变体激活素受体多肽及其用图

变体激活素受体多肽及其用图
【专利摘要】本发明提供了能够结合且抑制激活素A、肌抑素或GDF?11的活性的变体激活素IIB可溶性受体多肽和蛋白质。本发明还提供了能够产生变体多肽和蛋白质的多核苷酸、载体和宿主细胞。还提供了用于治疗肌肉消耗以及其他疾病和病症的组合物和方法。
【专利说明】变体激活素受体多化及其用途
[0001 ] 本申请是申请日为2008年03月06日的200880007116.0号发明专利申请(发明名 称:变体激活素受体多肤及其用途)的分案申请。
[0002] 与相关申请的交叉参照
[0003] 本申请要求于2008年2月11日提交的美国临时申请序列号61/065,474,和于2007 年3月6日提交的美国临时申请序列号60/905，459的利益，所述专利申请的公开内容被依赖 且引入本文作为参考。
[0004] 本发明的技术领域
[0005] 本发明的技术领域设及转化生长因子-e(TGF-e)家族成员和可溶性TGF-0受体，W 及调节TGF-0家族成员的活性、用于治疗各种病症的方法。
[0006] 发明背景
[0007] 蛋白质的转化生长因子e(TGF-e)家族包括转化生长因子-e(TGF-e)、激活素、骨形 态发生蛋白（BMP)、神经生长因子(NGFs)、脑源性神经营养因子(m)NF)、和生长/分化因子 (GDFs)。运些家族成员设及广泛范围的生物过程，包括细胞增殖、分化和其他功能的调节。 [000引生长/分化因子S(GDF-S)也称为肌抑素(myos化tin),是大多数情况下在发育中的 和成人骨骼肌组织的细胞中表达的TGF-0家族成员。肌抑素看起来在负控制骨骼肌生长中 发挥关键作用(McPherron等人，化ture (Xondon) 387，83-90 (1997))。括抗肌抑素已显示增 加动物中的无脂肪肌肉量(McFerron等人，同上，Zimmers等人，Science 296:1486(2002))
[0009] 蛋白质的TGF-e家族的另一个成员是相关生长/分化因子GDF-11dGDF-11具有肌抑 素氨基酸序列约90%的同一性。GDF-Il在发育中的动物的轴向模式中具有作用（Oh等人， Genes Dev 11:1812-26(1997))，并且看起来也在骨骼肌发育和生长中发挥作用。
[0010] 激活素 A、B和AB分别是具有两条多肤链M和郎的同二聚体和异二聚体(Vale等人 化ture 321,776-779(1986) ,Ling等人，化ture 321,779-782(1986))。激活素最初作为设 及滤泡刺激激素合成调节的性腺肤而发现，并且目前被认为设及许多生物活性的调节。激 活素 A是占优势形式的激活素。
[0011] 激活素、肌抑素、GDF-Il和TGF-0超家族的其他成员结合激活素 II型和激活素 IIB 型受体且通过所述受体的组合发信号，所述2种受体都是跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶 化arrison等人，J. Biol. Chem. 279,28036-28044(2004))。交联研究已测定肌抑素能够在体 外结合激活素 II型受体ActRIIA和ActRIIB(Lee等人，PNAS USA 98:9306-11(2001))。还存 在GDF-Il与ActRIIA和ActRIIB结合的证据(Oh等人，Genes Dev 16:2749-54(2002))。
[0012] 已知TGF-0蛋白质表达与各种疾病和病症相关。因此，能够括抗几种TGF-0蛋白质 的治疗分子同时可能是对于运些疾病和病症特别有效的。
[0013] 此外，蛋白质治疗的产生可能合并在蛋白质表达和纯化过程中发生的问题。一个 问题是在表达或纯化过程中蛋白质的聚集。在细胞培养条件过程中高水平蛋白质的积累可 能导致聚集。纯化过程可能使蛋白质暴露于促进进一步聚集的另外因素(Cromwell, M.E.M. 等人，The AAPS Journal 8:E572-E579,2006)。可W尝试减轻引起聚集的因素，然而，存在 蛋白质设计为具有减少形成聚集物的倾向的需要。本发明满足了对治疗分子的需要，所述 治疗分子与多种配体结合，并且具有减少的聚集且因此具有改善的可制造性，W便有效产 生对于治疗TGF-0相关疾病状态有用的蛋白质。
[0014] 发明概述
[0015] 本发明提供了包含变体人激活素受体IIB(命名为vActRIIB)多肤的分离蛋白质。 如本文所使用的，术语vActRIIB多肤指人vActRIIB多肤和人vActRIIB5多肤两者。在一个实 施方案中，蛋白质包含具有SEQ ID N0:2或18的氨基酸序列的多肤，其中在位置E28或R40或 者位置E28和R40两者处的氨基酸由另一非天然氨基酸取代，并且其中所述多肤能够结合肌 抑素、激活素 A或GDF-11。在一个实施方案中，蛋白质包含具有SEQ ID N0:2或18的氨基酸序 列的多肤，其中在位置E28或R40或者位置E28和R40两者处的氨基酸由非天然氨基酸取代， 并且其中信号肤被去除，并且其中所述多肤能够结合肌抑素、激活素 A或GDF-11。在一个实 施方案中，蛋白质包含具有SEQ ID N0:2或18的氨基酸序列的多肤，其中在位置E28或R40或 者位置E28和R40两者处的氨基酸由另一氨基酸取代，其中信号肤被去除，并且其中成熟多 肤的N末端被截短，并且其中所述多肤能够结合肌抑素、激活素 A或GDF-11。在一个实施方案 中，N末端成熟截短的vActRIIB多肤缺乏成熟序列的N末端4个氨基酸或N末端6个氨基酸，其 中所述多肤能够结合肌抑素、激活素 A或GDF-11。在一个实施方案中，在位置E28处的取代选 自W、Y和A。在一个进一步的实施方案中，在位置E28处的取代选自氨基酸A、F、Q、V、I、L、M、K、 H、W和Y。在一个进一步的实施方案中，在位置E40处的取代选自氨基酸G、Q、M、H、K和N。在一 个进一步的实施方案中，在位置E28处的取代选自氨基酸A、F、Q、V、I、L、M、K、H、W和Y，并且在 位置E40处的取代选自氨基酸A、G、Q、M、H、K和N。在一个进一步的实施方案中，多肤进一步包 含异源蛋白质。在一个实施方案中，异源蛋白质是化结构域。在一个进一步的实施方案中， Fc结构域是人IgG Fc结构域。
[0016] 在一个实施方案中，蛋白质包含具有SEQ ID N0:4、6、8、10、12、14、16、20、22、24、 26、 28、30、32、：34、36、38、40、42、44、46、52、54、56、60、62、64、66、70、72、87、88、91、93、95和 97中所示氨基酸序列的多肤。
[0017] 在另一个实施方案中，蛋白质包含由具有SEQ ID N0:3、5、7、9、ll、13、15、19、21、 23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、51、53、55、59、61、63、65、67、69、71、92、94、96中 所示序列或其互补序列的多核巧酸编码的多肤。
[0018] 在另一个方面，本发明提供了包含编码vActRIIB多肤的多核巧酸的分离核酸分 子。在一个实施方案中，核酸分子包含具有沈Q ID N0:3、5、7、9、ll、13、15、19、21、23、25、 27、 29、31、33、35、37、39、41、43、45、51、53、55、59、61、63、65、69、71、92、94、96中所示核酸序 列或其互补序列的多核巧酸。
[0019] 在另一个实施方案中，核酸分子包含编码多肤的多核巧酸，所述多肤由SEQ ID N0:4、6、8、10、12、14、16、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、52、54、56、60、 62、64、66、68、70、72、87、88、91、93、95和97中所示氨基酸序列组成。在一个进一步的实施方 案中，核酸分子进一步包含转录或翻译调节序列。在另一个方面，提供了包含vActRIIB核酸 分子的重组载体。在另一个方面，提供了包含重组载体的宿主细胞，并且提供了生产 vActRIIB多肤的方法。
[0020] 本发明进一步提供了包含本发明的至少一种vActRIIB多肤或蛋白质的组合物。在 一个实施方案中，组合物是包含与药学上可接受的载体混合的vActRIIB多肤或蛋白质的药 物组合物。
[0021] 在另一个方面，本发明提供了通过给受试者施用包含vActRIIB多肤或蛋白质的治 疗组合物，治疗或预防患有肌肉消耗疾病的受试者中的此种病症的方法。肌肉消耗疾病包 括或起因于，但不限于下述状况:癌症恶病质、肌营养不良、肌萎缩性侧索硬化、充血性阻塞 性肺疾病、慢性屯、力衰竭、化学性恶病质、来自HIV/AIDS的恶病质、肾衰竭、尿毒症、类风湿 性关节炎、老年性骨骼肌减少症（age-reIated sarcopenia)、老年性脆性（age-related fragility)、器官萎缩、腕管综合征、雄激素剥夺、和由于长期邸床休息导致的不活动引起 的肌肉消耗、脊髓损伤、中风、骨折和衰老。肌肉消耗还可W起因于太空飞行引起的失重、膜 岛素抵抗、由于烧伤引起的肌肉消耗、雄激素剥夺、和其他病症。在另一个方面，本发明提供 了治疗与激活素 A表达相关的疾病的方法。在一个实施方案中，疾病是癌症。在另一个方面， 本发明提供了治疗代谢素乱的方法，其包括给需要此种治疗的受试者施用治疗组合物，其 中代谢素乱选自骨丢失、糖尿病、肥胖、葡萄糖耐受不良、高血糖症、雄激素剥夺、和代谢综 合征。在另一个方面，本发明提供了治疗组合物在制备用于治疗上述病症的药物中的用途。 在另一个方面，本发明提供了基因治疗方法，其包括给有需要的受试者施用编码本发明的 vActRIIB多肤或蛋白质的载体，其中载体能够在受试者中表达vActRIIB多肤或蛋白质。
[0022] 特别地，本发明设及W下各项：
[0023] 1.包含变体激活素 IIB受体多肤(vActRIIB)的分离的蛋白质，其中所述多肤包含 SEQ ID NO:2或SEQ ID NO: 18的多肤序列，但在位置28或位置40处有单氨基酸取代，并且其 中所述多肤能够结合肌抑素、激活素 A或GDF-11。
[0024] 2.包含变体激活素 IIB受体多肤(vActRIIB)的分离的蛋白质，其中所述多肤包含 SEQ ID NO: 2或18的多肤序列，但在位置28和位置40处有单氨基酸取代，并且其中所述多肤 能够结合肌抑素、激活素 A或GDF-11。
[00巧]3.第1项的蛋白质，其中所述vActRIIB多肤在位置28处的取代选自A、F、Q、V、I、L、 1、1(、山￥和￥取代6。
[00%] 4.第2项的蛋白质，其中所述vActRIIB多肤在位置28处的取代选自A、F、Q、V、I、L、 1、1(、山￥和￥取代6。
[0027] 5.第1项的蛋白质，其中所述vActRIIB多肤在位置28处的取代选自氨基酸A、W和Y 取代E。
[0028] 6.第2项的蛋白质，其中所述vActRIIB多肤在位置28处的取代选自氨基酸A、W和Y 取代E。
[0029] 7.第1项的蛋白质，其中所述vActRIIB多肤在位置40处的取代选自氨基酸G、Q、M、 H、K和N取代R。
[0030] 8.第2项的蛋白质，其中所述vActRIIB多肤在位置40处的取代选自氨基酸A、G、Q、 M、H、K和N取代R。
[0031] 9.第2项的蛋白质，其中所述vActRIIB多肤在位置28处的取代选自氨基酸A、F、Q、 ￥、1、1^、1、1(、山￥和￥取代6，并且在位置40处的取代选自氨基酸4、6、9、1、山1(和闲^代尺。
[0032] 10.第1项的蛋白质，其中所述vActRIIB多肤在位置28处的取代是W取代E。
[0033] 11.第2项的蛋白质，其中所述vActRIIB多肤在位置28处的取代是A取代E，并且在 位置40处的取代是A取代R。
[0034] 12.第1-11项中任一项的蛋白质，其中所述vActRIIB多肤缺乏N末端信号序列。
[0035] 13.第1-11项中任一项的蛋白质，其中所述vActRIIB多肤缺乏N末端信号序列和成 熟的N末端4或6个氨基酸。
[0036] 14.第12项的蛋白质，其中所述vActRIIB多肤与至少一种异源多肤融合。
[0037] 15.第13项的蛋白质，其中所述vActRIIB多肤与至少一种异源多肤融合。
[0038] 16.第14项的蛋白质，其中所述异源多肤是人化结构域。
[0039] 17.第15项的蛋白质，其中所述异源多肤是人化结构域。
[0040] 18.第16项的蛋白质，其中所述多肤选自沈Q ID ^:60、62、64、68、70和72。
[0041 ] 19.第17项的蛋白质，其中所述多肤选自SEQ ID N0:91、93、95和97。
[0042] 20.包含vActRIIB多肤的分离的蛋白质，其中所述多肤选自具有序列SEQ ID NO: 4、6、8、10、12、14、16、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、52、54、56、60、62、 64、66、68、70、72、87、88、91、93、95和97的多肤。
[0043] 21.分离的核酸分子，其包含选自下述的多核巧酸：
[0044] (a)具有SEQ ID N0:3、5、7、9、ll、13、15、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、 41、43、45、51、53、55、59、61、63、65、67、69、71、92、94 和 96 中所示序列或其互补序列的多核 巧酸;和
[0045] (b)编码具有沈Q ID N0:4、6、8、10、12、14、16、20、22、24、26、28、30、32、：M、36、38、 40、42、44、46、52、54、56、60、62、64、66、68、70、72、87、88、91、93、95和97中所示氨基酸序列 的多肤的多核巧酸。
[0046] 22.第21项的核酸分子，其中所述多核巧酸与转录或翻译调节序列可操作地连接。
[0047] 23.第22项的核酸分子，其中所述转录或翻译序列包含转录启动子或增强子。
[004引24.重组载体，其指导第21项的核酸分子的表达。
[0049] 25.宿主细胞，其进行了基因工程化W表达第21项的核酸分子。
[0050] 26.第25项的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
[0051] 27.宿主细胞，其进行了基因工程化W产生第20项的蛋白质。
[0052] 28.生产vActRIIB多肤的方法，其包括在促进蛋白质表达的条件下培养第27项的 宿主细胞，和回收所述蛋白质。
[0053] 29.药物组合物，其包含与药学上可接受的载体混合的有效量的第20项的蛋白质。
[0054] 30.抑制受试者中的肌抑素活性的方法，所述受试者需要此种治疗，该方法包括给 所述受试者施用治疗有效量的第29项的组合物。
[0055] 31.增加受试者中的无脂肪肌肉量的方法，所述受试者需要此种治疗，该方法包括 给所述受试者施用治疗有效量的第29项的组合物。
[0056] 32.增加受试者中的无脂肪肌肉量与脂肪的比例的方法，所述受试者需要此种治 疗，该方法包括给所述受试者施用治疗有效量的第29项的组合物。
[0057] 33.治疗受试者中的肌肉消耗疾病或病症的方法，所述受试者需要此种治疗，该方 法包括给所述受试者施用治疗有效量的第29项的组合物。
[005引34.第33项的方法，其中所述肌肉消耗疾病是癌症恶病质。
[0059] 35.第33项的方法，其中所述肌肉消耗疾病或病症选自肌营养不良、肌萎缩性侧索 硬化、充血性阻塞性肺疾病、慢性屯、力衰竭、癌症恶病质、AIDS、肾衰竭、尿毒症、类风湿性关 节炎、老年性骨骼肌减少症、器官萎缩、腕管综合征、雄激素剥夺、烧伤、糖尿病、和由于长期 邸床休息导致的肌肉消耗、脊髓损伤、中风、骨折、衰老或暴露于微重力。
[0060] 36.治疗受试者中的代谢素乱的方法，所述受试者需要此种治疗，该方法包括给所 述受试者施用治疗有效量的第29项的组合物。
[0061] 37.第36项的方法，其中所述代谢素乱选自糖尿病、肥胖、高血糖症和骨丢失。
[0062] 38.第36项的方法，其中所述代谢素乱是骨丢失。
[0063] 39.治疗受试者中的一种疾病的方法，激活素在所述疾病中超量表达，并且所述受 试者需要此种治疗，该方法包括给所述受试者施用治疗有效量的第29项的组合物。
[0064] 40.第39项的方法，其中所述疾病是癌症。
[0065] 41.第40项的方法，其中所述疾病是睾丸或卵巢癌。
[0066] 42.治疗受试者中的恶病质的方法，所述受试者需要此种治疗，该方法包括给所述 受试者施用治疗有效量的第29项的组合物。
[0067] 43.第42项的方法，其中所述恶病质起因于癌症、糖尿病肾病、烧伤、肾衰竭和类风 湿性关节炎。
[0068] 44.减少受试者中的肿瘤团块大小的方法，所述受试者需要此种治疗，该方法包括 给所述受试者施用治疗有效量的第29项的组合物。
[0069] 45.第44项的方法，其中所述肿瘤团块起因于睾丸或卵巢癌。
[0070] 46.治疗受试者中的肌肉消耗病症的方法，所述受试者需要此种治疗，该方法包括 给所述受试者施用第24项的载体，其中所述载体能够指导VActRIIB多肤在所述受试者中的 表达。
[0071 ] 47.第46项的方法，其中所述载体是AAV载体。
[0072] 附图简述
[0073] 图1。图1显示野生型可溶性ActRIIB-人IgGl化的氨基酸序列（SEQ ID N0:98)。信 号肤序列是粗体的，随后为成熟的ActRIIB细胞外结构域，W及斜体的人IgGl化，包括部分 较链区。氨基酸E28和R40是有下划线的。接头序列GGGGS(SEQ ID N0:75)是斜体且有下划线 的。
[0074] 图2。图2显示可溶性ActRIIBS-人IgGlFc的氨基酸序列（SEQ ID NO:99)。信号肤序 列是粗体的，随后为成熟的ActRIIBS可溶性结构域，并且人IgG Wc，包括部分较链区是斜体 的。E28和R40是有下划线的。接头序列GGGGS(SEQ ID N0:75)是斜体且有下划线的。
[00巧]图3。图3显示可溶性vActRIIB-Fc E28W处理对抑制素-a敲除小鼠中的睾丸（图3A) 和卵巢(图3B)的影响。
[0076] 图4。图4显示可溶性vActRIIB-Fc E28W处理对雄性（图4A)和雌性（图4B)抑制素 -a 敲除小鼠中的存活率的影响。
[0077] 图5。图5显示可溶性vActRIIB-Fc E28W处理对携带结肠26肿瘤的小鼠中的体重的 影响。
[007引图6。图6显示可溶性vActRIIB-Fc E28W处理对携带结肠26肿瘤的小鼠中的存活的 影响。
[0079] 详述
[0080] 公开了包含变体人激活素 IIB受体(VActRIIB)多肤的蛋白质。运些蛋白质和多肤 的特征在于它们与巧中TGF-e蛋白质，即肌抑素(GDF-8)、激活素 A和GDF-Il中的至少一种结 合，且抑制运些蛋白质的活性的能力。与不包含本文公开的修饰的多肤比较，运些蛋白质和 多肤还显示出减少的聚集倾向。参照登记号NP_001097(SEQ ID N0:47)的野生型ActRIIB、 ^及4。11?118(沈9 10^:18)或4(311?1185(569 10顯:2)的细胞外结构域，修饰由在位置 28、40或28和40运两者处的氨基酸取代组成。
[0081] 如本文所使用的，术语"TGF-0家族成员"或叮GF-P蛋白质"指转化生长因子家族的 结构上相关的生长因子，包括激活素，W及生长和分化因子(GDF)蛋白质化ingsley等人 Genes Dev. 8:133-146( 1994) ,McPherron等人Growth factors and cytokines in health and disease,第IB卷，D丄eRoith和C.Bondy.编辑，JAI Press Inc. ,Greenwich,Conn,USA: 第357-393页）。
[0082] GDF-8也称为肌抑素，是骨骼肌组织的负调节物(McPherron等人PNAS USA 94: 12457-12461(1997))。肌抑素作为长度约375个氨基酸的无活性蛋白质复合物合成，对于人 具有GenBank登记号AAB86694(SEQ ID N0:49)。前体蛋白质通过在四碱基加工位点处的蛋 白酶解切割激活，W产生N末端无活性前结构域和约109个氨基酸的C末端蛋白质，其二聚化 W形成约25kDa的同二聚体。运种同二聚体是成熟的、生物活性蛋白质（Zimmers等人， Science 296,1486(2002))〇
[0083] 如本文所使用的，术语"前结构域"或"前肤"指无活性的N末端蛋白质，其进行切割 W释放活性C末端蛋白质。如本文所使用的，术语"肌抑素"或"成熟的肌抑素"指单体、二聚 体或其他形式的成熟的、生物活性C末端多肤，W及生物活性片段或相关多肤，包括等位基 因变体、剪接变体、W及融合肤和多肤。已报告成熟的肌抑素在许多物种，包括人、小鼠、鸡、 猪、火鸡和大鼠中具有100%序列同一性化ee等人，PNAS 98,9306(2001))。
[0084] 如本文所使用的，GDF-Il指具有Swissprot登记号095390(SEQ ID N0:50)的BMP (骨形态发生蛋白），W及那种蛋白质的变体和物种同源物。GDF-Il在氨基酸水平上与肌抑 素具有约90%同一性。GDF-Il设及中轴骨骼的前/后模式形成的调节(McPherron等人， NaUire Genet.22(93) :260-264(1999) ;Gamer等人，Dev.Biol.208(1 ),222-232(1999)),但 出生后功能未知。
[0085] 激活素 A是多肤链M的同二聚体。如本文所使用的，术语"激活素 A"指具有GenBank 登记号：NM_002192 (SEQ ID NO: 48)的激活素蛋白质，W及那种蛋白质的变体和物种同源 物。 隣]激活素受体
[0087]如本文所使用的，术语激活素 II B型受体(ActRIIB)指具有登记号NP_001097(SEQ ID N0:47)的人激活素受体。术语可溶性ActRIIB包含ActRIIB(SEQ ID N0:18)、ActRIIB5 (SEQ ID N0:2)的细胞外结构域，W及其中在位置64处的精氨酸由丙氨酸取代的运些序列。 [00则 变体可溶性ActRIIB多肤
[0089]本发明提供了包含人变体可溶性ActIIB受体多肤(本文称为vActRIIB多肤、或变 体多肤）的分离蛋白质。如本文所使用的，术语"vActRIIB蛋白质"指包含VActRIIB多肤的蛋 白质。如本文所使用的，术语"分离的"指由内源材料纯化至一定程度的蛋白质或多肤分子。 运些多肤和蛋白质的特征在于具有结合且抑制激活素 A、肌抑素或GDF-Il中的任何一种的 活性的能力。在某些实施方案中，与野生型多肤比较，激活素 A、肌抑素或GDF-Il的变体多肤 的结合亲和力得到改善。
[0090] 在一个实施方案中，VActRIIB多肤具有SEQ ID N0:2或18的氨基酸序列，其中在位 置E28或R40或者位置E28和R40两者处的氨基酸由另一非天然氨基酸取代，并且其中所述多 肤能够结合肌抑素、激活素 A或GDF-11。在另一个实施方案中，vActRIIB多肤是运些序列的 成熟形式、或截短的成熟形式。如本文所使用的，术语"成熟的VActRIIB多肤"指氨基酸信号 序列被去除的多肤。在一个实施方案中，成熟序列是例如SEQ ID N0:2的氨基酸19-160,和 SEQ ID NO: 18的氨基酸19-134,其中在位置28和40处的一个或全部两个氨基酸由另一非天 然氨基酸取代，并且多肤保留与激活素 A、肌抑素或GDF-Il结合的能力。如本文所使用的，术 语截短的成熟的VActRIIB多肤指具有信号序列并且来自成熟多肤的N末端的氨基酸被去除 的多肤。在一个实施方案中，成熟多肤的成熟的N末端4个氨基酸或N末端6个氨基酸被去除。 在运个实施方案中，截短的成熟序列是例如SEQ ID N0:2的氨基酸23-160,或SEQ ID N0:2 的氨基酸25-160;和沈Q ID NO: 18的氨基酸23-134,或沈Q ID NO: 18的氨基酸25-134,其中 在位置28和40处的一个或全部两个氨基酸由非野生型氨基酸取代，其保留与激活素 A、肌抑 素或GDF-Il结合的能力。如本文所使用的，术语"位置28"和"位置40"(即，E28和R40)指参照 包括18个氨基酸的信号序列的序列SEQ ID N0:2和18而言的氨基酸位置。为了一致性，如果 针对成熟的或截短的成熟序列，成熟的VActRIIB多肤具有在位置10和/或位置22处的取代， 或截短的成熟多肤具有在位置6和/或位置18处的取代，或在位置4和/或位置16处的取代， 那么运些变体仍将针对全长SEQ ID N0:2和18而言，或如图1或2中所示，即在位置E28和/或 R40处的氨基酸取代。此种成熟的实施方案或N末端截短的实施方案在下文例示。
[0091] 在一个实施方案中，在位置E28处的取代选自氨基酸W、Y和A。在一个实施方案中， 在位置28处的取代是W。在一个进一步的实施方案中，在位置28处的取代选自氨基酸A、F、Q、 V、I、L、M、K、H、W和Y。在一个进一步的实施方案中，在位置40处的取代选自氨基酸G、Q、M、H、K 和N。在一个进一步的实施方案中，在位置28处的取代选自氨基酸4少、9、￥、1、^1、1(、山胖和 Y，并且在位置40处的取代选自氨基酸A、G、Q、M、H、K和N。在一个实施方案中，蛋白质包含具 有选自沈Q ID N0:4、6、8、10、12、14、16、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、 52、54、56、60、62、64、66、68、70、72、87、88、91、93、95和97的氨基酸序列的多肤。在另一个实 施方案中，蛋白质包含由具有沈Q ID N0:3、5、7、9、ll、13、15、19、21、23、25、27、29、31、33、 35、37、39、41、43、45、51、53、55、59、61、63、65、67、69、71、92、94、96中所示序列或其互补序 列的多核巧酸编码的多肤。
[0092] 在一个实施方案中，信号序列从VActRIIB多肤中去除，留下成熟的变体多肤。各种 信号肤可W在本申请的多肤制备中使用。信号肤可W具有图1和2中所示的序列（SEQ ID N0:73)或可替代的信号序列，例如SEQ ID N0:74,即SEQ ID N0:2和18的信号序列。可W使 用对于表达vActRIIB或vActRIIB5多肤有用的任何其他信号肤。
[0093] 在另一个实施方案中，vActRIIB多肤具有与SEQ ID NO:2和18基本上相似的序列。 如本文所使用的，术语"基本上相似的"指与SEQ ID N0:2和18中所示的氨基酸序列具有至 少约80 %同一'性、至少约85 %同一'性、至少约90 %同一'性、至少约95 %同一'性、至少约98 % 同一性或至少约99%同一性的多肤，并且其中在位置28和/或40处的一个或全部两个氨基 酸由非野生型氨基酸取代，其中多肤保留SEQ ID N0:2和18的多肤的活性，即结合且抑制肌 抑素、激活素 A或GDF-Il的能力。此外，术语vActRIIB多肤包含SEQ ID NO: 2或18的片段，例 如包含本文描述的在位置28和/或40处的取代的N和C末端截短，其中所述多肤能够结合且 抑制肌抑素、激活素 A或GDF-11。
[0094] 如本文所使用的，术语vActRIIB和vActRIIB5多肤的"衍生物"指至少一种另外的 化学部分、或至少一种另外的多肤的连接，W形成共价或聚集缀合物例如糖基、脂质、乙酷 基、或者C末端或N末端融合多肤、与PEG分子的缀合、和下文更充分地描述的其他修饰。变体 ActRIIB受体多肤(vActRIIB)也可W包括另外的修饰和衍生物，包括对于C和N末端的修饰， 其来源于由于在各种细胞类型中表达的加工，所述细胞类型例如哺乳动物细胞、大肠杆菌、 酵母和其他重组宿主细胞。另外包括的是vActRIIB多肤片段W及包含SEQ ID N0:4、6、8、 10、12、14、16、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、52、54、56、60、62、64、66、 68、70、72、87、88、91、93、95和97中所示多肤序列的灭活的师唐基化位点、灭活的蛋白酶加工 位点、或保守氨基酸取代的多肤。
[00巧]如本文所使用的，术语"vActRIIB或vActRIIB5多肤活性"或"可溶性ActRIIB或 ActRIIBS多肤的生物活性"指vActRIIB和vActRIIB5多肤的一种或多种体外或体内活性，其 包括但不限于下文实施例中证实的那些。VActRIIB多肤的活性包括但不限于与肌抑素或激 活素 A或GDF-Il结合的能力，W及减少或中和肌抑素或激活素 A或GDF-Il的活性的能力。如 本文所使用的，术语"能够与肌抑素、激活素 A或GDF-11结合"指通过本领域已知的方法，例 如下文实施例2中描述的Biacore法测量的结合。此外，在实施例2中，基于pMARE C2C12细胞 的测定方法测量激活素 A中和活性、肌抑素中和活性、和GDF-Il中和活性。体外活性包括但 不限于增加体重、增加无脂肪肌肉量（lean muscle mass)、增加骨骼肌肉量、减少脂肪量， 如下文动物模型中证实的和如本领域已知的。生物活性进一步包括减少或预防由某些类型 的癌症引起的恶病质、防止某些类型的肿瘤生长、且增加某些动物模型的存活。VActRIIB多 肤活性的进一步讨论在下文提供。
[0096] 本发明的多肤进一步包含直接或通过接头序列与VActRIIB多肤连接，W形成融合 蛋白的异源多肤。如本文所使用的，术语"融合蛋白"指具有经由重组DNA技术连接的异源多 肤的蛋白质。异源多肤包括但不限于化多肤、his标记、和亮氨酸拉链结构域，W促进变体 ActRIIB多肤的寡聚化和稳定化，如例如引入本文作为参考的WO 00/29581中描述的。在一 个实施方案中，异源多肤是Fc多肤或结构域。在一个实施方案中，Fc结构域选自人IgGU IgG2和IgG4化结构域。运些在沈Q ID NO:80、82和84中提供。vActRIIB可W进一步包含与其 各自的IgG化区域邻近的IgGl、IgG2或IgG4的较链序列的全部或部分。IgGl、IgG2和IgG4的 完整较链序列分别在SEQ ID NO:76、77和78中提供。
[0097] VActRIIB多肤可W任选进一步包含"接头"序列。接头主要充当多肤和第二种异源 多肤或其他类型的融合物之间或者两个或更多变体ActRIIB多肤之间的间隔物。在一个实 施方案中，接头由通过肤键连接在一起的氨基酸组成，优选通过肤键连接的1-20个氨基酸， 其中氨基酸选自20种天然存在的氨基酸。运些氨基酸中的一个或多个可W是糖基化的，如 本领域技术人员了解的。在一个实施方案中，1-20个氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天 冬酷胺、谷氨酷胺和赖氨酸。优选地，接头由非空间位阻的大部分氨基酸例如甘氨酸和丙氨 酸组成。示例性接头是聚甘氨酸(特别是(Gly)5、(Gly)8、聚(Gly-Ala)和聚丙氨酸。如下文实 施例中所示的一种示例性合适的接头是(Gly)4Se;r(SEQ ID N0:75)。在一个进一步的实施 方案中，vActRIIB可W包含较链接头，运是提供与较链区邻近的接头序列，如SEQ ID N0:79 中例示的。
[009引接头也是非肤接头。例如，可W使用烷基接头例如-NH-(C出）S-C(O)-,其中S = 2- 20。运些烷基接头可W进一步由任何非空间位阻基团取代，所述基团例如低级烷基（例如 Cパ6)、低级酷基、面素(例如C1、化）、CN、N出、苯基等。
[0099] 在一个实施方案中，vActRIIB多肤可W直接或经由接头或经由较链接头与化多肤 连接。在一个实施方案中，化是人IgG Fc。与化连接的vActRIIB包括例如vActRIIB-IgGlFc、 E28A(SEQ ID N0:60);vActRIIB-IgGlFc、E28W(SEQ ID N0:62)、vActRIIB-IgGlFc、E28Y (沈Q ID N0:64)、vActRIIB-IgG 化、R40G(SEQ ID N0:66)、vActRIIB5-IgGlFc、E28A(SEQ ID N0:70)和vActRIIB5-IgGl化 E28W(SEQ ID N0:72)，如表1和2中所示，W及在本文实施 例中描述。进一步的实施方案包括vActRIIB-IgG2Fc、E28W(SEQ ID N0:91)、vActRIIB- IgG2Fc、E28Y(沈Q ID N0:93)和vActRIIB-IgG2Fc(沈Q ID N0:95)。如下文实施例中证实 的，与野生型ActRIIB-IgG2IgG化k较，变体已证实产生更少的聚集。
[0100] 本文公开的VActRIIB多肤还可W与非多肤分子连接用于赋予所需性质的目的，所 述性质例如减少降解和/或增加半衰期、减少毒性、减少免疫原性、和/或增加 ActRIIB多肤 的生物活性。示例性分子包括但不限于线性聚合物例如聚乙二醇(PEG)、聚赖氨酸、葡聚糖； 脂质;胆固醇基团（例如类固醇）；碳水化合物、或寡糖分子。
[0101] 在另一个方面，本发明提供了包含编码本发明的VActRIIB多肤的多核巧酸的分离 核酸分子。如本文所使用的，术语"分离的"指由内源材料纯化至一定程度的核酸分子。在一 个实施方案中，本发明的核酸分子包含编码SEQ ID N0:4、6、8、10、12、14、16、20、22、24、26、 28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、52、54、56、60、62、64、66、68、70、72、87、88、91、93、95和 97的多肤的多核巧酸。由于已知的遗传密码简并性(其中超过一个密码子可W编码相同氨 基酸），DNA序列可W与沈Q ID N0:3、5、7、9、ll、13、15、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、 39、41、43、45、51、53、55、59、61、63、65、67、69、71、92、94和96中所示的那种，或沈Q ID NO: 3、5、7、9、11、13、15、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、51、53、55、59、61、63、 65、 67、69、71、92、94和96的互补链不同，并且仍编码具有沈9 10側:4、6、8、10、12、14、16、 20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、52、54、56、60、62、64、66、68、70、72、87、 88、91、93、95和97的氨基酸序列的多肤。此种变体DNA序列可W起因于在生产过程中发生的 沉默突变，或可W是运些序列的有意诱变的产物。
[0102] 在另一个实施方案中，本发明的核酸分子包含具有SEQ ID N0:3、5、7、9、ll、13、 15、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、51、53、55、59、61、63、65、67、69、71、 92、94和96中所示的多核巧酸序列，或沈Q ID N0:3、5、7、9、ll、13、15、19、21、23、25、27、29、 31、33、35、37、39、41、43、45、51、53、55、59、61、63、65、67、69、71、92、94 和 96 的互补链的多核 巧酸。在另一个实施方案中，本发明提供了运样的核酸分子，其在严格或中等条件下与SEQ ID N0:3、5、7、9、ll、13、15、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、51、53、55、59、 61、63、65、67、69、71、92、94和96的多肤编码区杂交，其中所编码的多肤包含沈Q ID N0:4、 6、8、10、12、14、16、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、52、54、56、60、62、64、 66、 68、70、72、87、88、91、93、95和97中所示的氨基酸序列，并且其中所编码的多肤保持 vActRIIB多肤的活性。
[0103] 本发明的核酸分子包含单链和双链形式的DNA，及其RNA互补序列。DNA包括例如 cDNA、基因组DNA、合成DNA、由PCR扩增的DNA、及其组合。基因组DNA可W通过常规技术进行 分离，例如通过使用SEQ ID NO: 1或17的DNA或其合适的片段作为探针。编码ActRIIB多肤的 基因组DNA得自对于许多物种可用的基因组文库。合成DNA可W运样获得:重叠寡核巧酸片 段的化学合成，随后为片段的组装，W重构编码区和侧翼序列的部分或全部。RNA可W得自 指导mRNA的高水平合成的原核生物表达载体，例如使用T7启动子和RNA聚合酶的载体。CDNA 得自由mRNA制备的文库，所述mRNA从表达ActRIIB的各种组织中分离。本发明的DNA分子包 括全长基因 W及其多核巧酸和片段。全长基因也可W包括编码N末端信号序列的序列。
[0104] 在本发明的另一个方面，还提供了包含核酸序列的表达载体，并且还提供了用此 种载体转化的宿主细胞和产生VActRIIB多肤的方法。术语"表达载体"指用于由多核巧酸序 列表达多肤的质粒、隧菌体、病毒或载体。用于表达VActRIIB多肤的载体最少包含对于载体 繁殖和克隆的插入片段表达所需的序列。表达载体包含转录单位，所述转录单位包含（1)在 基因表达中具有调节作用的遗传元件，例如启动子或增强子，（2)编码待转录成mRNA且翻译 成蛋白质的VActRIIB多肤的序列，和(3)合适的转录起始和终止序列的组装。运些序列可W 进一步包括选择标记。适合于在宿主细胞中表达的载体可容易获得，并且核酸分子使用标 准重组DNA技术插入载体内。此种载体可W包括在特定组织中起作用的启动子，和用于在被 革己定的人或动物细胞中表达vActRIIB的病毒载体。适合于表达vActRIIB的示例性表达载体 是包含vActRIIB多核巧酸的pDSRa(在引入本文作为参考的WO 90/14363中描述)及其衍生 物，W及本领域已知的或下文描述的任何另外合适的载体。
[0105] 本申请进一步提供了制备vActRIIB多肤的方法。可W利用各种其他表达/宿主系 统。运些系统包括但不限于微生物例如用重组隧菌体转化的细菌、质粒或粘粒DNA表达载 体;用酵母表达载体转化的酵母;用病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统； 用病毒表达载体(例如，花挪菜花叶病毒，CaMV;烟草花叶病毒，TMV)转染的或用细菌表达载 体(例如，Ti或PBR322质粒)转化的植物细胞系统;或动物细胞系统。在重组蛋白质产生中有 用的哺乳动物细胞包括但不限于VERO细胞、化La细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、或其衍 生物例如在无血清培养基中生长的Veggie C册和相关细胞系（参见Rasmussen等人，1998， Cytotechnology 28:31)、或DHFR缺陷的CHO株DX-Bll (参见Urlaub等人，1980， Proc.化 tl. Acad. Sci. USA 77:4216-20)，COS 细胞例如猴肾细胞的 C0S-7 系（ATCC (XL 1651)(参见Gluzman等人，1981，Cel 1 23:175)，W138，B皿，胎pG2,3T3(ATCC (XL 163)， RIN，MDCK，A549，PC12，K562，L细胞，C127细胞，BHK(ATCC邸L10)细胞系，衍生自非洲绿猴 肾细胞系CVl的CVl/EBNA细胞系（ATCC (XL 70)(参见McMahan等人，1991，EMB0 J.IO: 2821)，人胚肾细胞例如293、293邸NA或MSR 293,人表皮A431细胞，人C〇1〇205细胞，其他转 化的灵长类动物细胞系，正常二倍体细胞，衍生自原代组织的体外培养的细胞株，原代外植 体，化-60，U937，化K或化rkat细胞。哺乳动物表达允许产生可W从生长培养基中回收的分 泌的或可溶性多肤。
[0106] 使用合适的宿主-载体系统，vActRIIB多肤通过在允许产生的条件下培养宿主细 胞来重组产生，所述宿主细胞用包含本发明的核酸分子的表达载体转化。转化细胞可W用 于长期、高产率多肤生产。一种此种细胞用包含选择标记W及所需表达盒的载体转化，可W 允许该细胞在其转换到选择培养基前在富集培养基中生长1-2天。选择标记设计为允许成 功表达引入序列的细胞的生长和回收。稳定转化细胞的抗性簇可W使用适合于所采用的细 胞系的组织培养技术进行增殖。重组蛋白质表达的概述在Methods of Enzymology，第185 卷，Goeddell，D.V.，编辑，Academic Press(1990)中发现。
[0107] 在某些情况下，例如在使用原核系统的表达中，本发明的表达多肤可能需要"重折 叠"且氧化成合适的=级结构并且产生二硫键，W便成为生物活性的。重折叠可W使用本领 域众所周知的许多操作来实现。此种方法包括例如在离液剂的存在下使溶解的多肤暴露于 通常超过7的抑。离液剂的选择类似于用于包含体溶解的选择，然而，离液剂一般W较低浓 度使用。示例性离液剂是脈和尿素。在大多数情况下，重折叠/氧化溶液也将包含特定比例 的还原剂加其氧化形式，W产生允许二硫化物改组发生的特定氧化还原电位，用于形成半 脫氨酸桥。某些常用的氧化还原偶包括半脫氨酸/脫胺、谷脫甘肤/二硫代双GSH、氯化铜、二 硫苏糖醇DTT/二嚷烧DTT、和2-琉基乙醇(bME)/二硫代-bME。在许多情况下，共溶剂可W用 于增加重折叠的效率。常用的共溶剂包括甘油、各种分子量的聚乙二醇和精氨酸。
[0108] 此外，可W根据常规技术在溶液中或在固体支持物上合成多肤。各种自动合成仪 是商购可得的，并且可W根据已知方案进行使用。参见例如，Stewad和化ung，Solid Phase Peptide Synthesis,第2版，Pierce Qiemical Co. (1984) ;Tam等人，J Am Qiem Soc，105: 6442,(1983)；Merrifield,Science 232:341-347(1986);Barany和Merrifield，The Peptides，Gross和Meienhof er，编辑，AcademiC Press ,New York, 1-284 ;Barany等人，Int J Pep Protein Res,30:705-739(1987)。
[0109] 本发明的多肤和蛋白质可W根据本领域技术人员众所周知的蛋白质纯化技术进 行纯化。运些技术在一个水平上设及蛋白质和非蛋白质级分的粗分级分离。使肤多肤与其 他蛋白质分开后，目的肤或多肤可W使用层析和电泳技术进行进一步纯化，W达到部分或 完全纯化(或纯化至同质性）。如本文所使用的，术语"分离的多肤"或"纯化的多肤"意指可 与其他组分分离的组合物，其中多肤纯化至相对于其可天然获得状态的任何程度。纯化多 肤因此也指离开它可能天然存在的环境的多肤。一般地，"纯化的"将指已实施分级分离W 去除各种其他组分的多肤组合物，并且所述组合物基本上保留其表达的生物活性。当使用 术语"基本上纯化的"时，运个命名将指运样的肤或多肤组合物，即，其中肤或多肤形成组合 物的主要组分，例如构成组合物中约50 %、约60%、约70%、约80 %、约85 %或约90%或更多 的蛋白质。
[0110] 适合于在纯化中使用的各种技术将是本领域技术人员众所周知的。运些包括例如 用硫酸锭、PEG、抗体(免疫沉淀)等或通过热变性沉淀，随后离屯、;层析例如亲和层析(蛋白 质A柱）、离子交换、凝胶过滤、反相、径基憐灰石、疏水相互作用层析；等电点聚焦;凝胶电 泳；W及运些技术的组合。如本领域一般已知的，认为执行各种纯化步骤的顺序可W改变， 或某些步骤可W省略，并且仍得到用于制备基本上纯化的多肤的合适方法。示例性纯化步 骤在下文实施例中提供。
[0111] 用于对多肤纯化程度进行定量的各种方法依照本公开内容将是本领域技术人员 已知的。运些包括例如测定活性级分的特异性结合活性、或通过SDS/PAGE分析评估级分内 的肤或多肤量。用于评估多肤级分的纯度的优选方法是计算级分的结合活性，使其与起始 提取物的结合活性比较，且因此计算纯化程度，在本文中通过"纯化倍数"评估。用于代表结 合活性量的实际单位当然将依赖在纯化后所选择的具体测定技术，W及多肤或肤是否显示 可检测的结合活性。
[0112] 变体激活素 IIB型多肤与激活肌肉降解级联的配体结合。能够结合且抑制配体激 活素 A、肌抑素和/或GDF-Il的活性的VActRIIB多肤具有针对设及肌肉萎缩的疾病，W及治 疗某些癌症和如下文实施例中所示的其他疾病的治疗潜力。
[0113] 然而，聚集可W在表达或纯化野生型ActRIIB或ActRIIBS多肤时发生。运种聚集包 括在表达过程中有结构的寡聚体形成，W及在表达过程中和多肤纯化后无结构的聚集物的 产生。
[0114] 结构分析、分子建模和质谱法的组合方法已表明，多聚化可W经由分子间二硫键 形成在ActRIIB多肤中出现，所述分子间二硫键形成由非糖基化的ActRIIB多肤之间的静电 和氨键合相互作用帮助。显著的氨键存在于两个ActRIIB分子的界面处；例如在一个 ActRIIB的E28侧链和另一个ActRIIB的R40侧链之间。此外，关键的静电相互作用存在于一 个ActRIIB的E28和另一个ActRIIB的R40之间。
[0115] 运些静电相互作用可W显著促成增加暂时的ActRIIB二聚体群体，导致促进在 ActRIIB单位之间的非共价和/或共价键形成。残基28和40之间的相互作用是运些相互作用 中最关键的，因为运两个残基参与双氨键和强静电相互作用。残基28和40参与ActRIIB: ActRIIB相互作用而不参与ActRIIB:配体相互作用。因此，残基28和40根据本发明可W由非 天然氨基酸取代，W改善溶解度、且减少受体多肤的聚集。因此，E28和R40可W分别由其他 可能的天然氨基酸取代、表达、且如下所述通过Biacore进行测试。Biacore测定的结合显示 于下文实施例2中的表1A和IB中。此外，VActRIIB多肤的聚集百分比在下文测定。
[0116] 下文实施例中的结果显示具有本文描述的氨基酸取代的VActRIIB多肤和蛋白质 的聚集减少，同时保留结合且中和肌抑素、激活素 A或GDF-Il的能力。
[0117] 抗体
[0118] 本发明进一步包括与变体ActRIIB多肤结合的抗体，包括与本发明的vActRIIB多 肤特异性结合的那些。如本文所使用的，术语"特异性结合"指对于VActRIIB多肤具有IO6M^i 或更大的结合亲和力化a)的抗体。如本文所使用的，术语"抗体"指完整抗体，包括多克隆抗 体（参见例如Antibodies :A LaboratoiT Manual ,Harlow和Lane(编辑），Cold Spring Harbor Press, (1988))，和单克隆抗体（参见例如美国专利号RE 32,011、4,902,614、4， 543,439和4,411,993，W及Monoclonal Antibodies:A New Dimension in Biological Analysis ,Plenum Press ,Kennett ,McKearn和Bechtol (编辑）（1980))。如本文所使用的，术 语"抗体"还指通过重组DNA技术或者通过酶促或化学切割完整抗体产生的抗体片段，例如F (ab)、F(ab'）、F(ab'）2、Fv、Fc和单链抗体。术语"抗体"还指双特异性或双功能抗体，其是具 有两个不同重/轻链对和两个不同结合位点的人工杂交抗体。双特异性抗体可W通过各种 方法产生，包括杂交瘤的融合或Fab'片段的连接（参见Songsivilai等人， Cl in . Exp . Immunol .79:315-321(1990 )，Kostelny等人，J. Immunol .148:1547-1553 (1992))。
[0119] 如本文所使用的，术语"抗体"还指嵌合抗体，即具有与一个或多个非人可变抗体 免疫球蛋白结构域偶联的人恒定抗体免疫球蛋白结构域的抗体，或其片段(参见例如，美国 专利号5,595,898和美国专利号5,693,493)。抗体还指"人源化"抗体(参见例如，美国专利 号4,816,567和WO 94/10332)、微抗体(min化OdiesKwo 94/09817)、大抗体(maxibodies)、 和由转基因动物产生的抗体，其中包含产生人抗体的基因的一部分但在内源抗体产生方面 缺陷的转基因动物能够产生人抗体（参见例如，Mendez等人，化ture Genet ics 15:146- 156(1997)和美国专利号6,300,129)。术语"抗体"还包括多聚抗体、或蛋白质的更高级别复 合物例如异二聚抗体和抗独特型抗体。"抗体"还包括抗独特型抗体。抗VActRIIB的抗体可 W例如用于在体外和体内鉴定且定量vActRIIB。
[0120] 还包括的是来自任何哺乳动物的多克隆抗体，例如小鼠和大鼠抗体、和兔抗体，其 与本文描述的vActRIIB多肤特异性结合，所述vActRIIB多肤包括SEQ ID N0:4、6、8、10、12、 14、16、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、52、54、56、60、62、64、66、68、70、 72、87、88、91、93、95和97。
[0121] 此种抗体可W用作研究工具并且可W在定量测定中用于检测且测定本文公开的 多肤。此种抗体使用上文描述的方法和如本领域已知的来制备。
[01。] 药物组合物
[0123] 还提供了包含本发明的vActRIIB蛋白质和多肤的药物组合物。此种组合物包含与 药学上可接受的材料和生理学上可接受的制剂材料混合的、治疗或预防有效量的多肤或蛋 白质。药物组合物可W包含用于修饰、维持或保留例如组合物的pH、重量摩尔渗透压浓度、 粘性、澄清度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速度、吸收或渗透的制剂材 料。合适的制剂材料包括但不限于，氨基酸(例如甘氨酸、谷氨酷胺、天冬酷胺、精氨酸或赖 氨酸）；抗微生物剂;抗氧化剂(例如抗坏血酸、亚硫酸钢或亚硫酸氨钢）；缓冲剂(例如棚酸 盐、碳酸氨盐、Tris-HCU巧樣酸盐、憐酸盐、其他有机酸）；膨胀剂(例如甘露醇或甘氨酸）， 馨合剂(例如乙二胺四乙酸化DTA));络合剂(例如咖啡因、聚乙締化咯烧酬、0-环糊精或径 丙基-e-环糊精）;填充剂;单糖;二糖和其他碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖或糊精）；蛋白 质（例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白）；着色剂；调味剂和稀释剂;乳化剂;亲水聚合物 (例如聚乙締化咯烧酬）；低分子量多肤;成盐抗衡离子(例如钢）；防腐剂(例如苯扎氯锭、苯 甲酸、水杨酸、硫柳隶、苯乙醇、对径基苯甲酸甲醋、对径基苯甲酸丙醋、氯己定、山梨酸或过 氧化氨）；溶剂(例如甘油、丙二醇或聚乙二醇）；糖醇(例如甘露醇或山梨糖醇）；悬浮剂;表 面活性剂或湿润剂(例如普流罗尼(Pluronics)、PEG、脱水山梨糖醇醋、聚氧乙締脱水山梨 糖醇脂肪酸醋例如聚氧乙締脱水山梨糖醇单月桂酸醋、聚氧乙締脱水山梨糖醇单油酸醋、 triton、氨基下S醇、卵憐脂、胆固醇、tyloxapal);稳定性增强剂(薦糖或山梨糖醇）；张度 增强剂(例如碱金属面化物(优选氯化钢或钟、甘露醇、山梨糖醇）；递送媒介物;稀释剂;赋 形剂和/或药物佐剂（Remington' S Pharmaceutical Sciences，第 18版，A.R.Gennaro,编 辑，Mack Publishing Company, 1990)。
[0124] 最佳药物组合物将通过本领域技术人员依赖例如预期施用途径、递送形式和所需 剂量进行确定。参见例如，Remington'S Pharmaceutical Sciences，同上。此种组合物可W 影响身体状态、稳定性、体内释放速度、和多肤的体内清除速度。例如，合适的组合物可W是 用于肠胃外施用的注射用水、生理盐水溶液。
[0125] 药物组合物中的主要媒介物或载体的性质可W是水性的或非水性的。例如，合适 的媒介物或载体可W是注射用水、生理盐水溶液或人工脑脊液，可能补充有在用于肠胃外 施用的组合物中常见的其他材料。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是进一步的示 例性媒介物。其他示例性药物组合物包含约pH 7.0-8.5的化iS缓冲液、或约pH4.0-5.5的乙 酸盐缓冲液，其可W进一步包括山梨糖醇或其合适的替代物。在本发明的一个实施方案中， 组合物可W通过使具有所需纯度的所选组合物与任选的配制试剂混合（Remington'S Pharmaceutical Sciences,同上），W冻干团块或水溶液的形式制备用于胆存。此外，治疗 组合物可W使用合适的赋形剂例如薦糖配制为冻干物。
[0126] 制剂可W W各种方法进行递送，例如通过吸入疗法、口服或通过注射。当考虑肠胃 外施用时，用于在本发明中使用的治疗组合物可W是包含药学上可接受的媒介物中的所需 多肤的无热原、肠胃外可接受的水溶液的形式。用于肠胃外注射的特别合适的媒介物是无 菌蒸馈水，其中多肤配制为无菌、等渗溶液，适当保存。另外一种制剂可W设及所需分子与 试剂的配制，所述试剂例如可注射微球体、生物可蚀解颗粒、聚合化合物（聚乳酸、聚乙醇 酸）、珠或脂质体，所述试剂提供用于产物的控制或持续释放，所述产物随后可W经由储存 注射进行递送。还可W使用透明质酸，并且运可W具有促进循环中的持续时间的效应。用于 引入所需分子的其他合适的方法包括可植入的药物递送装置。
[0127] 在另一个方面，适合于可注射施用的药物制剂可W在水溶液中进行配制，优选在 生理学上相容的缓冲液中，例如化nks液、林格氏溶液或生理学缓冲盐水。水性注射悬浮液 可W包含增加悬浮液的粘度的物质，例如簇甲基纤维素钢、山梨糖醇或右旋糖酢。此外，活 性化合物的悬浮液可W制备为合适的油性注射悬浮液。合适的亲脂溶剂或媒介物包括脂肪 油例如芝麻油，或合成脂肪酸醋例如油酸乙醋、甘油=醋或脂质体。非脂质聚阳离子氨基聚 合物也可W用于递送。任选地，悬浮液还可W包含合适的稳定剂或试剂，W增加化合物的溶 解度且允许制备高浓缩溶液。在另一个实施方案中，药物组合物可W配制用于吸入。吸入溶 液还可W用推进剂进行配制用于气溶胶递送。在另外一个实施方案中，溶液可W是雾化的。 肺施用在PCT申请号PCT/US94/001875中进一步描述，所述专利申请描述化学修饰的蛋白质 的肺递送。
[0128] 还考虑某些制剂可W 口服施用。在本发明的一个实施方案中，W运种方式施用的 分子可W连同或不连同固体剂型例如片剂和胶囊的配制中通常使用的那些载体进行配制。 例如，胶囊可W设计为在胃肠道中的点上当生物利用度达到最大和系统前降解降到最低时 释放制剂的活性部分。可W包括另外的试剂W促进治疗分子的吸收。还可W采用稀释剂、调 味剂、低烙点蜡、植物油、润滑剂、悬浮剂、片剂崩解剂和粘合剂。用于口服施用的药物组合 物也可W使用本领域众所周知的药学上可接受的载体W适合于口服施用的剂量进行配制。 此种载体使得药物组合物能够配制为用于由患者摄入的片剂、丸剂、锭剂、胶囊、液体、凝 胶、糖浆剂、膏剂、悬浮液等。
[0129] 用于口服使用的药物制剂可W运样获得:使活性化合物与固体赋形剂组合，且加 工所产生的颗粒混合物(任选地，在研磨后），W获得片剂或锭剂核屯、。需要时，可W加入合 适的助剂。合适的赋形剂包括碳水化合物或蛋白质填充剂，例如糖，包括乳糖、薦糖、甘露糖 醇和山梨糖醇;来自玉米、小麦、稻、马铃馨或其他植物的淀粉;纤维素，例如甲基纤维素、径 丙基甲基纤维素、或簇甲基纤维素钢;树胶，包括阿拉伯胶和黄著胶;和蛋白质例如明胶和 胶原。需要时，可W加入崩解剂或增溶剂，例如交联聚乙締化咯烧酬、琼脂和海藻酸或其盐， 例如海藻酸钢。
[0130] 锭剂核屯、可W与合适的包衣例如浓缩糖溶液结合使用，所述包衣还可W包含阿拉 伯树胶、滑石粉、聚乙締化咯烧酬、carbopol凝胶、聚乙二醇、和/或二氧化铁、漆溶液、和合 适的有机溶剂或溶剂混合物。染料或色素可W加入片剂或锭剂包衣内，用于产品鉴定或表 征活性化合物的量，即剂量。
[0131] 可W 口服使用的药物制剂还包括由明胶制成的推入配合胶囊，W及由明胶制成的 软的、密封胶囊，和包衣例如甘油或山梨糖醇。推入配合胶囊可W包含与填充剂或粘合剂例 如乳糖或淀粉，润滑剂例如滑石粉或硬脂酸儀混合，和任选与稳定剂混合的活性成分。在软 胶囊中，活性化合物可W连同或不连同稳定剂溶解或悬浮于合适的液体内，所述液体例如 脂肪油、液体、或液体聚乙二醇。
[0132] 另外的药物组合物对于本领域技术人员将是显而易见的，包括设及在持续或控制 递送制剂中的多肤的制剂。用于配制各种其他持续或控制递送方式，例如脂质体载体、生物 可蚀解的微粒或多孔珠和储存注射的技术，也是本领域技术人员已知的。参见例如，描述用 于递送药物组合物的多孔聚合微粒的控制释放的PCT/US93/00829。持续释放制剂的另外例 子包括成形物品形式的半透聚合物基质，例如膜或微胶囊。持续释放基质可W包括聚醋、水 凝胶、聚交醋（11.5.3,773,919、6? 58,481)^-谷氨酸和丫乙基-1^-谷氨酸盐的共聚物 (Sidman等人，BiopoIymerS，22:547-556( 1983)、聚（2-径乙基-甲基丙締酸醋KLanger等 人，J. Biomed .Mater. Res .，15 :167-277 ,(1981); Langer等人，畑em. Tech12 :98-105 (1982))、乙締乙酸乙締醋(Xanger等人，同上）或聚-0(-)-3-?下酸化P 133,988)。持续释 放的组合物还包括脂质体，其可W通过本领域已知的几种方法中的任何一种进行配制。参 见例如，E卵Stein等人，PNAS(USA) ,82:3688(1985) ;EP 36,676;EP 88,046;EP 143,949。
[0133] 待用于体内施用的药物组合物一般必须是无菌的。运可W通过经过无菌滤膜过滤 来实现。当组合物冻干时，使用运种方法的灭菌可W在冻干和重配前或后执行。用于肠胃外 施用的组合物可WW冻干形式或在溶液中进行胆存。此外，肠胃外组合物一般置于具有无 菌进入口的容器内，例如具有可由皮下注射针穿透的塞子的静脉内溶液包或管形瓶。
[0134] 一旦药物组合物已配制，它就作为溶液、悬浮液、凝胶、乳状液、固体或脱水或冻干 粉剂胆存于无菌管形瓶内。此种制剂可W W立即可用形式或W在施用前需要重配的形式 (例如，冻干的)进行胆存。
[0135] 在一个具体实施方案中，本发明设及用于产生单剂施用单位的试剂盒。试剂盒可 W各自包含具有干燥蛋白质的第一个容器和具有水制剂的第二个容器。还包括在本发明的 范围内的是包含单和多室预填充注射器(例如，液体注射器和溶解注射器Qyosyringes)) 的试剂盒。
[0136] 在治疗上采用的有效量的药物组合物将依赖例如治疗背景和目的。本领域技术人 员应当理解用于治疗的合适剂量水平因此将部分依递送的分子、多肤用于的适应症、施用 途径、W及患者的体型（体重、体表或器官大小）和状况(年龄和一般健康）而变化。因此，临 床医生可W逐步滴加剂量且修改施用途径W获得最佳疗效。一般的剂量可W是约0.1 mg/ kg-最多约lOOmg/kg或更多，依赖上文提及的因素。多肤组合物可W优选静脉内注射或施 用。长效药物组合物可W每3-4天、每周或每2周进行施用，依赖具体制剂的半衰期和清除 率。给药频率将依赖使用的制剂中的多肤的药代动力学参数。一般地，施用组合物直至达到 实现所需效应的剂量。组合物因此可W作为单剂或多剂（W相同或不同浓度/剂）随时间施 用，或作为连续输注施用。常规进行合适剂量的进一步改善。合适剂量可W通过使用合适的 剂量-反应数据进行确定。
[0137] 药物组合物的施用途径依照已知方法，例如口服、通过静脉内、腹膜内、大脑内（实 质内）、脑室内、肌内、眼内、动脉内、n静脉内、病变内途径、髓内、銷内、屯、室内、经皮、皮下 或腹膜内注射；W及鼻内、肠内、局部、舌下、尿道、阴道或直肠方法，通过持续释放系统或通 过植入装置施用。需要时，组合物可W通过推注或连续输注或通过植入装置进行施用。可替 代地或另外地，组合物可W经由植入已吸附或封装所需分子的膜、海绵或其它合适材料进 行局部施用。当使用植入装置时，装置可W植入任何合适的组织或器官内，并且所需分子的 递送可W经由扩散、定时释放丸或连续施用。
[0138] 在某些情况下，本发明的VActRIIB多肤可W通过植入某些细胞进行递送，所述细 胞已使用例如本文描述的那些方法进行基因工程化，W表达和分泌多肤。此种细胞可W是 动物或人细胞，并且可W是自体的、异体的或异种的。任选地，细胞可W是永生化的。为了减 少免疫应答的机会，细胞可W进行封装W避免渗入周围组织。封装材料一般是生物相容的、 半透的聚合外壳或膜，其允许多肤产品的释放，但避免细胞被患者的免疫系统或来自周围 组织的其他有害因子破坏。
[0139] 还考虑了在体内的vActRIIB基因疗法，其中将编码vActRIIB或vActRIIB衍生物的 核酸分子直接引入受试者内。例如，经由核酸构建体连同或不连同合适的递送载体例如腺 伴随病毒载体的局部注射，将编码vActRIIB的核酸序列引入祀细胞内。可替代的病毒载体 包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、单纯瘤疹病毒和乳头瘤病毒载体。可W通过包含所需核 酸序列的所需核酸构建体或其他合适的递送载体的局部注射、脂质体介导的转移、直接注 射(裸露DNA)或微粒轰击(基因枪)在体内实现病毒载体的物理转移。
[0140] vActRIIB组合物的用途
[0141] 本发明提供了通过使多肤与vActRIIB多肤接触，用于在体内和在体外减少或中和 肌抑素、激活素 A或GDF-Il的量或活性的方法和药物组合物。vActRIIB多肤对于肌抑素、激 活素 A和GDF-Il具有高亲和力，并且能够减少且抑制肌抑素、激活素 A和GDF-Il中的至少一 种的生物活性。在某些实施方案中，与野生型ActRIIB多肤比较，vActRIIB多肤显示出改善 的活性。运在下文实施例中证实。
[0142] 在一个方面，本发明提供了通过给受试者施用有效剂量的vActRIIB组合物，用于 治疗需要此种治疗的受试者中的肌抑素相关和/或激活素 A相关病症的方法和试剂。如本文 所使用的，术语"受试者"指任何动物，例如哺乳动物，包括人。
[0143] 本发明的组合物用于增加作为体重百分比的无脂肪肌肉量且减少作为体重百分 比的脂肪量。
[0144] 可W通过vActRIIB组合物治疗的病症包括但不限于各种形式的肌肉消耗、W及代 谢素乱例如糖尿病和相关病症、和骨退化性疾病例如骨质疏松症。vActRIIB组合物已证实 在治疗下文实施例3中所示的各种疾病模型的肌肉消耗病症中有效。运在抑制素-a敲除小 鼠中的肌肉消耗治疗、结肠 -26癌症恶病质模型中的肌肉消耗治疗、后肢悬吊模型中的肌肉 萎缩预防、显示无脂肪肌肉量中的增加的OXV雌性治疗、脂肪量的减少和骨矿物质含量的增 加中得到证实。
[0145] 肌肉消耗病症还包括营养不良，例如杜兴氏肌营养不良、进行性肌营养不良、贝克 型肌营养不良、代-兰二氏肌营养不良、欧勃肌营养不良、和婴儿神经轴突肌营养不良。另外 的肌肉消耗病症起于慢性疾病或病症，例如肌萎缩性侧索硬化、充血性阻塞性肺疾病、癌 症、AIDS、肾衰竭、器官萎缩、雄激素剥夺和类风湿性关节炎。
[0146] 肌抑素和/或激活素的超量表达可W促成恶病质，即一种严重的肌肉和脂肪消耗 综合征。VActRIIB多肤在治疗动物模型中的恶病质中的有效性在下文实施例3中显示。恶病 质也由于类风湿性关节炎、糖尿病肾病、肾衰竭、化学疗法、由于烧伤导致的损伤W及其他 原因而出现。在另一个例子中，发现肌抑素免疫反应蛋白质的血清和肌内浓度在显示出 AIDS相关肌肉消耗的人中增加，并且与无脂肪量体重相关(Gonzalez-化david等人，PNAS USA 95:14938-14943( 1998))。肌抑素水平还已显示反应于烧伤而增加，导致分解代谢肌效 应化ang等人，FASEB J 15,1807-1809(2001))。导致肌肉消耗的另外状况可能起于由于残 废导致的不活动，例如限制在轮椅中、由于中风长期邸床休息、疾病、脊髓损伤、骨折或创 伤、和微重力环境(太空飞行）中的肌肉萎缩。例如，发现血浆肌抑素免疫反应蛋白质在长期 邸床休息后增加(Zachwieja等人J Gravit F*hysiol .6(2): 11(1999)。还发现与未暴露的大 鼠肌肉比较，在航天穿梭飞行过程中暴露于微重力环境的大鼠肌肉表达增加量的肌抑素 (Lalani等人，J.Endocrin 167(3) :417-28(2000))。
[0147] 此外，脂肪与肌肉比的年龄相关性增加、W及年龄相关的肌肉萎缩看起来与肌抑 素相关。例如，在年轻(19-35岁）、中年(36-75岁）和老年(76-92岁）男性和女性的组中，平均 血清肌抑素-免疫反应性蛋白质伴随年龄而增加，而在运些组中平均肌肉量和无脂肪体重 伴随年龄而减少(Yarasheski等人J Nutr Aging 6(5):343-8(2002))。此外，目前已发现肌 抑素在屯、肌中W低水平表达，并且表达在梗死后的屯、肌细胞中上调（Sharma等人，J Cell Physiol. 180(1): 1-9(1999))。因此，减少屯、肌中的肌抑素水平可能改善梗死后屯、肌的恢 复。
[0148] 肌抑素看起来还影响代谢素乱，包括2型糖尿病、非膜岛素依赖型糖尿病、高血糖 症和肥胖。例如，肌抑素的缺乏已显示改善两个小鼠模型的肥胖和糖尿病表型（Yen等人 FA沈B J. 8:479( 1994)。已在美国申请序列号：11/590，962、美国申请公开号：2007/0117130 中证实，AAV-ActRIIBS载体增加动物中的肌肉与脂肪比，特别是对于肥胖动物模型。本公开 内容的vActRIIB多肤例如SEQ ID N0:4、6、8、10、12、14、16、20、22、24、26、28、30、32、34、36、 38、40、42、44、46、52、54、56、60、62、64、66、68、70、72、87、88、91、93、95适合于此种用途。因 此，通过施用本发明的组合物减少脂肪组成，将改善动物中的糖尿病、肥胖和高血糖状况。 此外，包含vActRIIB多肤的组合物可W减少肥胖个体中的食物摄入，如美国申请序列号： 11/590,962、美国申请公开号:2007/0117130中对于vActRIIB多肤证实的。
[0149] 施用本发明的ActRIIB多肤可W改善骨强度，并且减少骨质疏松症和其他退化性 骨疾病。运已在下文描述的OVX小鼠模型中得到证实。还已发现例如肌抑素缺陷小鼠显示出 增加的小鼠化骨矿物质含量和密度，W及在肌肉附着的区域处增加的小梁和骨皮质矿物质 含量，W及增加的肌肉量化amrick等人Calcif Tissue Int 71(1) :63-8(2002))。此外，本 发明的vActRIIB组合物可W用于治疗雄激素剥夺的效应，例如用于治疗前列腺癌的雄激素 剥夺疗法。
[0150] 本发明还提供了通过给动物施用有效剂量的vActRIIB蛋白质，增加食物动物中的 肌肉量的方法和组合物。因为成熟的C末端肌抑素多肤在所有测试物种中是相同的，所W vActRIIB多肤将预期在农业重要物种(包括牛、鸡、火鸡和猪）中有效增加肌肉量和减少脂 肪。
[0151] 本发明的vActRIIB多肤和组合物还括抗激活素 A的活性。激活素 A已知在某些类型 的癌症特别是性腺肿瘤例如卵巢癌中表达，并且引起几种恶病质。（Ciprano等人 Endocrinol 141 (7) :2319-27(2000)，化〇11 等人，Endocrinol 138(11):5000-5(1997); Coerver等人，Mol Endocrinol 10(5) :534-43(1996); Ito等人化itish J Cancer82(8): 1415-20(2000)，Lambe;rt-Messe;rIian,等人，Gynecologic Oncology 74:93-7(1999)。在下 文实施例3中，本发明的vActRI IB多肤已证实有效治疗几种恶病质、减少肿瘤大小、且在抑 制素-Q敲除小鼠模型和结肠-26癌症恶病质小鼠模型中延长存活。因此，本公开内容的组合 物可W用于治疗与激活素 A超量表达相关的状况、W及肌抑素表达，例如来自某些癌症的恶 病质和治疗某些性腺类型的肿瘤。
[0152] 本公开内容的组合物可W单独或与其他治疗试剂组合使用，W增强其疗效或减少 潜在的副作用。运些性质包括增加的活性、增加的溶解度、减少的降解、增加的半衰期、减少 的毒性、和减少的免疫原性。因此，本公开内容的组合物可W用于延长治疗方案。此外，本发 明的化合物的亲水性和疏水性性质将良好平衡，从而增强其用于体外和特别是体内用途的 功用。特别地，公开内容的化合物在水介质中具有合适程度的溶解度，运允许在体内的吸收 和生物利用度，同时在脂质中也具有一定程度的溶解度，运允许化合物经过细胞膜至假定 作用位点，例如特定肌肉团。
[0153] 此外，本发明的VActRIIB多肤对于在许多测定中检测且定量肌抑素、激活素 A或 GDF-Il有用。一般而言，本发明的ActRIIB多肤在各种测定中用作捕获试剂，W结合且固定 肌抑素、激活素 A或GDF-11，类似于例如在Asai,编辑，Methods in Cell Biology, 37， Antibodies in Cell Biology ,Academic Press，Inc. ,New 化rk( 1993)中描述的那些。多 肤可W W某些方式进行标记，或可W与第=种分子反应，所述第=种分子例如进行标记W 使得能够检测且定量肌抑素的抗体。例如，多肤或第=种分子可W用可检测部分例如生物 素进行修饰，其随后可W由第四种分子例如酶标记的链霉亲和素或其他蛋白质结合。 (AkerstromJ Immunol 135:2589(1985) ;Qiaube;rt，Mod 化tholl0:585(1997))。
[0154] 本发明已得到描述，下述实施例提供用于举例说明而不是限制。
[0155] 实施例1
[0156] vActRIIB多肤的表达和纯化
[0157] 下述方法用于表达且纯化变体ActRIIB多肤。
[0158] 从人睾丸来源的CDNA文库(0〇11*6油，111(3.)中分离人激活素118型受体的。0臟，且 如美国申请序列号：11/590,962、美国申请公开号:2007/0117130中所述进行克隆。
[0159] 氨基酸取代的测定
[0160] 结构分析、分子建模和质谱法的组合方法表明，聚集(寡聚化)可W通过分子间二 硫键形成在ActRIIB中出现，所述分子间二硫键形成由在非糖基化的ActRIIB分子之间的静 电和H键合相互作用触发。残基28和40确定为参与ActRIIB: ActRIIB相互作用而不参与 ActRIIB与其配体的相互作用。
[0161] 最初，在ActRIIB-Fc上的E28和R40在每个位置处用A取代。光散射和质谱法分析证 实与野生型蛋白质比较，完全糖基化的vActRIIB-IgGlFc、E28A和VActRIIB-IgGlFc R40A的 级分显著增加。E28A和R40A VActRIIB-IgGl化在37°C下溫育6天，导致与野生型比较，很少 的聚集或无聚集。进行在位置28和40处(针对具有信号序列的SEQ ID N0:2和18)的氨基酸 取代，W减轻或阻止可W在野生型ActRIIB(SEQ ID N0:2和18)的表达或纯化过程中发生的 聚集。运种聚集已鉴定为在表达过程中的有结构寡聚体形成，W及在表达过程中和蛋白质 纯化后的无结构聚集体产生。
[0162] 根据下文程序，使用大小排阻层析确定在生产和纯化过程的不同阶段时的聚集。
[0163] 下述示例性方法用于产生变体ActRIIB多肤(vActRIIB和vActRIIB5)。使用包含导 致E28W突变的引物，使用PCR重叠延伸经由较链接头序列(编码SEQ ID NO:79的核巧酸），使 编码vActRIIB，E28W(SEQ ID N0:23)的多核巧酸与编码人IgGlFc结构域(SEQ ID N0:82)的 多核巧酸或编码人IgG2Fc(SEQ ID N0:84)的多核巧酸融合。全长多核巧酸序列是SEQ ID NO: 61。将双链DNA片段亚克隆到pTT5(BiOtechnology Research Institute ,rational Research Council Canada(NRCC)、6100Avenue Royalmount，Montr有al(Qu有bec)Canada H4P 2R2)、pDSR(W0/9014363中描述的）和/或pDSRa的衍生物内。在其他实施方案中，使编码 vActRIIB多肤的多核巧酸与编码接头GGGGS(SEQ ID N0:75)的多核巧酸或其多聚体或较链 接头(例如SEQ ID N0:70)连接。
[0164] 如下进行工程化的vActRIIB-Fc和vActRIIB5-Fc的瞬时表达。
[01化]上述两种分子的工程化的变体在无血清悬浮适应的293-6E细胞（National Research Council of (^inada，Ottawa，(^inada)内瞬时表达，所述细胞维持在补充有250]i g/ml遗传霉素 Invitrogen)和0.1 %Plu;roniC F68( Invitrogen)的Freestyle?培养基 (Invitrogen Coloration，Car 1 sbad，CA)中。转染作为IL培养物执行。简言之，使细胞接种 物在化fernbach摇瓶(Corning，Inc.)中生长至l.lX106个细胞/ml。摇瓶培养物W65RPM 维持在 Innova 2150 振荡平台（News Brunswick Scientific ,Edison, NJ)上，所述振荡平台 置于维持在37°C和5%C02下的增湿培养箱中。在转染时，使293-6E细胞稀释至1 .OX IO6个细 胞/ml。
[0166] 转染复合物在100mL Freestyle培养基中形成。首先将Img质粒DNA加入培养基中， 随后加入3ml FuGene 皿转染试剂(Roche A卵lied Science,Indianapolis,IN)。转染复合 物在室溫下溫育约15分钟，随后加入摇瓶中的细胞。转染后24小时，加入20% (w/v)蛋白腺 TNl(OrganoTechnie S.A.，TeknieScience，QC,Canada) W达到0.5% (w/v)的终浓度。转染/ 表达执行4-7天，运之后通过在4，OOORPM下于4°C离屯、60分钟收获条件培养基。
[0167] 如下执行稳定转染和表达。使用标准电穿孔操作，通过用表达质粒PDC323- vActRIIB 化 28W)-huIgG2Fc 和 pDC324-vActRIIB 巧 28W)-huIgG2Fc 转染稳定的 C 册宿主细胞 来产生 vActRIIB-human(hu)IgG2-Fc 细胞系（根据Bianchi 等人，Biotech 和 Bioengineering，84(4) :439-444(2003))。用表达质粒转染宿主细胞系后，使细胞在不含 GHT的无血清选择培养基中生长2-3周，W允许质粒的选择和细胞的回收。直到细胞达到超 过85%的生存力时才选择细胞。运个转染细胞合并物随后在包含150nM甲氨蝶岭的培养基 中进行培养。
[016引细胞系克隆
[0169] 根据下述操作由所选择的克隆制备细胞合并物。将稳定转染的细胞的扩增合并物 种植在96孔板中，并且在小规模研究中评估候选克隆的生长和生产力性能。由所选择的克 隆制备约60个管形瓶的前主(Pre-master)细胞库(PMCB)。所有PMCBs对无菌性、支原体属和 病毒进行测试。
[0170] 使用典型的分批补料过程按比例增加 vActRIIB-Fc表达细胞系。将细胞接种到 Wave生物反应器(Wave Biotech化C)内。培养物用弹丸补料进行3次补料。在第10天时收获 IOL，其余在第11天时收获;使两种种收获物经历深层过滤，随后无菌过滤。条件培养基经过 10英寸0.45/0.2微米预滤器过滤，随后通过6英寸0.2微米滤器进行过滤。
[0171] 蛋白质纯化
[0172] 使用5ft2 IOK膜切向流滤器（Pall)浓缩包含ActRIIB-Fc(IgGl和IgG2)、 ActRIIB5-Fc(IgGl和IgG2)、和运些的变体的约化条件培养基。将浓缩的材料应用于5mL Protein A High Performance Column?(GE Healthcare),所述柱已用PBS(不含氯化儀或 氯化巧的Du化ecco'S)进行平衡。在用平衡缓冲液洗涂柱直至在280皿(OD280)处的吸光度小 于0.1后，用0.IM甘氨酸-肥1，抑2.7洗脱结合的蛋白质，并且立即用IM Tris-肥1，抑8.5 中和。使中和的洗脱的合并物浓缩至Iml的体积，并且应用于320ml Sephacryl-200柱(GE Heal thcare)，所述柱在PBS(不含氯化儀或氯化巧的Du化ecco ' S)中进行平衡。在4-20 % SDS PAGE凝胶（Invitrogen)中电泳，W测定合并何种级分。如下所示，测试运些多肤的活性和聚 集程度。
[0173] 任选地，多肤可W使用例如使用化P-Se地arose柱进行进一步纯化。使用0D280测 定浓度。
[0174] 实施例2
[01巧]体外活性测定
[0176] 如上所述纯化的vActRIIB多肤的样品用憐酸盐缓冲盐水（PBS:2.67mM氯化钟、 138mM氯化钢、1.47mM憐酸二氨钟、8. ImM憐酸氨二钢，pH 7.4)稀释至0.2mg/ml，在37°C下溫 育6天，随后应用于MLDI-MS(基质辅助激光解吸/电离质谱法）、SEC和/或SEC-LS分析。在蛋 白质A纯化步骤后的野生型和变体多肤的聚集使用SEC或SEC-LS进行测定，并且分子的分子 量使用下文描述的MLDI-MS操作加 W证实。
[0177] 大小排阻层析（SEC)。实验在具有串联的两个柱（T0S0HAAS G3000swxl, 7.8x 300mm)的Agilent IIOOHPLC系统上执行。2x PBSWO.5ml/分钟用作移动相。
[0178] 大小排阻层析-光散射。实验在具有Superdex-200凝胶过滤柱（Amersham 化armacia ,Waukesha，WI)的Agi lent 11OOHPLC系统上执行。随后使样品经过Wyatt miniDawn LS激光散射检测器和Wyatt Optilab DSP折射计(Wyatt Technology Co.,San1:a 8日&日招，〔4)，^测定分子量。？85^0.41111/分钟用作移动相。
[0179] 基质辅助激光解吸/电离质谱法。使样品与芥子酸混合（1:1)，并且应用于MALDI- MS(Applied Biosystems Voyager System 2009)。运个操作用于检查分子的分子量。
[0180] 如下所述获得关于激活素和肌抑素的结合亲和力和ICso值的测定值。
[0181] 定量BIAcore?测定。E28和R40在如上所述与IgGWc的融合物中分别由其他天然 氨基酸取代。如下表中所示，运些连同或不连同接头产生。在山羊抗人IgGlFc抗体(Jackson Immuno Research,目录#109-005-098,批次63550)包被的CM5表面上捕获来自条件培养基 的每个vActRIIB-IgGIFc样品。使用BIACore2000(BIACore Life Sciences ,Piscataway， New Jersey)将20nM激活素 A注射在捕获的样品表面上。所产生的传感图对捕获的化 (500RU)vActRIIB-IgGl化变体进行标准化。某些变体的标准化的结合反应(RU)显示于表2 中，并且在下文进一步描述。激活素的相对结合亲和力也通过Biacore测量进行测定，其中 使用得自哺乳动物细胞表达的条件培养基。激活素 A(20nM)用于捕获条件培养基中的可溶 性受体多肤，且使测量的sra信号标准化。标准化的SPR+++++: >60，++++: 40-60，+++: 20-40， ++:10-20,+:5-10,-：<5〇
[0182] 表1A和IB概括了相对结合数据的结果。下表显示VActRIIB-IgGlFc的某些实施方 案特别W比野生型高的亲和力与激活素 A结合，或保留与野生型相似的亲和力。
[0183] 表1A
[0184] 野牛巧巧T賴化的AntR T TR-T祐1 Fn结合（稳吿掉泌子）
[0185]
[0186] 表1B
[0187] 野生型和工程化的ActRIIB-IgGlFc结合(瞬时转染子）
[018 引 [i
[0190] 基于C2C12细胞的活性测定
[0191] 如上所述产生VActRIIBS-IgGl化和VActRIIB-IgGlFc变体。如下所述使用基于细 胞的活性测定来测试运些变体抑制激活素 A或肌抑素与激活素 IIB受体结合的能力。
[0192] 通过用pMRE-luc构建体转染C2C12成肌细胞(ATCC No:C化-1772)来产生肌抑素/ 激活素/GDF-11反应性报道受体细胞系。pMARE-luc构建体运样制备:克隆CAGA序列的12个 重复序列，将肌抑素/激活素反应性元件(Dennler等人EMBO 17:3091-3100( 1998))表示到 pLuc-MCS报道载体（Stratagene目录#219087)内TATA盒上游。C2C12细胞在其细胞表面上天 然表达激活素受体IIB。当肌抑素/激活素/GDF-11结合细胞受体时，激活Smad途径，并且憐 酸化的Smad与反应元件结合(Macias-Silva等人Cell 87:1215(1996))，导致蛋光素酶基因 的表达。蛋光素酶活性随后使用商业蛋光素酶报道测定试剂盒（目录#E4550，Promega， Madison, WI)根据制造商的方案进行测量。已用pMARE-luc(C2C12/pMRE)转染的C2C12细胞 的稳定系根据下述操作用于测量活性。将报道细胞铺平板到96孔培养物内。用固定在4nM激 活素的浓度执行使用野生型和如上所述构建的变体ActRIIB-IgGl化融合物的稀释液的筛 选。激活素 AW几个浓度与受体进行预溫育。激活素活性通过测定处理的培养物中的蛋光素 酶活性进行测量。对于每种多肤测定ICso值。运些显示于表2中。对于如上所述产生的 ActRIIB-huIgG2化融合物遵循相同操作，用于测定肌抑素。使用相同方法，蛋白质A纯化的 野生型和变体用于测定肌抑素的ICso值。对于运种测定，多肤与4nM肌抑素预溫育。此外，聚 集程度使用上文描述的操作进行测定。运些值在下表3中给出。
[0193] 在表1A中列出的ActRIIBS-IgGlFc变体组中，几种ActRIIB-IgGlFc变体和3种 ActRIIBS-IgGlFc变体连同野生型多肤一起进一步纯化，且通过SPR(表面等离子体共振)在 20nM激活素 A的浓度进行分析。表2显示所选择的VActRIIB-IgGlFc多肤对于激活素的Sra结 合亲和力。激活素 A(20nM)用于捕获样品中的vActRIIB多肤，且使测量的Sra信号标准化。 ICso值得自上文所述基于细胞的激活素抑制测定。标准误对于所有结果小于10%。
[0194] 表2
[0195]
[0196] 如上表2中所示，与野生型比较，VActRIIB-IgGlFc化28W)用于阻断激活素的ICso值 是 2.0 化M，并且 vActRIIB-IgGlFc 巧 28Y)的 ICsq 值是 2.1nM。此外，vActRIIB-IgGlFc 的 E28W 和 E28Y变体是稳定的，并且在纯化后不聚集。
[0197]同样对于另外的变体多肤测定在基于细胞的肌抑素阻断测定中的ICso值。运些变 体是缺乏信号序列和N末端前6个氨基酸的成熟的截短的VActRIIB多肤。运些序列显示于表 3中。表3显示在蛋白质A纯化后的蛋白质聚集百分比，W及针对肌抑素的ICso值。可W看出与 野生型比较，聚集百分比对于变体多肤小得多。对于不含信号序列和N末端4个氨基酸且具 有如下所示的等同取代的成熟的截短的VActRIIB多肤，获得类似结果。
[019引表3
[0199]
[020引
[0209] 实施例3
[0210] 使用vActRIIB的体内处理
[0211] 根据下文描述的操作，所有下述动物研究使用成熟的截短的vActRIIB-IgG2Fc 化28W)多肤(SEQ ID N0:91)来进行。
[0212] 在抑制素-a缺陷小鼠中的肌肉消耗的处理
[0213] 抑制素-a是天然存在的激活素 A抑制剂。缺乏抑制素-a的小鼠显示在循环中显著 升高的激活素 A水平，且患有与自发性肿瘤形成相关的致死性消耗综合征，所述肿瘤例如卵 巢、睾丸癌和肾上腺癌（Matzuk等人，PNAS 91(19) :8817-21(1994) ,Cipriano等人 化docrinologyl21 (7) :2319-27(2000) ,Matz址等人，NaUire 360(6402) :313-9( 1992))。对 于下述实验，抑制素-日敲除小鼠（C57I3L/6J)得自QiarIes I^iver Laboratories。在抑制素- 曰敲除小鼠中检查vActRIIB-IgG2Fc E28W(沈Q ID N0:91)(下文为E28W、或E28W多肤、或可 溶性受体E28W)对体重和肌肉量的影响。执行在8周龄的雄性抑制素-a敲除小鼠中的14天单 次注射研究。在8周龄时，与年龄匹配的野生型同窝对照小鼠比较，雄性抑制素-a敲除小鼠 已失去超过25%的体重。在第0天时，5只敲除小鼠给予628胖(3〇111旨/1^)的单次皮下注射，而5 只敲除小鼠皮下施用相同体积的PBS(媒介物）。作为基线对照，在第0天时，5只年龄匹配的 野生型小鼠施用媒介物的单次皮下注射。小鼠在第0天、第7天和第14天时进行称重。在第14 天结束时，处死所有小鼠，并且经由尸检分析其无脂肪尸体重量和脾肠肌量。在14天的研究 时期，媒介物处理的敲除小鼠的平均体重下降约1. Ig,从第0天时的22.5g到第14天时的 21.4g。相比之下，E28W处理的敲除小鼠的平均体重显示Ilg的显著增加，从第0天时的22. Ig 到第14天时的33. Ig。末期尸检分析掲示在抑制素-a敲除小鼠中，E28W多肤事实上使无脂肪 尸体重量和脾肠肌量加倍，如下所示。与媒介物处理的敲除小鼠的约8.Og和媒介物处理的 野生型对照小鼠的约12. Ig比较，E28W处理的敲除小鼠的平均无脂肪尸体重量是约14.9g。 与媒介物处理的敲除小鼠的约209mg和媒介物处理的野生型对照小鼠的约324mg比较，E28W 处理的敲除小鼠的平均脾肠肌重量(来自两条腿)是约426mg。运些结果证实E28W多肤用于 处理重量减轻和肌肉消耗的疾病状态的有效性，并且概括于下表中。
[0214]
[0215] *:P<〇.05对WT+Veh;#:P<0.05对KO+Veh。
[0216] 在雄性和雌性抑制素-地O小鼠中分别检查E28W多肤的施用对睾丸和卵巢肿瘤的 形成率的影响。在运个研究中，11只抑制素-a敲除小鼠，包括8周龄的雄性(n = 5)和9周龄的 雌性(n = 6)，用E28W(30mg/kg)的单次皮下注射进行处理，而另外11只抑制素 -a敲除小鼠， 包括年龄匹配的雄性(n = 5)和雌性(n = 6)，接受相同体积的PBS(媒介物）的单次注射。此 夕h 11只野生型同窝对照小鼠，包括年龄匹配的雄性(n = 5)和雌性(n = 6)，施用媒介物的单 次注射。处理后2周，处死小鼠且实施尸检，W检查肉眼可鉴定的睾丸和卵巢肿瘤的形成率。 观察到11只媒介物处理的敲除小鼠中的10只发展出可鉴定的肿瘤。特别地，分别在检查的5 只雄性中的5只和6只雌性中的5只中发现睾丸和卵巢肿瘤形成。发现运些肿瘤的大小比野 生型对照小鼠中的相应正常睾丸或卵巢大2-3倍。运显示于图3中。仅10% (11只中的1只）的 E28W处理的抑制素-a敲除小鼠显示可见的肿瘤形成。特别地，在雌性中，6只E28W处理的敲 除小鼠中的1只发展出可鉴定的卵巢肿瘤，而6只未处理的雌性敲除中的5只与年龄匹配的 野生型对照比较，在卵巢的大小或总体形态学中具有很少的改变或无改变。5只E28W处理的 雄性敲除小鼠中的5只都未显示出可见肿瘤，与年龄匹配的野生型对照比较，在睾丸的大小 或总体形态学中具有很少的改变或无改变。运些结果证实E28W施用在减少抑制素 -CiKO小鼠 中的睾丸和卵巢肿瘤形成中有效，提示可溶性受体疗法在癌症治疗中的临床功用。
[0217]在雄性抑制素-a敲除小鼠中检查E28W多肤在治疗厌食症中的有效性。在运个研究 中，与年龄匹配的野生型小鼠 (n = 10)比较，抑制素-a敲除小鼠 (n = 5)中的食物消耗显著减 少。观察到E28W处理的抑制素-a敲除小鼠的食物消耗在检查的3周时期过程中显著增加。 E28W处理的敲除小鼠中的平均每周食物摄入增至略微高于年龄匹配的野生型对照小鼠中 的摄入的水平，并且比用媒介物处理的敲除小鼠的平均每周食物摄入高约50%。因此，数据 显示E28W处理在改善抑制素-地0小鼠中的厌食症中高度有效。
[0218] 在雄性和雌性抑制素-地0小鼠中分别检查E28W处理对存活的影响。对于雄性，约 50日龄的25只抑制素-地0小鼠施用E28W多肤（10mg/kg/wk，SC)，而26只年龄匹配的抑制素- 地0小鼠接受媒介物(PBS)。19只年龄匹配的野生型雄性小鼠接受媒介物且用作基线对照。 媒介物处理的敲除小鼠在研究的第15天（约65日龄)时开始死亡。到实验的第34天（约84日 龄)时，50 %媒介物处理的敲除小鼠已死亡，并且到第78天(约128日龄)时，其中100 %已死 亡。相比之下，25只用E28W多肤处理的敲除小鼠或19只用媒介物处理的野生型对照小鼠无 一在研究的第78天（约128日龄)前死亡。在E28W处理的敲除小鼠中，25只中的1只在研究的 第78天(约128日龄)时死亡，并且25只中的24只存活超过第100天(约150日龄）。无媒介物处 理的野生型小鼠在100天的研究阶段中死亡。类似存活研究结果在雌性抑制素-地0小鼠中 获得。约50日龄的22只雌性抑制素-地0小鼠用E28W(10mg/kg/wk，SC)进行处理，而23只相同 年龄的雌性抑制素-地0小鼠用PBS(媒介物)进行处理。同时，17只野生型雌性对照小鼠用媒 介物进行处理。媒介物处理的雌性敲除小鼠在研究的第40天（约90日龄)时开始死亡。到实 验的第58天(约108日龄)时，50 %媒介物处理的雌性敲除小鼠已死亡，并且到第86天(约136 日龄)时，其中100 %已死亡。相比之下，仅约5 % (22只中的1只化28W处理的雌性敲除小鼠已 死亡，而约90% (22只的20只）存活超过研究的第120天（约170日龄）。无媒介物处理的野生 型小鼠在120天研究阶段中死亡。因此，数据证实E28W多肤治疗在显著延长雄性和雌性抑制 素-O敲除小鼠的存活中有效。关于雄性和雌性敲除小鼠的存活曲线的示意图表在图4中提 供。
[0219] 携带结肠-26肿瘤的小鼠中的肌肉消耗的治疗
[0220] 携带结肠-26肿瘤的小鼠是广泛使用的用于研究癌症恶病质的临床前动物模型 等人，Int J Cancer 68(5) :637-43(1996) ,Kwak等人，Cancer Research 64(22): 8193-8(2004) )dE28W多肤对体重改变、肌肉量和存活率的影响在携带肿瘤的小鼠中进行研 究。结肠-26(C-26)肿瘤细胞Wo. 5x IO6个细胞/小鼠皮下植入40只10周龄的、雄性CDFl小 鼠内。肿瘤植入在第0天时执行。在肿瘤植入后第5天开始，20只C-26小鼠用lOmg/kg vActRIIB IgG2化E28W(SEQ ID N0:91)的皮下注射每周进行处理，而20只C-26小鼠用媒介 物(PBS)进行处理。同时，10只年龄和重量匹配的正常小鼠仅用媒介物(PBS)进行处理。体重 和食物摄入每周测定3次。携带肿瘤的小鼠每天2次进行存活检查。使用与PC计算机连接的 卡尺化Itra-化1 IV IP65电子测径器，化ed V化wler Co.Boston MA)测量肿瘤大小，并且 数值自动记录至Microsoft Excel数据文件中的工作表。如图5中所示，肿瘤植入后2周，携 带C-26肿瘤的小鼠发展出严重恶病质，并且急剧丧失其体重。E28W处理有效缓和携带肿瘤 的小鼠中的体重减轻。用E28W处理的携带肿瘤的小鼠的平均体重显著高于用媒介物处理的 携带肿瘤的小鼠的平均体重(P<〇.001，从肿瘤接种后第7天到第33天，不成对T检验，Graph pad Software Inc.San Di ego CA)。
[0221] E28W多肤处理和媒介物处理的组之间的肿瘤大小不存在差异，表明治疗对C-26肿 瘤生长无影响。末期尸检分析显示E28W处理的携带C-26肿瘤的小鼠的平均无脂肪尸体重量 和脾肠肌重量显著高于用媒介物处理的携带肿瘤的小鼠的那些(对于无脂肪尸体和脾肠肌 於0.001)。628胖对携带(：-26肿瘤的小鼠的存活的影响显示于图6中。媒介物处理的小鼠在肿 瘤植入后约第14天时开始死亡。在肿瘤植入后第35天时，所有20只媒介物处理的携带C-26 肿瘤的小鼠死亡；然而，20只用E28W处理的携带C-26肿瘤的小鼠中的17只仍存活。因此， E28W处理导致携带C-26肿瘤的小鼠的存活的显著延长(p<0.0001，卡方检验）。因此，E28W多 肤不仅在维持体重和肌肉量中有效，而且在延长携带C-26肿瘤的小鼠的存活中有效。
[0掛]后肢悬吊小鼠的处理
[0223] 后肢悬吊小鼠模型用于检查vActRIIB-IgG2Fc E28W(SEQ ID N0:91)对疾病状态 中的肌肉量的影响。后肢悬吊操作基本上与先前由化rlson CJ等人(化rlson CJ，Booth FW 和Gordon SE:Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol.277:R601-RR606，1999)报告的 相同。9周龄的雌性巧7BL/6小鼠用于研究。总共60只小鼠如下分成3组：1.用媒介物(PBS)处 理的未悬吊的基线对照组(20只小鼠），2.用媒介物处理的后肢悬吊组（20只小鼠），和3.用 vActRIIB-IgG2Fc，E28W处理的后肢悬吊小鼠组(20只小鼠）。特别地，在后肢悬吊开始时，分 别对上文描述的组给予30mg/kg VActRIIB-IgG 2Fc E28W或媒介物的单次SC注射。体重改 变每周纵向测量2-3次。来自每个组的5只小鼠在下述4个不同时间点时处死:第1天、第3天、 第7天和第14天。脾肠肌重量经由尸检进行测定。
[0224] 如下表中所示，后肢悬吊导致体重最高达10%的显著减轻。用vActRIIB-IgG2Fc E28W处理后肢悬吊小鼠导致显著的体重增加，其水平高于媒介物处理的后肢悬吊组或未悬 吊的基线对照组，运是通过ANOVA测量分析的。在2周研究过程中，分别与媒介物处理的悬吊 组中的0.2%下降和未悬吊基线对照组中的4.8%重量增加比较，vActRIIB-IgG2Fc E28W (SEQ ID N0:91)处理组的平均体重增加是12.6%。时程尸检结果显示与体重平行改变的后 肢肌肉量。用vActRIIB-IgG2Fc化28W)处理悬吊小鼠，完全缓解肌肉丧失。因此，运个实验的 结果显示E28W在与废用相关的肌肉萎缩治疗中有效。
[02251
[0。6] OVX小鼠的处理
[0227] 切除卵巢的雌性巧7B16小鼠（OVX)考虑作为用于雌性性腺机能减退和骨质疏松症 的模型。24只雌性巧7B16小鼠在3月龄时切除卵巢，并且允许恢复3个月。在6月龄时，24只 OVX小鼠 W及24只年龄匹配的假手术对照巧7B16小鼠在3个月的处理阶段中通过NMR和骨量 (PIXImus-GE LUNAR Co巧oration)测量体重、肌肉和脂肪量的纵向改变。在该阶段结束 时，处死动物，并且在末期尸检过程中收获骨组织，且实施Faxitron X射线和显微CT ^axitron X-ray Corporation和GE Medical系统）分析。证实E28W变体受体（SEQ ID NO: 91)在增加体重特别是无脂肪骨骼肌量和骨量方面有效，同时使小鼠的脂肪含量减少至未 切除卵巢的小鼠中可见的水平。特别地，在12周的阶段中，与对用E28W处理的假手术小鼠比 较，与对OVX加媒介物或假手术加媒介物的无脂肪肌肉量基本上无增加比较(对于OVX加媒 介物约19克或对于野生型加媒介物约20克），无脂肪肌肉量对于用E28W处理的OVX小鼠从 20g增至27.Og。在相同研究中，到12周研究结束时，用E28W处理的OVX小鼠显示减少的脂肪 量，从平均Sg/动物到平均约4g/动物，与假手术的动物相似。相比之下，用媒介物处理的OVX 小鼠在研究过程中的任何时间时未丧失脂肪量。最后，与媒介物处理的OVX小鼠比较，骨量 在用E28W处理的OVX小鼠中增加。通过PQCT(外周定量计算机体层摄影)分析测定在末期尸 检过程中收获的解剖骨的股骨/腔骨BMC(骨矿物质含量)分析。在12周研究结束时，用E28W 处理的OVX小鼠使BMC从约0.045g/cm增至约0.055g/cm，运与假手术的媒介物处理动物的最 终BMC相似。在12周研究结束时，用媒介物处理的OVX小鼠显示约相同的0.045g/cm的BMC。在 12周研究结束时，E28W处理的野生型小鼠显示BMC从约0.054g/cm到约0.065g/cm的增加。运 些研究证实E28W多肤作为老年人中的脆性、骨质疏松症和肥胖的潜在治疗的有效性。
[0228] 本发明不限于本文描述的具体实施方案的范围中，所述实施方案预期仅作为本发 明的个别方面的举例说明，并且功能上等同的方法和组分在本发明的范围内。事实上，除本 文显示和描述的那些外，根据前述说明书和附图，本发明的各种修饰对于本领域技术人员 将是显而易见的。此种修饰预期包含在所附权利要求的范围内。
【主权项】
1. 包含变体激活素 IIB受体多肽(VActRIIB)的分离的蛋白质，其中所述多肽选自： (a) 包含SEQ ID NO: 18中所示氨基酸序列的多肽，其中所述多肽包含位置28处的氨基 酸取代； (b) 包含SEQ ID NO: 18的氨基酸19-134中所示氨基酸序列的多肽，其中所述多肽包含 位置28处的氨基酸取代； (c) 包含SEQ ID NO: 18的氨基酸23-134中所示氨基酸序列的多肽，其中所述多肽包含 位置28处的氨基酸取代； (d) 包含SEQ ID NO: 18的氨基酸25-134中所示氨基酸序列的多肽，其中所述多肽包含 位置28处的氨基酸取代； (e) 与（a)至(d)中的任何一个具有至少90%同一性的多肽，其中所述多肽包含对应于 SEQ ID NO: 18的位置28的位置处的氨基酸取代，其中所述多肽能够结合肌抑素、激活素 A或 GDF-Ilo2. 权利要求1的分离的蛋白质，其中所述vActRIIB多肽位置28处的取代选自A、F、Q、V、 I、L、M、K、H、W和Y的氨基酸取代E。3. 权利要求1的分离的蛋白质，其中所述vActRIIB多肽位置28处的取代选自A、W或Y的 氨基酸取代E。4. 权利要求1的分离的蛋白质，其中所述vActRIIB多肽位置28处的取代为W取代E。5. 权利要求1的分离的蛋白质，其中所述分离的蛋白质进一步包含SEQ ID NO: 79中所 示的序列。6. 权利要求1的分离的蛋白质，其中所述分离的蛋白质进一步包含SEQ ID NO:80中所 示的序列。7. 权利要求1的分离的蛋白质，其中所述多肽的序列与SEQ ID NO: 18的氨基酸25-134 中所示氨基酸序列具有至少99%同一性，且其中所述多肽包含位置28处的氨基酸取代，其 中所述位置28处的取代是A、W、Y、F、Q、V、I、L、M、K或H取代E，且其中所述多肽能够结合肌抑 素、激活素 A或⑶F-11。8. 权利要求1的分离的蛋白质，其中所述多肽的序列与SEQ ID NO: 18的氨基酸25-134 中所示氨基酸序列具有至少99%同一性，且其中所述多肽包含位置28处的氨基酸取代，其 中所述位置28处的取代是A、W、Y、F、Q、V、I、L、M、K或H取代E，且其中所述分离的蛋白质进一 步包含通过接头与vActRIIB多肽连接的Fc结构域。9. 权利要求1的分离的蛋白质，其中所述多肽的序列与SEQ ID NO: 18的氨基酸25-134 中所示氨基酸序列具有至少99%同一性，且其中所述多肽包含位置28处的氨基酸取代，其 中所述位置28处的取代是W取代E，且其中所述分离的蛋白质进一步包含通过肽接头（SEQ ID N0:79)与vActRIIB多肽连接的人Fc结构域（SEQ ID N0:80)。10. 权利要求1的分离的蛋白质，其中所述多肽与至少一种异源多肽融合。11. 包含权利要求1的蛋白质的二聚体。12. 药物组合物，其包含权利要求1的蛋白质与赋形剂。13. 权利要求11的二聚体，其中所述二聚体是同二聚体。14. 药物组合物，其包含权利要求11的二聚体与赋形剂。15. 药物组合物，其包含权利要求13的二聚体与赋形剂。16. 包含权利要求9的蛋白质的同二聚体。17. 药物组合物，其包含权利要求16的同二聚体与赋形剂。18. 药物组合物，其包含权利要求9的蛋白质与赋形剂。19. 分离的核酸分子，其包含编码权利要求1-10中任一项的蛋白质的多核苷酸。20. 重组表达载体，其包含权利要求19的核酸。21. 重组宿主细胞，其包含权利要求20的载体。22. 生产权利要求1-10中任一项的蛋白质的方法，其包括培养权利要求21的宿主细胞， 从而表达所述蛋白质。23. 权利要求1 -10中任一项的蛋白质、权利要求11、13和16中任一项的二聚体或权利要 求12、14、15、17和18中任一项的组合物在制备用于抑制需要的受试者中的肌抑素的药物中 的用途。24. 权利要求1 -10中任一项的蛋白质、权利要求11、13和16中任一项的二聚体或权利要 求12、14、15、17和18中任一项的组合物在制备用于增加需要的受试者中的无脂肪肌肉量或 增加需要的受试者中的无脂肪肌肉量与脂肪量的比例的药物中的用途。25. 权利要求1 -10中任一项的蛋白质、权利要求11、13和16中任一项的二聚体或权利要 求12、14、15、17和18中任一项的组合物在制备用于治疗需要的受试者中肌抑素相关的肌肉 消耗疾病或病症的药物中的用途。26. 权利要求25的用途，其中所述肌抑素相关的肌肉消耗疾病或病症选自肌营养不良、 肌萎缩性侧索硬化、充血性阻塞性肺疾病、慢性心力衰竭、癌症恶病质、老年性骨骼肌减少 症、器官萎缩、腕管综合征、雄激素剥夺、由于烧伤导致的恶病质、糖尿病肾病、和由于长期 卧床休息导致的肌肉消耗、脊髓损伤、中风、骨折、衰老或暴露于微重力。27. 权利要求1 -10中任一项的蛋白质、权利要求11、13和16中任一项的二聚体或权利要 求12、14、15、17和18中任一项的组合物在制备用于治疗需要的受试者中肌抑素相关的代谢 紊乱的方法。28. 权利要求27的用途，其中所述肌抑素相关的代谢紊乱选自糖尿病、肥胖、高血糖症 和骨丢失。29. 权利要求1 -10中任一项的蛋白质、权利要求11、13和16中任一项的二聚体或权利要 求12、14、15、17和18中任一项的组合物在制备用于治疗需要的受试者中的一种疾病的方 法，激活素在所述疾病中超量表达。30. 权利要求29的用途，其中所述疾病是癌症。31. 权利要求1 -10中任一项的蛋白质、权利要求11、13和16中任一项的二聚体或权利要 求12、14、15、17和18中任一项的组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。32. 权利要求31的用途，其中所述癌症是卵巢癌。
【文档编号】A61P3/04GK105924516SQ201610218042
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2008年3月6日
【发明人】宣延勋, L·T·谭, 韩汇泉, K·S·郭, 周小岚
【申请人】安姆根有限公司