用于与蛋白质和肽缀合的四个支链的树枝状大分子peg的制作方法
【专利说明】用于与蛋白质和化缀合的四个支链的树枝状大分子PEG
[0001] 本申请是申请号为200680049165. 1的中国专利申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明设及具有四个支链的聚己二醇（PEG)的树枝状大分子样聚合结构，用于获 得药学目的的缀合物。
【背景技术】
[0003] 治疗性蛋白质与聚己二醇的缀合对于一些药理学性质的益处是众所周知的。例 如，由于不同的原因，在血中的半衰期延长，其中：聚合残基可W防止蛋白酶的攻击和通过 免疫系统进行的药物的识别，至于天然蛋白质，缀合物的流体力学体积显著地减少了肾滤 过。尽管在很多情况中，阳G化会影响蛋白质的体外生物活性，但是在血中寿命的显著延 长使得其治疗作用更为有效化arrisJ.M.yQiessR.B. (2003化ffectofpeg}dationon pharmaceuticals.Nat.Rev.DrugDiscov. 2 ;214-21)。
[0004] 阳G化也从立体上阻止了疏水性相互作用诱导的降解途径，产生了立体非特异性 障碍，从而减小了与蛋白质热不稳定性有关的分子间作用力。所有该些使得PEG化的蛋白 质比未修饰的分子具有了更高的物理稳定性，该是一种对于最终药物制剂的制备非常有用 的性质(HarrisJ.M.yChessR.B. (2003)Effectofpegylationonpharmaceuticals. 化1:.Rev.DrugDiscov. 2 ;214-21)。
[0005] 常用于蛋白质缀合的试剂是在其一个末端甲基化的聚己二醇，称作单甲氧基聚己 二醇（mPEG)。甲基保护PEG链的一个末端的事实使得其仅能通过另一个末端激活，成为单 官能化试剂。该对于治疗性蛋白质的缀合是非常重要的，因为一般与双官能化或多官能化 试剂的缀合会导致交联，从而影响蛋白质的生物活性。mPEG分子总是具有一小部分的非甲 基化聚合物，即二醇部分。由于更难W控制非常长的链的聚合过程，因此在较高分子量的 mPEG中二醇部分的比例更高（Robe;rtsM.J. ,Bentl巧M.D. ,Har;risJ.M. (2002)Qiemistry forpeptide和蛋白质阳Gylation.Adv.DrugDeliv.Reviews54 ;459-76)。
[0006] 由PEG衍生的第一类分子中的一种是通过与氯化氯反应而合成的。但是该试剂的 缀合试验引起了广泛的PEG化。该是治疗性蛋白质所不期望的，因为PEG化的程度较高会 导致生物活性突然降低，原因在于直接阻断活性位点，或是掩盖了易接触的蛋白质表面的 该些位点的拓扑变化。通常，期望的缀合物是在每个蛋白质分子上仅有一个阳G残基；该分 子已知是单-PEG化的。
[0007] 从80年代开始，开始使用"更软"的活性基团。尽管也可W使用其他基团，但 该些基团主要是N-哲基班巧酷亚胺醋。S种最常见的基团是；班巧酷亚胺班巧酸醋、 S氣己基横酸醋（tres^ate)和班巧酷亚胺碳酸醋。该时的活化阳G被称作第一代活 化阳G(Robe;rtsM.J.,Bentl巧M.D.'HarrisJ.M. (2002)QiemistryforP邱tideand proteinPEGylation.Adv.DrugDeliv.Reviews54:459-76)。
[0008] 90年代后半期出现了第二代的活化PEG。它有两个重要的进步：能够更为 选择性地PEG化的基团（例如：优选通过蛋白质的N末端缀合的醒基）和支链结构(RobertsM.J. ,BentleyM.D. ,HarrisJ.M. (2002)Chemistryforpeptideandprotein 阳Gylation.Adv.DrugDeliv.Reviews54 ;459-76)。支链阳G的例子是用两个支链单官能 化的扣S5, 932, 462)，用四个支链四官能化的和用八个支链八官能化的。缀合治疗性蛋白 质的更有用的活化PEG是单官能化的，因为它们避免了蛋白质和聚合物之间的交联。支链 PEG也具有伞样的结构，从而更好地保护蛋白质的表面。
[0009] 两个支链的单官能化的阳G能够得到具有干扰素a-2a的缀合物，该缀合物比天 然蛋白质在临床中显示出更好的效果（RajenderReddyK.,ModiM.W.,PedderS. (2002) Useofpeginterferonalfa-2a(40KD)(Pegasys)forthetreatmentofhepatitis C.Adv.DrugDeliv.Reviews54:571-86)。
[0010] 至于mPEG合成的现有技术，仅仅能获得30kDa的链，原因在于具有两个支链的试 剂能够获得最大为60kDa的分子量。人们期望具有更高分子量的单官能化的PEG的结构， 其可W用于探索更宽范围的缀合物，W在某些蛋白质中得到最佳的值。但是，在上述的报告 中都没有使用、表征或提及单官能化和具有两个W上的PEG链的PEG化试剂。在获得具有 两个W上的阳G链的试剂的情况中，可W获得更高分子量的缀合物，除了上述的优点W外， 它允许使用更短的mPEG线性支链使类似分子量的阳G化试剂成为两个支链的结构。该些 较小的支链含有的二醇部分量更小，该使得合成过程更容易。
【发明内容】
[0011] 本发明解决了上述问题，提供了具有四个mPEG支链的单官能化树枝状大分子样 结构。该结构能够获得具有高达120kDa的聚合残基的缀合物。该个事实可W用于探索具有 广泛不同的分子量的缀合物，包括具有高分子量的缀合物。此外，使用该个方法，可W获得 分子量与其他支链化的单官能化试剂类似的PEG分子，但是它具有较低分子量的线性链。
[0012] 在本发明一个优选的实施方案中，获得了一种聚合结构，其中PEG链的分子量为 5, 000 到 30,OOODa，总分子量为 20, 000 到 120,OOODa。
[0013] 使用小的线性链几乎消除了在较大的线性PEG分子中的二醇污染。出人意料地， 与类似分子量但是用仅有两个支链的结构制备的缀合物相比，具有本发明所述结构的缀合 物具有高得多的物理-化学稳定性（耐高温和蛋白酶降解）。同时出人意料的是，它们在血 中具有更高的平均寿命。另一个出人意料的结果是具有本发明树枝状大分子样结构的缀合 物更为同质，与具有类似分子量但仅有两个支链的缀合物所获得的结果相比，具有更少的 位置异构体。
[0014] 树枝状大分子样四个支链的单官能化的PEG是在两个主要步骤中获得的。第一个 步骤是通过两个线性PEG分子与核结合来合成两支链-衍生物，其中该核可W是例如赖氨 酸。其他作者已经使用类似方法获得了良好的结果扣S5, 932, 462)。第二个步骤是与前 一步骤类似，将两分子的两支链-衍生物与核结合，获得四支链-衍生物。为了在第一步骤 中将两个线性PEG支链与核结合，它们需要具有活性基团。该基团可W选自现有技术水平 已知的基团。例如，其中包括班巧酷亚胺班巧酸醋、班巧酷亚胺碳酸醋、对硝基苯基碳酸醋、 班巧酷亚胺丙酸醋、班巧酷亚胺了酸醋。在本发明中优选的线性活化阳G是班巧酷亚胺碳 酸醋。该主要是由于下列主要的不同原因；该试剂和具有游离氨基的核之间具有良好的反 应性，制备官能化阳G的方法简便。合成方法（MironT.，WilchekM. (1993)ASimplified MethodforthePreparationof班巧酷亚胺碳酸醋化lyethyleneGlycolforCoupling toProteins.Biocoru'ugateQiem. 4:568-69)是本领域技术人员公知的；
[0015]
[0016] 当准备好线性的活化PEG时，通过与选作核的分子进行反应可W容易地完成第一 个步骤。在本发明一个优选的实施方案中，由于其生物适合性，核是k赖氨酸，它具有两个 游离的氨基和一个駿基，它们可W在随后用于被激活。
[0017] 通过色谱法可W从反应混合物中容易地纯化两支链-衍生物。用核分子激活该两 支链-衍生物W用于后续的反应并合成四支链-衍生物。可不同方法激活该产品，但 是根据效力和简便性优选的一种方法是形成N-哲基班巧酷亚胺醋。
[0018]
[0019] 该方法已经成功地用于激活具有包含阳G链的结构的駿基，使其成为N-哲基班巧 酷亚胺醋扣S4, 732, 863,US5, 932, 462)。
[0020] 制备四支链-衍生物的第二个阶段包括两支链-衍生物与核分子的反应，其与本 发明的第一个阶段类似；本发明的一个优选实施方案是使用心赖氨酸作为核。
[0021]
[0022] 通过色谱法可W容易地从反应混合物中纯化感兴趣的衍生物。
[0023] 使用不同的反应性基团与蛋白质缀合可W激活树