分级时要另外除盐，造成样品损 失;而采用C 18膜时没有实现多肽的高pH值反相分级。此外，其使用的裂解液中不含表面活性 剂，不利于疏水性蛋白质的溶解和提取。
[0005] 因此如何开发一种集成蛋白质前处理和反相分级的、高通量并且易操作的蛋白质 组反应器已成为目前亟待解决的问题。
【发明内容】
[0006] 鉴于现有技术中存在的问题，本发明提供了一种集成蛋白质前处理和多肽高pH值 反相分级的蛋白质组反应器及其应用，通过采用本发明提供的蛋白质组反应器，能够原位 实现蛋白质的预富集、还原、烷基化、酶解、多肽的除盐、洗脱和高pH值反相分级的全过程， 并提高了酶解和分级的效率，可实现少量细胞样品的蛋白质大规模鉴定，提高重现性以及 定量分析准确性。此外，本发明提供的蛋白质组反应器可实现自动化操作。
[0007] 为达此目的，本发明采用以下技术方案：
[0008] 第一方面，本发明提供了一种蛋白质组反应器，其能够集成蛋白质前处理和多肽 高pH值反相分级;所述蛋白质组反应器包括移液枪枪头1、强阳离子交换树脂填料2和固相 萃取膜3;固相萃取膜3填充于移液枪枪头1的下端，强阳离子交换树脂填料2填充于移液枪 枪头1下端并位于固相萃取膜3之上。
[0009] 本发明中所述的"蛋白质样品前处理"包括蛋白质的预富集、还原、烷基化、酶解、 多肽的除盐和洗脱等操作，其在各操作过程中用到的蛋白酶、还原剂、烷基化试剂以及缓冲 盐溶液等都为本领域公知的试剂，典型但非限制性的实例为:蛋白质可以为生物样品的组 织、细胞或体液的蛋白质提取液或标准蛋白；蛋白酶可以选自碱性蛋白酶如胰蛋白酶、胰凝 乳蛋白酶或弹性蛋白酶等;还原剂可以选自二硫苏糖醇、磷酸三氯乙酯、巯基乙醇等，烷 基化试剂可以是碘代乙酸或碘乙酰胺等。
[0010]本发明中所述的"多肽高pH值反相分级"是指基于反相液相色谱的原理实现多肽 分级。其中反相液相色谱(reverse-phase 1 iquid chromatography，RPLC)的特点是固定相 的极性比流动相弱，由于RPLC固定相载体的疏水性，它可以根据流动相中被分离物质分子 疏水性的不同而发生强弱不同的相互作用，从而使不同分子在反相柱中彼此分离，疏水性 较弱的样品分子和固定相间的相互作用较弱，在流动相中有机溶剂含量较低时就能流出； 反之，疏水性相对较强的分子和固定相间存在较强的相互作用，在流动相中有机溶剂含量 较高时才能流出，因而实现了多肽的分级。
[0011]本发明所述的蛋白质组反应器中，所述强阳离子交换树脂填料为磺酸基强阳离子 交换树脂填料。
[0012 ]优选地，所述固相萃取膜为Cl8膜。
[0013] 本发明所述蛋白质组反应器能够用于原位实现蛋白质样品的前处理和多肽高pH 值反相分级，其具体包括:蛋白质的预富集、还原、烷基化、酶解、多肽的除盐、洗脱和高pH值 反相分级的全过程，其中，高pH值是指pH值高于8，例如pH值为8、9、9.2、9.5或10等。
[0014] 本发明所述蛋白质反应器在使用时，其具体操作如下：如图1中（B)所示，将支撑块 4置于收集管5上端，将蛋白质组反应器通过支撑块4置于收集管5之上，将收集管5放入离心 机6中，通过离心作用可使蛋白质溶液或者试剂流过蛋白质组反应器，完成蛋白质的预富 集、酶解、多肽的洗脱和高pH值反相分级等操作。此外，本发明提供的蛋白质组反应器可实 现自动化操作;例如，可以在安捷伦公司的自动化液体处理平台Bravo上使用所述蛋白质组 反应器技术自动化、高通量地同时处理多个样品。
[0015] 第二方面，本发明还提供了一种蛋白质的自动化反应系统，所述自动化反应系统 包括如第一方面所述的蛋白质组反应器。
[0016] 优选地，所述自动化反应系统还包括自动化液体处理平台，例如可以是安捷伦 Bravo平台。
[0017] 第三方面，本发明还提供了如第一方面所述的蛋白质组反应器在细胞或者组织样 品的蛋白质鉴定和定量蛋白质组学中的应用，尤其是用于少量细胞或组织样品的蛋白质大 规模鉴定和定量蛋白质组学中的应用。
[0018] 在具体应用时，主要是将所述蛋白质组反应器用于生物样本中样品的前处理和多 肽高pH值反相分级，将生物样本中的蛋白质样品在强阳离子交换树脂填料上进行酶解，酶 解完成后将生成的多肽转移到固相萃取膜上，再进行高pH值反相分级，以实现提高酶解和 分级效率的技术要求。
[0019] 本发明中，在将第一方面所述的蛋白质组反应器用于细胞或者组织样品的蛋白质 鉴定和定量蛋白质组学中时，其具体操作包括以下步骤：
[0020] (1)细胞或者组织样品经裂解液裂解并酸化后，加到预先活化好的蛋白质组反应 器中，通过离心使蛋白质富集到强阳离子交换树脂填料上；
[0021] (2)使用含有有机溶剂的溶液或者纯有机溶剂清洗掉结合到固相萃取膜上的表面 活性剂，依次加入相应的试剂和酶，完成蛋白质的还原、烷基化和酶解；
[0022] (3)使用盐溶液将生成的多肽从强阳离子交换树脂填料转移到固相萃取膜上；
[0023] (4)除盐后，使用高pH值的含有不同比例有机溶剂的溶液按从低到高的比例依次 将多肽洗脱下来，进行高pH值反相分级。
[0024] 优选地，步骤(4)所述分级时所使用溶液的pH值应高于8。
[0025] 步骤(1)所述裂解液中的表面活性剂是高pH值反相分级和液相色谱-质谱兼容的， 优选为正十二烷基_0 _〇-麦芽糖苷(11-(1〇(16〇710-〇-1]^11:〇8丨(16,〇〇1)、胆固醇琥1自酸单酯三 轻甲基氨基甲烧盐(〇1〇168七6巧11161111811(^；[1^七6 1：1^8 8311：，013)中的任意一种或两种的 混合物。
[0026] 本发明采用了兼容性的裂解液，即裂解液中的表面活性剂是高pH值反相分级和液 相色谱-质谱兼容的，如正十二烷基-β-D-麦芽糖苷(n-dodecyl 0-D-maltoside，DDM)、胆固 醇琥泊酸单酯三轻甲基氨基甲烧盐（〇1〇168七6巧111611^811(^；[仙七6 1：1^8 3311：，013)等，从 而将多肽的高pH值反相分级技术集成到本发明的蛋白质组反应器中，提高蛋白质的鉴定数 量。
[0027] 步骤(2)所述含有有机溶剂的溶液选自含有乙腈和/或甲醇的柠檬酸钾水溶液，其 中，乙腈和/或甲醇在所述溶液中的体积含量为20%，柠檬酸钾在所述溶液中的浓度为 8mmol/L〇
[0028] 优选地，步骤(2)所述纯有机溶剂为乙腈和/或甲醇。
[0029] 优选地，步骤(3)所述盐溶液为挥发性盐溶液，优选为甲酸铵和/或碳酸氢铵。
[0030] 与现有技术方案相比，本发明至少具有以下有益效果：
[0031] (1)本发明的蛋白质组反应器在一个移液枪枪头内集成了蛋白质的预富集、还原、 烷基化、酶解、多肽的除盐、洗脱和高pH值反相分级等操作，实现少量细胞样品的蛋白质大 规丰旲鉴定，提尚重现性以及定量分析准确性，并能实现在15min内尚效完成蛋白质的酶解； 此外，本发明的蛋白质组反应器可实现自动化操作。
[0032] (2)本发明还涉及兼容性的裂解液，即裂解液中的表面活性剂是高pH值反相分级 和液相色谱-质谱兼容的，如正十二烷基-β-D-麦芽糖苷(n-dodecylP-D-maltoside，DDM)和 胆固醇琥?白酸单酯三轻甲基氨基甲烧盐(Cholesteryl hemisuccinate tris salt，CHS)， 从而将多肽的高pH值反相分级技术集成到本发明的蛋白质组反应器中，提高蛋白质的鉴定 数量。
[0033] (3)本发明还涉及清洗C18膜上的表面活性剂的操作，即将蛋白质富集到强阳离子 交换树脂填料上之后，使用含有有机溶剂的溶液或者纯有机溶剂清洗掉结合到C18膜上的表 面活性剂。
[0034] (4)本发明的蛋白质组反应器分别在不同的材料上进行蛋白质的酶解和多肽的分 级，即蛋白质在强阳离子交换树脂填料上进行酶解，酶解完成后将生成的多肽转移到c18膜 上，再进行高pH值反相分级，有利于提高酶解和分级的效率。
【附图说明】
[0035]图1是本发明所述蛋白质组反应器(A)及具体操作时的结构示意图(B)。
[0036]图中：卜移液枪枪头，2-强阳离子交换树脂填料，3-C18膜，4-支撑块，5-收集管，6-离心机。
[0037] 图2是表面活性剂为l%(w/v)DDM或者l%(v/v)Triton X-100时(A)裂解液的蛋白 质提取效率对比；（B)多肽色谱图的对比，含有DDM的峰用"Γ标记，含有Tri ton X-100的峰 用标记。
[0038] 图3是本发明的高pH值反相分级与不分级时鉴定的蛋白质和多肽数量对比。
[0039] 图4是本发明的蛋白质组反应器的非标记定量分析性能评价。其中，（A)-(C)是任 意两次实验鉴定蛋白质的非标记定量强度的线性拟合结果；（D)-(F)是任意两次实验鉴定 蛋白质的非标记定量强度比值的分布。R1、R2和R3分别代表实验1、2和3鉴定蛋白质的非标 记定量强度。
[0040] 图5是酶解时间对蛋白质鉴定数量的影响。
[0041] 下面对本发明进一步详细说明。但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代 表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
【具体实施方式】
[0042] 下面结合附图并通过【具体实施方式】来进一步说明本发明的技术方案。
[0043]为更好地说明本发明，便于理解本发明的技术方案，本发明的典型但非限制性的 实施例如下：
[0044] 首先，本发明提供了一种兼容性的裂解液。稀有细胞蛋白质组反应器(RCPR)使用 的裂解液非常适合少量细胞的裂解，其成分为l〇mmol/L HEPES，pH7.4，150mmol/L NaCl， 2mmo1 /], CaCl2，2mmol/L MgCl2，600mmol/L guanidine HC1，1 %Triton X-100和蛋白酶抵 制剂。但是，裂解液中的表面活性剂Triton X-100不是液相色谱-质谱兼容的，如图2中（B) 所示，在使用该裂解液的多肽色谱图中出现很多与Triton X-100相关的强峰，影响多肽检 测。因此，我们将l%Triton X-100换成1%DDM。如图2中(A)所示，含1%DDM裂解液的蛋白质 提取效率与原RCPR的裂解液效果相当。而且，在多肽色谱图（图2中（B))中可以看到，与DDM 相关的峰在最后时间段才出来，不影响多肽检测，因此，本发明的含有DDM的裂解液是液相 色谱-质谱兼容的。
[0045] 本发明的蛋白质组反应器集成了多肽的高pH值反相分级操作，从而增加了多肽和 蛋白质的鉴定量。如图3所示，分析50，000个HEK 293T细胞时，高pH值反相分级后能鉴定到 57，008条多肽和6，821个蛋白质，分别是不分级时的2.2倍和1.7倍。
[0046]本发明的蛋白质组反应器具有更高的灵敏度。如表1所示。同样处理6yg来自HEK 293T细胞的蛋白质样品，没有做多肽的高pH值反相分级，本发明的蛋白质组反应器可以鉴 定到19，493条多肽和3，693个蛋白质，分别是离心的蛋白质组反应器（Centrifugal Proteomic Reactor)的2 · 8倍和1 · 7倍。
[0047] 如表2所示，本发明的蛋白质组反应器从2，000、5，000、20，000、50，000和100，000 个HEK 293T细胞中分别鉴定到1，270、2,566、5,749、6,821和7,826个蛋白质。而此?1?从5， 000和50，000个细胞中分别鉴定到409和2，281个蛋白质。相同细胞量的情况下，本发明的蛋 白质组反应器的灵敏度是RCPR的6.3倍和3.0倍。
[0048] 表 1
[0053] 将本发明的蛋白质组反应器应用于处理100，000个人乳牙牙髓基质干细胞（stem cells from human exfoliated deciduous teeth,SHED)样品。三次实验的结果如表3所 示，每次实验可以鉴定到大于7，000个蛋白质，三次实验共鉴定到120，456条多肽和9，078个 蛋白质，这是目前为止SHED细胞的最大的蛋白质数据集。
[0054]表 3
[0050]使用MaxQuant软件获得三次实验鉴定的蛋白质的非标记定量强度，任意两次实验 的线性拟合结果如图4所示，相关系数R大于0.98。任意两次实验鉴定蛋白质的非标记定量 强度比值的分布如图4所示，97%蛋白质的比值变化小于2。结果表明，本发明的蛋白质组反 应器的灵敏度和非标记定量分析能力与in-StageTip method相当。
[0057]由于传统的自由溶液酶解方法需要过夜酶解。而本发明的蛋白质组反应器具有酶 解时间短、效率高的优势。如图5所示，使用所述的蛋白质组反应器处理20，000个HEK 293T 细胞，不分级时可以鉴定到大于2,900个蛋白质。并且，当酶解时间由120分钟降到15分钟， 鉴定的蛋白质数量并没有减少。因此，本发明的蛋白质组反应器可以在15分钟内高效地完 成蛋白质的酶解。
[0058] 实施例1
[0059]如图1中的(A)和(B)所示，一种集成蛋白质前处理和多肽高pH值反相分级的蛋白 质组反应器，包括移液枪枪头1、强阳离子交换树脂填料2和C18膜3。其中，移液枪枪头1为标 准的200yL枪头，Ci8膜3 (3M Empore，USA)填充于移液枪枪头1下端，长度约3mm，1.2mg强阳离 子交换树脂填料(磺酸基强阳离子交换树脂填料)2(Applied Biosystems，USA)填充于移液 枪枪头1下端及C18膜3之上。
[0060]将支撑块4置于1.5mL收集管5上端，将蛋白质组反应器通过支撑块4置于收集管5 之上，将收集管5放入离心机6中，通过离心作用可使蛋白质溶液或者试剂流过蛋白质组反 应器，完成蛋白质的预富集、酶解、多肽的除盐和高pH值反相分级等操作，具体步骤如下： [0061 ] 取50，000个细胞样品，加入25yL兼容性裂解液，裂解液成分为10mm〇l/L HEPES，pH 7·4，150mmol/L NaCl，2mmol/L CaCl2，2mmol/L MgCl2，600mmol/L guanidine HC1，1%DDM 和蛋白酶抵制剂，裂解完成后加入三氟乙酸将样品溶液酸化至PH2。蛋白质组反应器首先分 别通过20yL的甲醇、20yL的100mmol/L梓檬酸钾水溶液和20yL的10mmol/L梓檬酸钾水溶液 活化。活化后，将样品加入蛋白质反应器中，通过在离心机6内离心使蛋白质富集到强阳离 子交换树脂填料2上;接着，使用含有20%乙腈的8mmol/L柠檬酸钾水溶液清洗掉结合到C 18 膜3上的表面活性剂DDM;接着，加入10mm〇l/L三（2-羧乙基）膦盐酸盐（1^8(2_ carboxyethyl )phosphine hydrochloride，TCEP)溶液，在室温下反应15分钟，完成蛋白质 的还原。接着，加入20yL超纯水洗去TCEP，再加入含有4yg胰蛋白酶的10mmol/L碘乙酰铵溶 液，在室温和黑暗的环境下反应60分钟，完成蛋白质的烷基化和酶解。接着，使用20yL的 200mmol/L甲酸铵水溶液将生成的多肽从强阳离子交换树脂填料2转移到C 18膜3上;接着，加 入20yL的5mmo 1/L甲酸铵水溶液进行除盐。最后，使用pH值为10的分别含有3 %、6 %、9 %、 15%、80%乙腈的5mmol/L甲酸铵溶液依次将多肽洗脱下来，即进行高pH值反相分级。洗脱 下来的多肽在冻干机冻干后复溶于0.1%甲酸水溶液，即可用液相色谱-质谱进行分析。 [0062] 使用本实施例所述的蛋白质组反应器处理20,000个HEK 293T细胞，不分级时可以 鉴定到大于2,900个蛋白质，并且，当酶解时间由120分钟降到15分钟，鉴定的蛋白质数量并 没有减少。因此，本实施例的蛋白质组反应器可以在15分钟内高效地完成蛋白质的酶解。 [0063] 实施例2
[0064] 一种集成蛋白质前处理和多肽高pH值反相分级的蛋白质组反应器，包括移液枪枪 头1、强阳离子交换树脂填料2和C18膜3。其中，移液枪枪头1为标准的200yL枪头，C18膜3 (3M Empore，USA)填充于移液枪枪头1下端，长度约3mm，1.2mg强阳离子交换树脂填料(磺酸基强 阳离子交换树脂填料)2(Applied Biosystems，USA)填充于移液枪枪头1下端及Cis膜3之上。 [0065]将支撑块4置于1.5mL收集管5上端，将蛋白质组反应器通过支撑块4置于收集管5 之上，将收集管5放入离心机6中，通过离心作用可使蛋白质溶液或者试剂流过蛋白质组反 应器，完成蛋白质的预富集、酶解、多肽的除盐和高pH值反相分级等操作，具体步骤如下： [0066] 取50,000个细胞样品，加入25yL兼容性裂解液，裂解液成分为10mmol/L HEPES，pH 7.4,150mmol/L NaCl，2mmol/L CaCl2，2mmol/L MgCl2,600mmol/L guanidine HC1，1 %胆固 醇琥泊酸单酯三轻甲基氨基甲烧盐(〇1〇168七6巧111611^811(^；[仙七6 1：1^8 3311：，013)和蛋白 酶抵制剂，裂解完成后加入三氟乙酸将样品溶液酸化至PH2。蛋白质组反应器首先分别通过 20yL的甲醇、20yL的100mmol/L梓檬酸钾水溶液和20yL的10mmol/L梓檬酸钾水溶液活化。活 化后，将样品加入蛋白质反应器中，通过在离心机6内离心使蛋白质富集到强阳离子交换树 脂填料2上;接着，使用含有20 %乙腈的8mmol/L柠檬酸钾水溶液清洗掉结合到C18膜3上的表 面活性剂CHS ;接着，加入10mmol/L三（2-羧乙基）膦盐酸盐（Tris( 2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride，TCEP)溶液，在室温下反应15分钟，完成蛋白质的还原。接着，加 入20yL超纯水洗去TCEP，再加入含有4yg胰蛋白酶的10mm 0l/L碘乙酰铵溶液，在室温和黑暗 的环境下反应60分钟，完成蛋白质的烷基化和酶解。接着，使用20yL的200mmol/L甲酸铵水 溶液将生成的多肽从强阳离子交换树脂填料2转移到C 18膜3上;接着，加入20yL的5mmol/L甲 酸铵水溶液进行除盐。最后，使用pH值为10的分别含有3 %、6 %、9 %、15 %、80 %乙腈的 5mmol/L甲酸铵溶液依次将多肽洗脱下来，即进行高pH值反相分级。洗脱下来的多肽在冻干 机冻干后复溶于0.1 %甲酸水溶液，即可用液相色谱-质谱进行分析。
[0067] 使用本实施例所述的蛋白质组反应器处理20,000个HEK 293T细胞，不分级时可以 鉴定到大于2,900个蛋白质，并且，当酶解时间由120分钟降到16分钟，鉴定的蛋白质数量并 没有减少。因此，本实施例的蛋白质组反应器可以在16分钟内高效地完成蛋白质的酶解。 [0068] 实施例3
[0069] 一种集成蛋白质前处理和多肽高pH值反相分级的蛋白质组反应器，包括移液枪枪 头1、强阳离子交换树脂填料2和C18膜3。其中，移液枪枪头1为标准的200yL枪头，C18膜3 (3M Empore，USA)填充于移液枪枪头1下端，长度约3mm，1.2mg强阳离子交换树脂填料(磺酸基强 阳离子交换树脂填料)2(Applied Biosystems，USA)填充于移液枪枪头1下端及Cis膜3之上。
[0070] 将支撑块4置于1.5mL收集管5上端，将蛋白质组反应器通过支撑块4置于收集管5 之上，将收集管5放入离心机6中，通过离心作用可使蛋白质溶液或者试剂流过蛋白质组反 应器，完成蛋白质的预富集、酶解、多肽的除盐和高pH值反相分级等操作，具体步骤如下：
[0071] 取50，000个细胞样品，加入25yL兼容性裂解液，裂解液成分为10mm〇l/L HEPES，pH 7.4,150mmol/L NaCl，2mmol/L CaCl2,2mmol/L MgCl2,600mmol/L guanidine HC1，0·5% DDM，0.5 % CHS和蛋白酶抵制剂，裂解完成后加入三氟乙酸将样品溶液酸化至pH2。蛋白质组 反应器首先分别通过20yL的甲醇、20yL的100mm 〇l/L柠檬酸钾水溶液和20yL的10mm〇l/L柠 檬酸钾水溶液活化。活化后，将样品加入蛋白质反应器中，通过在离心机6内离心使蛋白质 富集到强阳离子交换树脂填料2上;接着，使用含有20 %乙腈的8mmo 1 /L柠檬酸钾水溶液清 洗掉结合到C18膜3上的表面活性剂DDM和CHS;接着，加入10mm〇l/L三(2-羧乙基)膦盐酸盐 (Tris(2_carboxyethy 1)phosphine hydrochloride，TCEP)溶液，在室温下反应 15分钟，完 成蛋白质的还原。接着，加入20yL超纯水洗去TCEP，再加入含有4yg胰蛋白酶的10mm〇l/L碘 乙酰铵溶液，在室温和黑暗的环境下反应60分钟，完成蛋白质的烷基化和酶解。接着，使用 20yL的200mmol/L甲酸铵水溶液将生成的多肽从强阳离子交换树脂填料2转移到C 18膜3上； 接着，加入20yL的5mmo 1 /L甲酸铵水溶液进行除盐。最后，使用pH值为10的分别含有3 %、 6%、9%、15%、80%乙腈的5mmol/L甲酸铵溶液依次将多肽洗脱下来，即进行高pH值反相分 级。洗脱下来的多肽在冻干机冻干后复溶于0.1 %甲酸水溶液，即可用液相色谱-质谱进行 分析。
[0072] 使用本实施例所述的蛋白质组反应器处理20,000个HEK 293T细胞，不分级时可以 鉴定到大于2,900个蛋白质，并且，当酶解时间由120分钟降到18分钟，鉴定的蛋白质数量并 没有减少。因此，本实施例的蛋白质组反应器可以在18分钟内高效地完成蛋白质的酶解。
[0073] 实施例4
[0074] 一种集成蛋白质前处理和多肽高pH值反相分级的蛋白质组反应器，包括移液枪枪 头1、强阳离子交换树脂填料2和C18膜3。其中，移液枪枪头1为标准的200yL枪头，C18膜3 (3M Empore，USA)填充于移液枪枪头1下端，长度约3mm，1.2mg强阳离子交换树脂填料(磺酸基强 阳离子交换树脂填料)2(Applied Biosystems，USA)填充于移液枪枪头1下端及Cis膜3之上。 [0075]将支撑块4置于1.5mL收集管5上端，将蛋白质组反应器通过支撑块4置于收集管5 之上，将收集管5放入离心机6中，通过离心作用可使蛋白质溶液或者试剂流过蛋白质组反 应器，完成蛋白质的预富集、酶解、多肽的除盐和高pH值反相分级等操作，具体步骤如下： [0076] 取50,000个细胞样品，加入25yL兼容性裂解液，裂解液成分为10mm〇l/L HEPES，pH 7.4,150mmol/L NaCl，2mmol/L CaCl2,2mmol/L MgCl2,600mmol/L guanidine HC1，0·5% DDM，0.5 % CHS和蛋白酶抵制剂，裂解完成后加入三氟乙酸将样品溶液酸化至pH2。蛋白质组 反应器首先分别通过20yL的甲醇、20yL的100mm 〇l/L柠檬酸钾水溶液和20yL的10mm〇l/L柠 檬酸钾水溶液活化。活化后，将样品加入蛋白质反应器中，通过在离心机6内离心使蛋白质 富集到强阳离子交换树脂填料2上;接着，使用含有10%乙腈和10%甲醇的8mm 〇l/L柠檬酸 钾水溶液清洗掉结合到C18膜3上的表面活性剂DDM和CHS;接着，加入10mm 〇l/L三(2-羧乙基） 勝盐酸盐（Tris(2_carboxyethyl)phosphine hydrochloride，TCEP)溶液，在室温下反应 15 分钟，完成蛋白质的还原。接着，加入20yL超纯水洗去TCEP，再加入含有4yg胰蛋白酶的 10mm〇l/L碘乙酰铵溶液，在室温和黑暗的环境下反应60分钟，完成蛋白质的烷基化和酶解。 接着，使用20yL的200mmol/L甲酸铵水溶液将生成的多肽从强阳离子交换树脂填料2转移到 C 18膜3上;接着，加入20yL的5mmo 1 /L甲酸铵水溶液进行除盐。最后，使用pH值为10的分别含 有3%、6%、9%、15%、80%乙腈的5mmol/L甲酸铵溶液依次将多肽洗脱下来，即进行高pH值 反相分级。洗脱下来的多肽在冻干机冻干后复溶于〇. 1 %甲酸水溶液，即可用液相色谱-质 谱进行分析。
[0077] 使用本实施例所述的蛋白质组反应器处理20,000个HEK 293T细胞，不分级时可以 鉴定到大于2,900个蛋白质，并且，当酶解时间由120分钟降到20分钟，鉴定的蛋白质数量并 没有减少。因此，本实施例的蛋白质组反应器可以在20分钟内高效地完成蛋白质的酶解。
[0078] 实施例5
[0079] 一种集成蛋白质前处理和多肽高pH值反相分级的蛋白质组反应器，包括移液枪枪 头1、强阳离子交换树脂填料2和C18膜3。其中，移液枪枪头1为标准的200yL枪头，C18膜3 (3M Empore，USA)填充于移液枪枪头1下端，长度约3mm，1.2mg强阳离子交换树脂填料(磺酸基强 阳离子交换树脂填料)2(Applied Biosystems，USA)填充于移液枪枪头1下端及Cis膜3之上。 [0080]将支撑块4置于1.5mL收集管5上端，将蛋白质组反应器通过支撑块4置于收集管5 之上，将收集管5放入离心机6中，通过离心作用可使蛋白质溶液或者试剂流过蛋白质组反 应器，完成蛋白质的预富集、酶解、多肽的除盐和高pH值反相分级等操作，具体步骤如下： [0081 ] 取50，000个细胞样品，加入25yL兼容性裂解液，裂解液成分为10mm〇l/L HEPES，pH 7·4，150mmol/L NaCl，2mmol/L CaC!2，2mmol/L MgC!2，600mmol/L guanidine HC1，1%DDM 和蛋白酶抵制剂，裂解完成后加入三氟乙酸将样品溶液酸化至PH2。蛋白质组反应器首先分 别通过20yL的甲醇、20yL的100mmol/L梓檬酸钾水溶液和20yL的10mmol/L梓檬酸钾水溶液 活化。活化后，将样品加入蛋白质反应器中，通过在离心机6内离心使蛋白质富集到强阳离 子交换树脂填料2上;接着，使用含有20%乙腈的8mmol/L柠檬酸钾水溶液清洗掉结合到C 18 膜3上的表面活性剂DDM;接着，加入10mm〇l/L三（2-羧乙基）膦盐酸盐（1^8(2_ carboxyethyl )phosphine hydrochloride，TCEP)溶液，在室温下反应15分钟，完成蛋白质 的还原。接着，加入20yL超纯水洗去TCEP，再加入含有4yg胰蛋白酶的10mmol/L碘乙酰铵溶 液，在室温和黑暗的环境下反应60分钟，完成蛋白质的烷基化和酶解。接着，使用20yL的 200mmol/L甲酸铵水溶液将生成的多肽从强阳离子交换树脂填料2转移到C 18膜3上;接着，加 入20yL的5mmo 1/L甲酸铵水溶液进行除盐。最后，使用pH值为10的分别含有3 %、6 %、9 %、 15%、80%乙腈的5mmol/L甲酸铵和碳酸氢铵溶液依次将多肽洗脱下来，即进行高pH值反相 分级。洗脱下来的多肽在冻干机冻干后复溶于0.1%甲酸水溶液，即可用液相色谱-质谱进 行分析。
[0082] 使用本实施例所述的蛋白质组反应器处理20,000个HEK 293T细胞，不分级时可以 鉴定到大于2,900个蛋白质，并且，当酶解时间由120分钟降到17分钟，鉴定的蛋白质数量并 没有减少。因此，本实施例的蛋白质组反应器可以在17分钟内高效地完成蛋白质的酶解。
[0083]
【申请人】声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细结构特征，但本发明并 不局限于上述详细结构特征，即不意味着本发明必须依赖上述详细结构特征才能实施。所 属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用部件的等效替换 以及辅助部件的增加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
[0084] 以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中 的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这 些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0085] 另外需要说明的是，在上述【具体实施方式】中所描述的各个具体技术特征，在不矛 盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可 能的组合方式不再另行说明。
[0086] 此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本 发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
【主权项】
1. 一种蛋白质组反应器，其特征在于，所述蛋白质组反应器包括移液枪枪头（1)、强阳 离子交换树脂填料(2)和固相萃取膜(3);固相萃取膜(3)填充于移液枪枪头（1)的下端，强 阳离子交换树脂填料(2)填充于移液枪枪头(1)下端并位于固相萃取膜(3)之上。2. 根据权利要求1所述的蛋白质组反应器，其特征在于，所述强阳离子交换树脂填料为 磺酸基强阳离子交换树脂填料； 优选地，所述固相萃取膜为C18膜。3. -种蛋白质的自动化反应系统，其特征在于，所述自动化反应系统包括如权利要求1 或2所述的蛋白质组反应器； 优选地，所述自动化反应系统还包括自动化液体处理平台。4. 根据权利要求1-3任一项所述的蛋白质组反应器在细胞或者组织样品的蛋白质鉴定 和定量蛋白质组学中的应用。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，将所述蛋白质组反应器用于生物样本中样 品的前处理和多肽高pH值反相分级； 优选地，将生物样本中的蛋白质样品在强阳离子交换树脂填料上进行酶解，酶解完成 后将生成的多肽转移到固相萃取膜上，再进行高pH值反相分级； 优选地，所述高pH值反相分级的pH值高于8。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括以下步骤： (1) 细胞或者组织样品经裂解液裂解并酸化后，加到预先活化好的蛋白质组反应器中， 通过离心使蛋白质富集到强阳离子交换树脂填料上； (2) 使用含有机溶剂的溶液或者纯有机溶剂清洗掉结合到固相萃取膜上的表面活性 剂，依次加入相应的试剂和酶，完成蛋白质的还原、烷基化和酶解； (3) 使用盐溶液将生成的多肽从强阳离子交换树脂填料转移到固相萃取膜上； (4) 除盐后，使用高pH值的含有不同比例有机溶剂的溶液按从低到高的比例依次将多 肽洗脱下来，进行高pH值反相分级； 优选地，所述分级时使用溶液的pH值高于8。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤（1)所述裂解液中的表面活性剂是高 pH值反相分级和液相色谱-质谱兼容的，优选为正十二烷基-β-D-麦芽糖苷、胆固醇琥珀酸 单酯三羟甲基氨基甲烷盐中的任意一种或两种的混合物。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤(2)所述含有机溶剂的溶液选自含有 乙腈和/或甲醇的柠檬酸钾水溶液，其中，乙腈和/或甲醇在所述溶液中的体积含量为20%， 柠檬酸钾在所述溶液中的浓度为8mmol/L; 优选地，步骤(2)所述纯有机溶剂为乙腈和/或甲醇； 优选地，步骤(3)所述盐溶液为挥发性盐溶液，优选为甲酸铵和/或碳酸氢铵。
【文档编号】G01N30/06GK105866317SQ201610199973
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年3月31日
【发明人】田瑞军, 陈文东
【申请人】南方科技大学