一种多肽及蛋白质高效活性保护剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种多肽及蛋白质高效活性保护剂。属于生物技术多肽及蛋白质领 域。
【背景技术】
[0002] 多妝及蛋白质（protein)是生命的物质基础，没有多妝及蛋白质就没有生命。因 此，它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。机体中的每一个细胞和 所有重要组成部分都有多肽及蛋白质参与。因此多肽及蛋白质在各个领域的研究和应用一 直是热点。然而很多生物活性多肽及蛋白质在制备及保存过程中极易失活，不利于保存和 应用。各种氧化剂能氧化带芳香族侧链的氨基酸如色氨酸、半胱氨酸、组氨酸、酪氨酸、蛋氨 酸残基，从而使蛋白质变性。分子氧、H202和氧自由基是常见的蛋白质氧化剂。稀醇式己糖 酸内酯化合物及其衍生物具有强还原性，能够起到很好的抗氧化作用，从而保护多肽及蛋 白质不被氧化，不会因为氧化而变性失活。现在常用的保护剂基本上为甘油、低聚糖、抗生 素、牛血清白蛋白等非特异性保护剂，这些保护剂虽然有一定的保护多肽及蛋白质活性效 果但是针对性不强。本专利内容专门针对多肽和蛋白质中色氨酸、半胱氨酸、组氨酸、酪氨 酸、蛋氨酸残基设计，使这些氨基酸在制备和保存过程中不被氧化，针对性强、保护效果好， 从而大大提高多肽及蛋白质的稳定性。这也是本专利内容研究的出发点和创新之处。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是:本发明的一种多肽及蛋白质高效活性保护剂针对多肽及蛋白质 中色氨酸、半胱氨酸、组氨酸、酪氨酸、蛋氨酸残基设计，通过加入保护剂使这些氨基酸不被 氧化从而大大提高多肽及蛋白质的稳定性。因为是针对多肽及蛋白质中氨基酸结构及易降 解因素设计，所以可以有针对性地保护多肽及蛋白质结构，明显提高多肽及蛋白质的稳定 性，从而延长多肽及蛋白质的保质期，使多肽及蛋白质生产单位、科研院所、免疫试剂盒生 产厂家等需要进行多肽及蛋白质保存的单位受益，减少报废率，降低成本。而且无毒不污染 环境，为多肽和蛋白质及相关产品的生产及运输、保存、应用打下良好的基础。
[0004] 本发明的技术方案是:以一种易降解蛋白为例，通过加入本专利所述保护剂对蛋 白质进行保护，然后进行2-8°C及37°C加速稳定性实验以证实保护剂的有效性。
[0005] 为了实现上述目的，本发明所采用如下技术方案： 一种多肽及蛋白质高效活性保护剂，其含有下述通式所示的稀醇式己糖酸内酯化合物 及其衍生物为有效成分：
式中，X为-H或者-C0-(CH2)y-Z，Y为自然数，Z为-H或-OH或甲基或苯环或内酯环 等其他任意可能的化学分子式结构；RJPR2可表示-H或者Na+、K+等金属离子或磷酸根离 子、硫酸根离子及其金属盐离子等。
[0006] 作为本发明保护剂的一种改进，该保护剂成分中所述通式所示的稀醇式己糖酸 内酯化合物及其衍生物可以是L-抗坏血酸、L-抗坏血酸钠、L-抗坏血酸钾、L-抗坏血 酸-2-磷酸酯、L-抗坏血酸棕榈酸酯、L-抗坏血酸-2-多聚磷酸酯、L-抗坏血酸3-三聚磷 酸酯钠盐、2-氧-a-D-吡喃型葡萄糖基-L-抗坏血酸、L-抗坏血酸-2-葡糖苷等任何在通 式基础上衍生出来的化合物。
[0007] 作为本发明保护剂的一种改进，该保护剂成分中所述通式所示的稀醇式己糖酸内 酯化合物及其衍生物可以单独使用做为蛋白保护剂，也可以与其他常用保护剂如低聚糖、 血清白蛋白、甘露醇、甘油、氨基酸、抗生素、螯合剂等联合使用。
[0008] 作为本发明保护剂的一种改进，该保护剂成分中所述通式所示的稀醇式己糖酸内 酯化合物及其衍生物使用浓度可以根据实验需要进行调整，一般在〇. 1-2%之间。
[0009] 作为本发明保护剂的一种改进，该保护剂成分中所述的蛋白为任何含有易氧化氨 基酸的蛋白。
【具体实施方式】
[0010] 下面结合实施实例对本发明及其有益效果作进一步详细的描述，但本发明的实施 方式并不限于此。
[0011] 本实施实例以Cry类蛋白为例，Cry类蛋白是苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis简称Bt)产生的一种内毒素，对鳞翅目、双翅目、同翅目等多种昆虫，以 及线虫、蜡类和原生动物等具有特异性的杀虫活性，同时又对人、畜等非靶标生物无毒害作 用。是目前研究和应用最广泛的杀虫蛋白之一。截止到2015年2月已经发现并被国际Bt命 名委员会命名的Cry蛋白共有758个，其中12个Cry蛋白（CrylAa，CrylAb，CrylAc，CrylC， CrylD，CrylE，CrylF，Cry2Aa，Cry2Ab，Cry3A，Cry3B和Cry34/Cry35)已经被用于商业作物 害虫防治的喷雾。目前我国主要的转ciT基因的作物有黄豆、玉米、棉花和油菜。已经商业 化的转基因棉花和转基因玉米能够稳定的表达CrylAc蛋白，有效的防治鳞翅目害虫。第二 代转基因棉花，能同时表达CrylAc和Cry2Ab蛋白，有效的减弱了害虫的抗药性。第二代商 业化的转基因玉米能够表达一系列Cry蛋白（Cry34Ab/Cry35Ab和Cry3Bb)，可以有效的控 制鞘翅目害虫；还有表达Cry1A、Cry2Ab和Cry1F蛋白的转基因玉米等都已经被广泛的投入 生产。Cry类蛋白的研究和应用虽然很广泛，然而其稳定性差、易降解是制约其蛋白实验研 究和应用的一个主要问题。如Cry类蛋白研究用原料及检测试剂盒中抗原标准品降解速度 快，保存时间短，不利于产业化。相关研究表明当Cry类蛋白结构中的发色体(主要为色氨 酸）会和分子氧相互作用，产生单线态氧攻击色氨酸的吲哚杂环，从而造成蛋白结构的损害 降低其生物活性。不利于此类蛋白的保存、研究和应用，所以本发明实例以此蛋白为保护对 象进行研究以验证保护剂的有效性。
[0012] 实施例1 本实施例提供的保护剂，包括以下组分：L-抗坏血酸棕榈酸酯1%、庆大霉素l%、50mM Tris-HCl(pH7. 4)。其中L-抗坏血酸棕榈酸酯结构式见图1，由通式中札和1?2为-H、X 为-C0-(CH2)14-CH3,Y为 14,Z为甲基构成。
[0013] 高浓度保护剂配制：根据需要设定所需配制保护剂倍数，比如2倍、5倍或者10倍 等。以5倍保护剂配方为例，先配制250mMTris-HCl(pH7. 4)，然后按质量计算其他保护剂 成分用量(用量变为配方中5倍)，用精密天平准确称取各组分用250mMTris-HCl(pH7. 4) 充分溶解后定容至所需体积。
[0014] 类蛋白保护：本实施实例中采用CrylAc蛋白进行实验，蛋白原浓度lmg/mL，加入 保护剂后变为〇. 80mg/mL。将被保护CrylAc蛋白溶液与5倍保护液按1 :4体积比混合、分 装、密闭、分别置于2-8°C和37°C进行对照实验。同时做一组未加L-抗坏血酸棕榈酸酯保 护剂，只加入50mMTris-HCl(pH7. 4)、庆大霉素1%稀释蛋白至0. 80mg/mL做对比实验，以 验证保护剂的保护效果。
[0015] 保护效果检测： 采用酶联免疫检测试剂盒检测被保护抗原免疫活性。包被CrylAc单克隆抗体1，包被 浓度6yg/mL，2-8°C过夜，洗涤后2%BSA封闭1小时、洗涤后干燥备用。标记CrylAc单克隆 抗体2，使用前稀释300倍。检测时以2. 5、5、10、20、40ppb浓度做标准曲线计算待测样品浓 度。免疫活性浓度损失超过20%即判为不合格。
[0016] 检测结果：
实施例2 本实施例提供的保护剂，包括以下组分：L-抗坏血酸钾1%、万古霉素1%、20mM PBS(pH7. 4)。其中L-抗坏血酸钾结构式见图2,由通式中札为Na、1?2为-H、X为-H。
[0017] 高浓度保护剂配制：根据需要设定所需配制保护剂倍数，比如2倍、5倍或者10倍 等。以5倍保护剂配方为例，先配制100mMPBS(pH7.4)，然后按质量计算其他保护剂成分用 量(用量变为配方中5倍)，用精密天平准确称取各组分用100mMPBS(pH7.4)充分溶解后定 容至所需体积。同时做一组未加保护剂，只加入20mMPBS(pH7. 4)、万古霉素1%稀释蛋白 至0. 80mg/mL做对比实验，以验证保护剂的保护效果。
[0018]Cry类蛋白保护：操作同实施例1。
[0019] 保护效果检测：操作同实施例1。
[0020] 检测结果：
根据上述说明书的描述和指导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进 行变更和修改。因此，本发明并不局限于上面描述和指导的【具体实施方式】，对本发明的一些 修改和变更也应当属于本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一 些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。
【主权项】
1. 一种多肽及蛋白质高效活性保护剂，其含有下述通式所示的稀醇式己糖酸内酯化合 物及 其衍生物为有效成分：式中，X为-H或者-C0-(CH2)Y-Z，Y为自然数，Z为-H或-OH或甲基或苯环或内酯环 等其他任意可能的化学分子式结构；RJPR2可表示-H或者Na+、K+等金属离子或磷酸根离 子、硫酸根离子及其金属盐离子等。2. 如权利要求1所述的一种多肽及蛋白质高效活性保护剂，其中，所述通式所示的稀 醇式己糖酸内酯化合物及其衍生物可以是L-抗坏血酸、L-抗坏血酸钠、L-抗坏血酸钾、 L-抗坏血酸-2-磷酸酯、L-抗坏血酸棕榈酸酯、L-抗坏血酸-2-多聚磷酸酯、L-抗坏血酸 3-三聚磷酸酯钠盐、2-氧a-D-吡喃型葡萄糖基-L-抗坏血酸、L-抗坏血酸2-葡糖苷等 任何在通式基础上衍生出来的化合物。3. 如权利要求1所述的一种多肽及蛋白质高效活性保护剂，其中，所述通式所示的稀 醇式己糖酸内酯化合物及其衍生物可以单独使用做为蛋白保护剂，也可以与其他常用保护 剂如低聚糖、血清白蛋白、甘露醇、甘油、氨基酸、抗生素、螯合剂等联合使用。4. 如权利要求1所述的一种多肽及蛋白质高效活性保护剂，其中，所述通式所示的稀 醇式己糖酸内酯化合物及其衍生物使用浓度可以根据实验需要进行调整，一般在0. 1-2% 之间。5. 如权利要求1所述的一种多肽及蛋白质高效活性保护剂，其中所述的多肽及蛋白质 为任何含有易氧化氨基酸的多肽及蛋白质。
【专利摘要】本发明属于生物产品技术领域，涉及一种多肽及蛋白质高效活性保护剂，其含有下述通式所示的稀醇式己糖酸内酯化合物及其衍生物为有效成分。式中，X为-H或者-CO-(CH2)Y-Z，Y为自然数，Z为-H或–OH或甲基或苯环或内酯环等其他任意可能的化学分子式结构；R1和R2可表示-H或者Na+、K+等金属离子或磷酸根离子、硫酸根离子及其金属盐离子等。本发明的蛋白高效活性保护剂针对多肽及蛋白氨基酸结构中半胱氨酸、组氨酸、色氨酸、蛋氨酸和酪氨酸残基等易被氧化的氨基酸设计，可以有针对性地保护此类多肽及蛋白质结构，能够大大延长它们的保质期，使多肽及蛋白质生产单位、科研院所、免疫试剂盒生产厂家等受益。
【IPC分类】C07K1/00, C07K14/325
【公开号】CN105037485
【申请号】CN201510070837
【发明人】张文超, 杜传英, 冯学
【申请人】黑龙江博腾生物科技有限公司
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年2月11日