用于增强蛋白质表达的融合肽的制作方法
【专利说明】用于增强蛋白质表达的融合肽 发明领域
[0001] 本发明涉及新的肽，其能够被用于增强所关注的蛋白质的产量。所述肽源自血型 糖蛋白的细胞外结构域，并被用作与所关注的蛋白质融合的蛋白质的一部分。本发明特别 提供表达盒，其包含这样的肽作为开放阅读框的一部分。
[0002] 发明背景
[0003] 重组蛋白质的生产是当今生物技术产业的一个主要方面。由于在市场上增加了许 多需要大量优质蛋白质的应用，这正变得越来越重要。食品生产和特别是药学是对重组蛋 白质的需求稳定增加的两个主要领域。获得商业上可行的工艺需要最终产品更高的生产效 率和因此更低的成本。
[0004] 但同时，高产品质量和与人应用的相容性是必不可少的。越来越多的应用需要在 真核细胞（特别是高等真核细胞）中重组生产蛋白质。当将它们表达于原核细胞系统（如 大肠杆菌）或真核细胞系统（如特别是人细胞系）时，特别是携带翻译后修饰的蛋白质（如 糖基化（糖蛋白））显著不同。在许多情况下，这些不同显著影响所产生的蛋白质的生物活 性以及免疫原性。但是，使用高等真核细胞系的许多表达系统受所期望的蛋白质的相当低 的表达速率的影响，导致重组蛋白质的低产量和高成本。
[0005]因此，现有技术中存在提供（特别是使用真核表达细胞系时）用于增加重组蛋白 质生产的产量的新手段和方法的需要。
[0006] 发明概述
[0007] 本发明人能够证实，当不同蛋白作为与血型糖蛋白的细胞外区或其部分融合的融 合蛋白质表达时，它们的产量和生产速率得到显著增加。与使用相同的表达载体在相同的 条件下单独表达所关注的蛋白质相比，所述融合蛋白质的表达速率提高了高达10倍。对于 所关注的蛋白质的后续应用，可以作为融合蛋白质使用它或可以使用构建于两个融合伙伴 之间的蛋白酶识别位点将所述血型糖蛋白的细胞外区或其部分从所关注的蛋白质裂解掉。
[0008] 鉴于上述情况，本发明在第一个方面提供表达盒，其包含启动子区、表达元件和任 选地转录终止子区，其中所述表达元件包含编码血型糖蛋白的细胞外区或其部分的核酸序 列，并且其中所述表达盒不包含编码整个血型糖蛋白的核酸序列。特别地，所述表达盒的所 述表达元件还包含编码所关注的肽的核酸序列，其中，当表达所述表达元件时，所述所关注 的肽和所述血型糖蛋白的细胞外区或其部分形成融合肽。
[0009] 在更多的方面，本发明提供包含根据第一个方面的表达盒的载体和包含所述表达 盒或所述载体的宿主细胞。
[0010] 在另一个方面，本发明提供用于生产所关注的肽的方法，其包括以下步骤
[0011] (a)提供包含根据第一个方面的包括编码所述所关注的肽的核酸序列的表达盒的 宿主细胞；
[0012] (b)在所述宿主细胞表达包含所述所关注的肽和所述血型糖蛋白的细胞外区或其 部分的融合肽的条件下培养所述宿主细胞；
[0013] (c)获得所述所关注的肽，任选地以所述融合肽的形式。
[0014] 此外，本发明提供包含血型糖蛋白的细胞外区或其部分和所关注的肽的融合肽， 其可通过根据本发明的用于生产所关注的肽的方法获得。
[0015] 在另一个方面，本发明提供用于增加所关注的肽在重组生产中的产量的方法，其 包括作为融合肽的部分表达所述所关注的肽的步骤，所述融合肽还包含血型糖蛋白的细胞 外区或其部分。此外，本发明也提供血型糖蛋白的细胞外区或其部分与所关注的肽一起以 融合肽的形式用于增加所述所关注的肽在重组生产中的产量的用途。
[0016] 上述方面可以进行组合。从以下描述和所附的权利要求书，对于本领域技术人员 来说，本发明的其它目的、特征、优点和方面将变得明显。但是，应当理解的是，以下描述、所 附的权利要求书和具体的实施例（其表示本发明的优选实施方案）仅以说明的方式给出。 在阅读以下内容之后，对于本领域技术人员来说，所公开的发明的精神和范围内的各种变 化和修改将容易变得明显。
[0017] 定义
[0018] 除了在使用它们的上下文中另有说明之外，以下表述通常旨在优选具有如下所述 的意义。
[0019] 如本文中所使用的表述"包含"除了其字面意义也包括并具体指表述"基本上 由……组成"和"由……组成"。因此，表述"包含"是指其中"包含"具体列出的要素的主题 不包含更多的要素的实施方案以及"包含"具体列出的要素的主题可以和/或实际上包括 更多的要素的实施方案。同样，表述"具有"应当被理解为表述"包含"，也包括并具体指表 述"基本上由……组成"和"由……组成"。
[0020] "表达盒"是用能够在与这些序列相容的宿主中实现结构基因表达的核酸元件产 生或合成的核酸构建体。表达盒包括至少启动子和任选地转录终止子信号。典型地，所述表 达盒包括待转录的核酸和启动子。也可以如本文所述使用有助于实现表达的另外的因子。 例如，表达盒也可以包括编码指导表达的蛋白质从所述宿主细胞分泌的信号序列的核苷酸 序列。表达盒优选为表达载体的一部分。将应当被用于表达待转录的核酸的宿主细胞用所 述表达载体进行转化或转染。为了允许选择包含所述构建体的转化细胞，可以将可选择标 记物基因便利地包含于所述表达载体中。本领域技术人员将会认识到可以在基本上不影响 其功能的情况下修饰该载体组分。
[0021] 表述"功能上彼此连接"是指表达盒的所述元件以这样的方式彼此连接：它们的 功能是协调的并允许编码序列（例如所述表达元件）的表达。举例来说，当启动子能够确 保编码序列的表达时，它是功能上连接至所述编码序列的。可以使用本领域技术人员众所 周知的技术进行根据本发明的表达盒的构建和其各种元件的装配，特别是在Sambrook等 (1989,MolecularCloning:ALaboratoryManual,NolanC.ed.,NewYork:ColdSpring HarborLaboratoryPress)中所描述的那些技术。
[0022] 靶核酸序列或氨基酸序列的"同源物"与所述靶核酸序列或氨基酸序列享有至少 75%、更优选至少80%、至少85%、至少90%、至少93%、至少95%或至少97%的同源性或 同一性。氨基酸序列或核苷酸序列的"同源性"或"同一性"优选在所述靶序列的整个长度 上或在所述靶序列的指定部分的整个长度上根据本发明进行确定。
[0023]如本文中所使用的"肽"是指包含至少5个氨基酸的多肽链。肽优选包含至少10 个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个或至少35个氨基酸。如本文中所使用的 术语"肽"也指蛋白质，包括翻译后被修饰过的肽和蛋白质。特别地，术语肽包括糖基化肽 和糖蛋白。
[0024] 肽或蛋白质的一部分优选包含所述肽或蛋白质的至少3个连续氨基酸，优选所述 蛋白质的至少5个、至少10个、至少15个或至少20个连续氨基酸。
[0025] 术语"药物组合物"和类似的术语特别是指适于施用于人的组合物，即含有药学可 接受的组分的组合物。优选地，药物组合物包含活性化合物或其盐或前药以及载体、稀释剂 或药物赋形剂（如缓冲剂、防腐剂和张力调节剂）。
[0026] 发明详述
[0027]本发明涉及表达盒，其包含启动子区、表达元件和任选地转录终止子区，其中所述 表达元件包含编码血型糖蛋白的细胞外区或其部分的核酸序列。所述表达盒被设计用于在 宿主细胞中表达所关注的肽。编码所述所关注的肽的核酸序列可以已经存在于根据本发明 的表达盒的表达元件中或可以被克隆进入所述表达元件。所述所关注的肽和所述血型糖蛋 白的细胞外区或其部分在表达元件中功能上彼此连接，使得它们被表达为融合肽。
[0028] 但是，所述所关注的肽不是所述血型糖蛋白的剩余部分并且所述表达盒不包含编 码整个血型糖蛋白的核酸序列。特别地，所述表达盒不包含编码所述糖蛋白的跨膜区和/ 或细胞质区的核酸序列。
[0029] 血型糖蛋白的细胞外区或其部分
[0030] 所述血型糖蛋白可以是血型糖蛋白家族的任何成员。优选地，所述血型糖蛋白是 哺乳动物或啮齿动物血型糖蛋白，更优选人血型糖蛋白。所述血型糖蛋白特别选自由血型 糖蛋白A、血型糖蛋白B、血型糖蛋白C和血型糖蛋白E组成的组，并优选为血型糖蛋白A。 在特别优选的实施方案中，所述血型糖蛋白是具有SEQIDNO: 1的氨基酸序列的人血型糖 蛋白A。人血型糖蛋白A也被称为丽唾液酸糖蛋白、PAS-2、唾液酸糖蛋白a和⑶235a。
[0031] 血型糖蛋白由N-末端细胞外区、跨膜区和C-末端细胞质区组成。此外，所述血型 糖蛋白表达有N-末端定位信号肽，其在表达之后被切除，从而形成成熟血型糖蛋白。除非 另外指明，否则如本文中所使用的术语"血型糖蛋白"是指不包含定位信号肽的成熟血型糖 蛋白。成熟血型糖蛋白不包含所述定位信号肽。该定位信号肽不形成所述血型糖蛋白的细 胞外区的一部分。因此，血型糖蛋白的细胞外区开始于成熟血型糖蛋白的N-末端并终止于 直接位于跨膜区N-末端的氨基酸。任何蛋白质的跨膜区，特别是任何血型糖蛋白的跨膜区 能够被本领域技术人员例如使用合适的序列分析工具容易地鉴定。对于已知血型糖蛋白， 所述跨膜结构域也被示于通常可获得的蛋白质数据库中（参见例如UniProtconsortium 的UniProtKB蛋白质数据库，www.uniprot.org)。例如，人血型糖蛋白A的跨膜结构域由 SEQIDNO: 1的氨基酸73至95组成。因此，人血型糖蛋白A的细胞外区由SEQIDNO: 1的 氨基酸1至72组成。
[0032] 如本文中所使用的血型糖蛋白的细胞外区的部分是指包含如本文中所定义的血 型糖蛋白的细胞外区的至少10个连续氨基酸的肽。优选地，所述细胞外区的部分包含血型 糖蛋白的细胞外区的至少15个、更优选至少20个、至少25个、至少30个或至少35个连续 氨基酸。在优选的实施方案中，所述细胞外区的部分包括位于所述细胞外区的N-末端区的 氨基酸。特别地，所述细胞外区的部分包含所述细胞外区的头40个氨基酸的至少10个、优 选至少15个、更优选至少20个、至少25个、至少30个或至少35个连续氨基酸。在人血型 糖蛋白A的情况