蛋白酶激活受体1(par1)的拮抗剂抗体的制作方法

专利名称：蛋白酶激活受体1(par1)的拮抗剂抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛋白酶激活受体-1 (PARI)的抗体和抗原结合分子拮抗剂。蛋白酶激活受体-I(PARl)是属于G蛋白偶联受体(GCPR)家族的凝血酶受体。 PARI在多种组织中表达，例如，内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、神经元和人血小板。其 涉及与止血、增殖和组织损伤有关的细胞应答。凝血酶介导的经由PARI的血小板凝聚刺激 是血管中血块形成和伤口愈合的重要步骤。凝血酶通过蛋白水解移去PARI的细胞外N-末 端结构域和暴露新的PARI N-末端来激活PARI。然后新的PARI N-末端的头几个氨基酸 (SFLLRN ；SEQ ID NO 68)作为与该受体另一部分结合的系锁配体(tetheredligand)作用， 通过结合的G-蛋白起始信号传导。PARI也可以由参与血液凝固的其它丝氨酸蛋白酶激活。PARI介导的信号传导活动的调节有若干治疗应用。抑制PARI有助于治疗 血栓形成和血管增生的病症以及抑制癌症进展。见，例如，Darmoul等人，Mol Cancer Res (2004) 2 (9) :514_22 和 Salah 等人，Mol Cancer Res (2007) 5 (3) :229_40。包括拮抗剂 抗体或抗原结合分子的PARI抑制剂在由PARI细胞内信号传导介导的多种疾病的治疗中是 有用的。例如，人们发现包括拮抗剂抗体或抗原结合分子的PARI抑制剂在预防或抑制慢性 肠炎(包括炎性肠病(IBD)、肠激惹综合症(IBS)和溃疡性结肠炎)和纤维变性病(包括肝 纤维化和肺纤维化)中的用途。见，例如，Vergnolle等人，J ClinInvest (2004) 114(10) 1444 ;Yoshida 等人，Aliment Pharmacol Ther (2006)24 (Suppl 4) :249 ;Mercer 等 A, Ann NY Acad Sci(2007) 1096 86-88 ；Sokolova 禾口 Reiser，Pharmacol Ther(2007) PMID:17532472。人们还发现包括拮抗剂抗体或抗原结合分子的PARI抑制剂在预防 或抑制局部缺血再灌注损伤(包括心肌、肾、大脑和肠的局部缺血再灌注损伤)中有 用。见，例如，Strande 等人，Basic Res. Cardiol (2007) 102 (4) :350_8 ;Sevastos 等人， Blood (2007) 109(2) :577_583 Junge 等人，Proc Natl AcadSci USA. (2003) 100(22) 13019-24 和 Tsuboi 等人，Am J PhysiolGastrointest Liver Physiol (2007)292(2) G678-83。抑制PARI细胞内信号传导也可以被用于抑制单纯疱疹病毒(HSV1和HSV2)对细 胞的感染。见，Sutherland 等人，J Thromb Haemost (2007) 5 (5) :1055_61。发明概述本发明提供针对蛋白酶激活受体-I(PARl)的改良的拮抗剂抗体和其使用的方法。因此，在一方面，本发明提供结合蛋白酶激活受体-I(PARl)的抗体。在一些实施 方案中，该抗体包含(a)重链可变区，包含人重链V-区段、重链互补决定区3(⑶R3)、和重链构架区4 (FR4)，和(b)轻链可变区，包含人轻链V区段、轻链⑶R3、和轻链FR4，其中i)重链CDR3包含氨基酸序列DDX1X2SX3WX4FDV,其中X1是G或I，X2是P或Y，X3是 H、L、P、Μ、E、W、T、S、Q 或 A, X4 是 Y 或 F (SEQID NO 10)；ii)轻链CDR3可变区包含氨基酸序列FQGX5X6VPFT,其中&是5、04或￥46是!1、 R、T、S 或 K(SEQ ID NO 20)；其中该抗体是PARI拮抗剂。在相关方面，本发明提供特异性结合PARI的抗体。在一些实施方案中，该抗体包 含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区和轻链可变区各自包含下列三个互补决定区 (CDR) :CDR1、CDR2 和 CDR3 ；其中i)重链可变区的 CDRl 包含选自 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4 和 SEQ IDNO 5 的氨
基酸序列；ii)重链可变区的 CDR 2 包含选自 SEQ ID NO :7、SEQ ID NO 8 和 SEQID NO 9 的
氨基酸序列；iii)重链可变区的 CDR 3 包含选自 SEQ ID NO =IUSEQ ID NO: 12 禾口 SEQ ID NO: 13的氨基酸序列；iv)轻链可变区的CDRl包含选自SEQ ID NO 15和SEQ ID NO 16的氨基酸序列；ν)轻链可变区的CDR 2包含选自SEQ ID NO 18和SEQ ID NO 19的氨基酸序列；vi)轻链可变区的CDR 3包含选自SEQ ID NO 22和SEQ ID NO 23的氨基酸序列。 在一些实施方案中，抗体是PARI拮抗剂。在一个实施方案中，重链V-区段与SEQ ID NO :41共有至少90%的序列同一性， 轻链V区段与SEQ ID NO 46共有至少90%的序列同一性。在一个实施方案中，重链V-区段与选自SEQ ID NO 42、SEQ ID NO 43、SEQ ID NO: 44和SEQ ID NO :45的氨基酸共有至少90%的序列同一性，轻链V-区段与选自SEQ ID NO: 47,SEQ ID NO 48,SEQ ID NO 49和SEQ ID NO :50的氨基酸共有至少90%的序列同一性。在抗体的一个实施方案中i)重链 CDR3 包含选自 SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12 和 SEQ ID NO 13 的氨基酸 序列；和ii)轻链CDR3包含选自SEQ ID NO 22和SEQ ID NO 23的氨基酸序列。在一些实施方案中，重链FR4是人种系FR4。在一些实施方案中，重链FR4是人种 系JH6 (WGQGTTVTVSS ；SEQ ID NO 32)。在一些实施方案中，重链J-区段包含人种系JH6部 分序歹Ij DVffGQGTTVTVSS (SEQ ID NO 66)。在一些实施方案中，轻链FR4是人种系FR4。在一些实施方案中，轻链FR4是人种 系Jk2(reQGTKLEIK ;SEQ ID NO :40)。在一些实施方案中，轻链J-区段包含人种系Jk2部 分序列 TFGQGTKLEIK(SEQ ID NO :67)。在一些实施方案中，重链V-区段和轻链V-区段各自包含互补决定区I(OTRl)和 互补决定区2(⑶R2)；其中i)重链V-区段的⑶Rl包含SEQ ID NO 2的氨基酸序列；ii)重链V-区段的⑶R2包含SEQ ID NO 6的氨基酸序列；
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iii)轻链V-区段的CDRl包含SEQ ID NO 14的氨基酸序列；禾口iv)轻链V-区段的⑶R2包含SEQ ID NO 17的氨基酸序列。在抗体的一些实施方案中i)重链 V-区段的 CDRl 包含 SEQ ID NO 4 ；ii)重链 V-区段的 CDR2 包含 SEQ ID NO 8 ；iii)重链 CDR3 包含 SEQ ID NO 11 ；iv)轻链 V-区段的 CDRl 包含 SEQ ID NO 16 ；ν)轻链 V-区段的 CDR2 包含 SEQ ID NO 19 ；禾口ν i)轻链 CDR3 包含 SEQ ID NO :22。在抗体的一些实施方案中i)重链 V-区段的 CDRl 包含 SEQ ID NO 4 ；ii)重链 V-区段的 CDR2 包含 SEQ ID NO 8 ；iii)重链 CDR3 包含 SEQ ID NO 12 ；iv)轻链 V-区段的 CDRl 包含 SEQ ID NO 16 ；ν)轻链 V-区段的 CDR2 包含 SEQ ID NO 19 ；禾口vi)轻链 CDR3 包含 SEQ ID NO :23。在抗体的一些实施方案中i)重链 V-区段的 CDRl 包含 SEQ ID NO 5 ；ii)重链 V-区段的 CDR2 包含 SEQ ID NO 9 ；iii)重链 CDR3 包含 SEQ ID NO 13 ；iv)轻链 V-区段的 CDRl 包含 SEQ ID NO 16 ；ν)轻链 V-区段的 CDR2 包含 SEQ ID NO 19 ；禾口vi)轻链 CDR3 包含 SEQ ID NO :23。在一些实施方案中，重链可变区与SEQ ID NO :51的可变区共有至少90%的氨基 酸序列同一性，轻链可变区与SEQ ID NO 55的可变区共有至少90%的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，重链可变区与选自SEQ ID NO 52、SEQ ID NO 53和SEQ ID NO 54的可变区共有至少90%、93%、95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸序列同一性， 轻链可变区与选自SEQ ID NO 57,SEQ ID N0:58和SEQ ID NO :59的可变区共有至少90%、 93%、95%、96%、97%、98%或99%的，和轻链可变区与序列同一性。在一些实施方案中，重链可变区包含选自SEQ ID NO :52、SEQ ID N0:53和SEQ ID NO 54的氨基酸序列，轻链可变区包含选自SEQ ID NO :57、SEQID NO 58和SEQ ID NO 59 的氨基酸序列。在一些实施方案中，该抗体以少于1 X 10_8M的平衡解离常数(KD)结合于PARI。在一些实施方案中，该抗体是FAb’片段。在一些实施方案中，该抗体是IgG。在一 些实施方案中，该抗体是单链抗体(scFv)。在一些实施方案中，该抗体包含人恒定区。在一些实施方案中，该抗体包含包括SEQ ID NO 52的重链和包括SEQID NO 57的 轻链。在一些实施方案中，该抗体包含包括SEQ ID NO :53的重链和包括SEQID N0:58的 轻链。
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在一些实施方案中，该抗体包含包括SEQ ID NO :54的重链和包括SEQID N0:59的 轻链。在另一方面，本发明提供包含本发明的抗体的可药用组合物。实施方案如本文所 述。在另一方面，本发明提供改善通过PARI的细胞内信号传导介导的疾病症状的方 法，包括向有需要的受试者施用本发明的拮抗剂抗体。抗体的实施方案如这里所述。在方法的一些实施方案中，由通过PARI的异常细胞内信号传导介导的疾病是慢 性肠炎。在方法的一些实施方案中，由通过PARI的异常细胞内信号传导介导的疾病是纤 维变性病。在方法的一些实施方案中，由通过PARI的异常细胞内信号传导介导的疾病是过 表达PARI的癌症。在方法的一些实施方案中，由通过PARI的异常细胞内信号传导介导的疾病是局 部缺血再灌注损伤。定义“抗体”指免疫球蛋白家族的多肽或包含能够非共价的、可逆的并以特异性方式结 合相应抗原的免疫球蛋白片段的多肽。示例性的抗体结构单元包含四聚体。每个四聚体是 由两个相同的多肽链对组成，每对具有一条“轻链”(约25kD)和一条“重链”(约50-70kD)， 通过二硫键相连。公认的免疫球蛋白基因包括K、λ、α、Υ、δ、ε和μ恒定区基因，以 及无数的免疫球蛋白可变区基因。轻链分类为κ或λ。重链分类为Y、μ、α、δ或ε， 其依次定义免疫球蛋白类别，分别为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。各个链的N-末端定义主 要负责抗原识别的约100至110个或更多氨基酸的可变区。术语可变轻链和可变重 链(Vh)分别指轻链和重链这些区域。如在本申请中使用的，“抗体”包括具有特异地对例如 PARI的特定结合性的抗体和其片段的全部变体。因此，在这一概念范围之内的是全长的抗 体、嵌合抗体、单链抗体(ScFv)、Fab、Fab’和具有相同结合特异性的这些片段的多聚体的版 本(例如，F(ab，)2)。“互补性决定区”或“互补决定区” (“CDR，，)可互换的指Vl和Vh的高变区。CDR 是包含对这类靶标蛋白特异性的该抗体链的靶标蛋白结合位点。在每个人\或Vh中有三 个⑶R(⑶R1-3，从N-末端顺序编号)，构成约15-20%的可变域。⑶R是与靶标蛋白的表位 结构互补，因此结合特异性的直接原因。\或Vh剩下的区段，即所谓的构架区，在氨基酸序 列上显示较少的变异(Kuby，Immunology，第四版，第 4章.W. H. Freeman & Co.，NewYork, 2000)。使用本技术领域多种众所周知的定义，例如Kabat，Chothia，国际ImMunoGeneTics 数据库(IMGT)(互联网址 imgt. cines. fr/)，和AbM(见，例如，Johnson等人，Nucleic Acids Res. ,29 205-206(2001) ；Chothia 和 Lesk, J. Mol.Biol.，196 :901_917(1987) ；Chothia 等人，Nature, 342 :877_883 (1989) ；Chothia 等人，J. Mol. Biol.，227 :799_817 (1992)； Al-Lazikani 等人，J. Mol. Biol.，273 :927_748 (1997))确定 CDR 和构架区的位置。抗原结 合位点的定义也在以下文献中描述Ruiz等人，Nucleic Acids Res. ,28 =219221(2000)； 和 Lefranc，Μ. P.，NucleicAcids Res. ,29 207-209 (2001) ；MacCallum 等人，J. Mol. Biol.，262 732-745(1996)；和 Martin 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86 9268 9272(1989)； Martin 等人，Methods Enzymol. ,203 121153 (1991)；和 Rees 等人，In Sternberg Μ.J.Ε. (ed.), Protein StructurePrediction, Oxford University Press, Oxford,141 172(1996)。术语“结合特异性决定簇”或“BSD”可交换的指确定抗体结合特异性所需的、互补 决定区之内的最小的连续或非连续的氨基酸序列。最小结合特异性决定簇可以在一个或多 个CDR序列中。在一些实施方案中，最小结合特异性决定簇位于抗体重链和轻链的CDR3序 列的部分或全长之内(即，由其单独的决定)。这里使用的“抗体轻链”或“抗体重链”指各自包含\或Vh的多肽。内源性八是 由基因区段V(可变的)和J(连接)编码，内源性Vh由V、D(多样性)和J编码。\或乂11 各自包括CDR以及构架区。在本申请中，抗体轻链和/或抗体重链可以不时的共同被称为 “抗体链”。这些术语包括含有本领域技术人员容易识别的、不破坏\或Vh基本结构的突变 的抗体链。抗体作为完整的免疫球蛋白存在、或作为用不同肽酶消化产生的多个公知特征的 片段存在。因此，例如，胃蛋白酶在铰链区二硫键下消化抗体产生F(ab)’2，即Fab’的二聚 体，其自身是由二硫键连接于Vh-ChI的轻链。F(ab)’ 2可以在温和条件下被还原以打开在 铰链区的二硫键连接，由此将F(ab)，2 二聚体转化为Fab’单体。Fab’单体基本是具有部分 铰链区的Fab。Paul ,Fundamental Immunology第3版(1993)。尽管在完整抗体的消化方 式下定义多种抗体片段，技术人员将理解这类片段可以被化学的或通过使用重组DNA方法 学从头合成。因此，如这里使用的术语“抗体”也包括通过修饰完整抗体产生的抗体片段， 或使用重组DNA方法学从头合成的那些(例如，单链Fv)或使用噬菌体展示文库鉴定的那 些(见，例如，McCafferty 等人，Nature 348 552-554 (1990)) 为了制备单克隆或多克隆抗体，可以使用本领域公知的任何技术(见，例如， Kohler & Milstein， Nature 256 495-497(1975) ；Kozbor φ A, Immunology Today 4 72(1983) ；Cole 等 人，Monoclonal Antibodies andCancer Therapy, pp. 77-96. Alan R. Liss, Inc. 1985)。产生单链抗体的技术(美国专利号4，946，778)可以修改以用于产 生本发明的多肽的抗体。也可以使用转基因小鼠或其它生物体，例如其它哺乳动物，来表 达人化抗体。或者，可以使用噬菌体展示技术鉴定特异性结合于选择的抗原的抗体和异数 (heteromeric)Fab 片段(见，例如，McCafferty 等人，同上；Marks 等人，Biotechnology, 10 :779-783， (1992))。人源化或灵长化非人抗体的方法是本领域众所周知的。通常，人源化的抗体 具有从非人来源引入其的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常涉及通常 来自输入可变区(import variable domain)的输入残基(import residues)。人源 化可以基本按照Winter和其合作者的方法进行(见，例如，Jones等人，Nature 321 522-525(1986) ；Riechmann 等人，Nature 332 :323_327 (1988) ；Verhoeyen 等人，Science 239 1534-1536 (1988)和 Presta，Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593_596 (1992))，通过用啮齿 动物CDR或CDR序列取代人抗体的对应的序列。因此，这类人源化抗体是嵌合抗体(美国 专利号4，816，567)，其中基本上不完整的人可变区被非人物种的对应序列取代。在操作中， 人源化抗体是典型的人抗体，其中一些互补决定区(“CDR”)残基、还可能有一些构架区
9(“FR”)残基被来自啮齿动物抗体的类似位点的残基取代。“嵌合抗体”是这样的抗体分子，其中(a)恒定区或其部分被改变、替换或交换，从 而抗原结合位点(可变区)被连接于不同或改变类型、效应子功能和/或物种的恒定区，或 赋予嵌合抗体新特征的完全不同的分子(例如，酶、毒素、激素、生长因子和药物)，或(b)可 变区或其部分被改变、替代或交换为具有不同或改变的抗原特异性的可变区。术语“可变区”或“V-区”可交换的指包含FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的 重链或轻链。见，

图1。内源性可变区是由免疫球蛋白重链V-D-J基因或轻链V-J基因编 码。V-区可以是天然存在、重组或合成的。如这里使用的，术语“可变区段”或“V-区段”可交换的指包含 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3的可变区的亚序列。见，图1。内源性V-区段是由免疫球蛋白V-基 因编码。V-区段可以是天然存在、重组或合成的。如这里使用的，术语“ J-区段”指包含⑶R3和FR4的C-末端部分的可变区的亚序 列。内源性J-区段由免疫球蛋白J-基因编码。见，图1。J-区段可以是天然存在、重组或 合成的。“人源化”抗体是保留了非人抗体反应性而在人中较少免疫原性的抗体。这可以 例如，通过保留非人CDR区和用其在人中的对应部分代替该抗体的剩余部分而实现。见，例 如，Morrison 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 :6851_6855 (1984) ；Morrison 和 0i，Adv. Immunol.，44 :65-92(1988) ；Verhoeyen 等人，Science，239 1534-1536(1988) ；Padlan, Molec.Immun. ,28 :489_498(1991) ；Padlan, Molec.Immun. ,31(3) 169-217(1994).术语“对应的人种系序列”指这样的核酸序列，与由人种系免疫球蛋白可变区序列 编码的全部其它所评价的可变区氨基酸序列相比较，该核酸序列编码的人可变区氨基酸序 列或亚序列与参考可变区氨基酸序列或亚序列共有最高的测定的氨基酸序列同一性。对 应的人种系序列也可以指这样的人可变区氨基酸序列或亚序列，与全部其它所评价的可变 区氨基酸序列比较，其与参考可变区氨基酸序列或亚序列共有最高的氨基酸序列同一性。 对应的人种系序列可以是仅构架区、仅互补决定区、构架区和互补决定区、可变区段(如 上定义)、或包含可变区的序列或亚序列的其它组合。可以使用这里所述的方法确定序列 同一性，例如，使用BLAST、ALIGN或本领域公知的另一比对算法比对两条序列。对应的人 种系核酸或氨基酸序列可以与参考的可变区核酸或氨基酸序列具有至少约90%、92%、 94%,96%,98%,99%的序列同一性。对应的人种系序列可以例如通过公共可获得的国际 ImMunoGeneTics 数据库(IMGT)(互联网址 imgt. cines. fr/)和 V-base (互联网址 vbase. mrc-cpe. cam. ac. uk)来石角定。短语“特异性(或选择性)结合”，当在描述抗原(例如，蛋白)与抗体或抗体衍 生的结合物质之间相互作用的情况下，指在蛋白质和其它生物的异源群体中由抗原的存在 决定的结合反应。因此，在指定的免疫测定条件下，具有特定结合特异性的抗体或结合物质 以至少两倍于背景结合于特定抗原，且基本不以显著的量结合样品中存在的其它抗原。在 这样条件下特异性结合抗体或结合物质可能需要抗体或物质已针对特定蛋白质的特异性 经过选择。可以通过除去与例如，来自其它物种(例如，小鼠)的PARI分子或其它PAR亚 型(例如，PAR2、PAR3、PAR4)交叉反应的抗体而实现选择。可以使用多种免疫测定形式来 选择与特定蛋白质有特异性免疫反应的抗体。例如，可以常规的使用固相ELISA免疫测定
10来选择与蛋白质有特异性免疫反应的抗体(见，例如，Harlow & Lane，Using Antibodies, ALaboratory Manual (1998)，描述可以用于测定特异免疫反应性的免疫形式和条件)。通 常特异性或选择性的结合反应将产生高于背景至少两倍的信号，更通常的高于背景至少10 至100倍的信号。术语“平衡解离常数(Kd，M) ”指解离速率常数(kd，时间―1)除以结合速率常数(ka， 时间—SM—1)。可以使用本领域任何公知的方法测量平衡解离常数。本发明的抗体通常具有 少于约1(Γ8Μ，例如，少于约ICT9M或ΙΟ,Μ，在一些实施方案中少于约Kr11MUiT12M或ICT13M 的平衡解离常数。如这里使用的，术语“抗原结合区”指负责在分子和PARI之间特异性结合的本发 明的PARI-结合分子的结构域。抗原结合区包括至少一个抗体重链可变区和至少一个抗体 轻链可变区。在本发明的各个PARI-结合分子中存在至少一个这类抗原结合区，各个抗原 结合区可以彼此相同或不同。在一些实施方案中，本发明的PARI-结合分子的至少一个抗 原结合区作为PARI的拮抗剂作用。如这里使用的，术语“拮抗剂”指能够特异性结合和抑制通过受体的信号传导来完 全阻断或可检测的抑制由受体介导的应答的物质。例如，PARI的拮抗剂特异性结合于受体 并全部或部分抑制PARI-介导的信号传导。在一些情况下，可以通过其结合PARI的能力、 抑制继来自PARI的细胞内信号传导之后的凝血酶诱导的钙流出或凝血酶诱导的IL-8产 生(例如，在FlipR测定中测量或通过ELISA测量)来鉴定PARI拮抗剂。另外的测定由 Kawabata 等人，J Pharmacol Exp Ther. (1999)288(1) =35S-7O 描述。当与来自未暴露于拮 抗剂的对照PARI的细胞内信号传导相比，来自暴露于本发明拮抗剂的PARI细胞内信号传 导(例如通过钙流量或IL-8产生来测量)至少减少约10%，例如，至少减少约25%、50%、 75%，或完全被抑制时，抑制发生。对照PARI可以暴露于非抗体或抗原结合分子、特异性结 合另一抗原的抗体或抗原结合分子、或已知不作为拮抗剂起作用的抗-PARI抗体或抗原结 合分子。“抗体拮抗剂”指其中该拮抗剂是抑制性抗体的情况。术语“蛋白酶激活的受体-1”、“蛋白水解酶激活的受体-1”或“PARI”可交换 的指由凝血酶切割激活藉此暴露N-末端系锁配体的G蛋白偶联受体。PARI也称为“凝 血酶受体”和“凝结因子II受体前体”。见，例如，Vu等人，Cell (1991) 64(6) 1057-68 ； Coughlin 等人，J Clin Invest (1992) 89 (2) :351_55 ；和基因文库(GenBank)登录号 NM_001992。系锁配体与PARI的细胞外结构域的分子内结合引起细胞内信号传导和钙流 出。见，例如，Traynelis 和 Trejo，Curr Opin Hematol (2007) 14(3) :230_5 ；和 Hollenberg 等人，Can J Physiol Pharmacol. (1997)75(7) :832_41。PARI 的核苷酸和氨基酸序列是 本领域公知的。见，例如，Vu 等人，Cell (1991)64(6) :1057_68 ;Coughlin 等人，J Clin Invest (1992) 89 (2) :351_55 ；和基因库登录号NM_001992。人PARI核酸序列被公布为基因 文库登录号NM_001992(又见，M62424. 1和gi4503636)。人PARI的氨基酸序列被公布为 NP_001983和AAA36743。如这里使用的，PARI多肽是功能上的G蛋白偶联受体，由凝血酶 激活，结合N-末端系锁配体时引起细胞内信号传导和钙流出。结构上，PARI氨基酸序列与 基因文库登录号NP_001983、AAA36743或M62424. 1的氨基酸共有至少约90%、91 %、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性。结构上，PARI核酸序列与 基因文库登录号NM_001992或M62424. 1的氨基酸共有至少约90%、91 %、92%、93%、94%、
1195%,96%,97%,98%,99%^； 100% 的序列同一性。术语“核酸”或“多核苷酸”指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸 (RNA)和其聚合物。除非特别限制，术语涵盖含有已知天然核苷酸类似物的核酸，所述天然 核苷酸与参考核酸具有相似的结合特性并与天然存在的核苷酸以相似方式代谢。除非另 外指出，特定的核酸序列无疑也涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基 因、直向同源体(ortholog)、SNP、和互补序列以及明确指出的序列。具体的，可以通过产 生其中一个或多个选择的(或全部)密码子的第三个位置被混合的碱基和/或脱氧肌苷 残基替代的序列获得简并密码子取代(Batzer等人，Nucleic Acid Res. 19 =5081(1991)； Ohtsuka 等人，J. Biol. Chem. 260 :2605_2608 (1985)；和 Rossolini 等人，Mol. Cell. Probes 8 :91-98(1994))。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在这里可以交换的使用，指氨基酸残基的聚合物。 该术语应用于其中一个或多个氨基酸残基是对应天然存在氨基酸的人工化学模拟物的氨 基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。术语“氨基酸”指天然存在的和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸相似方 式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些， 以及后来被修饰的那些氨基酸，例如，羟脯氨酸、Y-羧基谷氨酸和正-磷酸丝氨酸。氨基 酸类似物指与天然存在的氨基酸具有相同基本化学结构的化合物，即，结合于氢的α"碳、 羧基、氨基和R基团，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍(methionine methyl sulfonium)。这些类似物具有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽骨架， 但是保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物指具有与氨基酸的普 通化学结构不同的结构，但是与天然存在的氨基酸以相似方式起作用的化学的化合物。“保守修饰的变体”同时应用于氨基酸和核酸序列。关于特定的核酸序列，保守修 饰的变体指其核酸编码与基本相同的序列相同或基本相同的氨基酸序列或其中该核酸不 编码氨基酸序列的那些。因为遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任何特定的蛋 白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和G⑶全部编码氨基酸丙氨酸。因此，在由密码子指定为 丙氨酸的每个位置，该密码子可以被改变为任意的所述对应密码子而不改变编码的多肽。 这类核酸变体是“沉默变体”，其为保守修饰的变体的一种。这里编码多肽的每个核酸序列 也描述了核酸的各个可能的沉默变体。技术人员应该认识到在核酸中的各个密码子(除了 AUG，其一般为甲硫氨酸的唯一密码子，和TGG，其一般为色氨酸的唯一密码子)可以被修饰 产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的各个沉默变体是在各个所述序列中暗含的。至于氨基酸序列，技术人员应该意识到对核酸、肽、多肽或蛋白质序列的单个的替 代、缺失或加入(其在编码序列中改变、加入或缺失单个的氨基酸或小百分比的氨基酸)是 “保守修饰的变体”，其中该改变的结果是用化学相似的氨基酸替代氨基酸。提供功能相似 氨基酸的保守替代表是本技术领域众所周知的。这样的保守修饰的变体还加上且不排除本 发明的多态变异体、种间同系物和等位基因。下列八组各自含有彼此为保守替代的氨基酸1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸⑶、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
12
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(见，例如，Creighton，Proteins (1984))·“序列同一性的百分数”是通过在比较窗口比较两个最佳比对的序列确定，其中为 进行两条序列的最佳比对，在比较窗口中多核苷酸序列的部分可以与不包含添加或缺失的 参考序列(例如，本发明的多肽)相比包含添加或缺失(即，空位(gap))。通过测定在两个 序列中都存在的相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数得到匹配的位置数，用匹配位置数除 以在比较窗口中的总位置数，将结果乘以100产生序列同一性的百分数来计算百分数。在两个或更多核酸或多肽序列的背景下，术语“同一”或百分比“同一性”指其为 相同序列的两个或更多序列或亚序列。当在比较窗或指定区使用下列序列比对算法之一 或通过人工比对和目测进行比较和比对最大对应时，如果两个序列具有特定百分数的氨基 酸残基或核苷酸相同(即，在特定区域，或当未指明时，在参考序列的整个序列上有70%、 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性)，则两个序列是“基本相 同的”。本发明提供多肽或多核苷酸，其分别与这里举例的多肽或多核苷酸(例如，在SEQ ID NO 2-23任一中举例的OTR)基本相同。任选的，在参考序列的长度至少约15、25或50个 核苷酸的区域，或更优选在长度为100-500或1000或更多的区域，或在全长存在该同一性。 关于氨基酸序列，可以在参考序列的长度为至少5、10、15或20个氨基酸，任选长度为至少 约25、30、35、40、50、75或100个氨基酸，任选在长度为至少约150，200或250个氨基酸，或 在全长的区域存在同一性或基本同一性。对于更短的氨基酸序列，例如，有20个或更少的 氨基酸的氨基酸序列，根据这里定义的保守替换，当一个或两个氨基酸残基是保守替代时， 则存在基本同一性。对于序列比较，通常一个序列作为参考序列，测试序列与其进行比较。当使用序列 比较算法时，测试和参考序列被输入计算机，如果需要，指定亚序列坐标，并选定序列算法 程序参数。可以使用缺省程序参数，或可以指定备选的参数。然后基于程序参数，序列比较 算法计算测试序列相对于参考序列的百分数序列同一性。如这里使用的，“比较窗”包括参考任一数目的连续位置的区段，所述连续位置的 数目选自20至600，通常约50至约200，更通常约100至约150个(其中在两个序列被 最佳比对之后序列可以与相同数目连续位置的参考序列比较)。比对序列用于比较的方 法是本领域众所周知的。可以进行序列的最佳比对来比较，例如，通过Smith和Waterman 的局部同源性算法(1970)Adv. Appl. Math. 2 :482c，通过Needleman和Wunsch的同源性比 对算法(1970) J. Mol. Biol. 48 :443，通过Pearson和Lipman的搜索相似性的方法(1988) Proc. Nat，1. Acad. Sci. USA 85 :2444，通过这些算法(GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA，在 Wisconsin Genetics 软件包，Genetics Computer Group, 575 Science Dr. , Madison, WI) 的计算机化实现，或通过人工比对和目测(见，例如，Ausubel等人，Current Protocolsin Molecular Biology(1995 supplement))。适合确定百分数序列同一性和序列相似性的算法的两个实例是BLAST和BLAST 2. 0 算法，其被分别描述在 Altschul 等人(1977) Nuc. Acids Res. 25 3389-3402 和Altschul等人(1990) J. Mol. Biol. 215 :403_410。执行BLAST分析的软件是通过生物技术 iiM、ffliC4^l> (National Centerfor Biotechnology Information) "SJ&Jfl^il白勺。 算法涉及首先通过在查询序列中鉴定短字节的长度W鉴定高评分序列对(HSP)，所述短字 节的长度W当与数据库序列中相同长度字节比对时，其匹配或满足一些正评价的阈值评分 Τ。T被称为邻字节评分阈值(Altschul等人，同上)。这些最初邻字节被作为寻找含有其 的更长HSP的最初搜索击中的种子。只要可以增加累计的比对评分，该字节击中被沿着各 个序列的两个方向延伸。对于核苷酸序列，使用参数M(对于一对匹配残基的奖励评分；总 是> 0)和N(对于错配残基的处罚评分；总是< 0)来计算累计评分。对于氨基酸序列，使 用评分矩阵来计算累计评分。当累计比对评分从其最大获得值减少数量X ；由于一个或多 个负评分残基比对的累积，该累计评分到达零或更低；或到达序列的任意端时，在各个方向 的字节击中的延伸被停止。BLAST算法参数W、T和X决定比对的敏感度和速度。BLASTN程 序(用于核苷酸序列)默认使用字长(W)为11，期望(E)为10，M = 5,N = -4和两条链均 进行比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用字长为3，期望(E)为10，BL0SUM62评 分矩阵(见 Henikoff 和 Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA89 10915)比对(B)为 50，期望(E)为10，M = 5，N = -4，比较两条链。BLAST算法也在两个序列之间执行相似性的统计分析(见，例如，Kar 1 in和 Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :5873_5787)。由 BLAST 算法提供的相似性的 一个量度是最小总概率(P(N))，其通过在两个核苷酸或氨基酸序列之间可能偶然发生的匹 配提供概率的指示。例如，如果测试核酸与参考核酸的比较中最小总概率小于约0. 2，更优 选小于约0. 01，最优选小于约0. 001，核酸被认为相似于参考序列。两条核酸序列或多肽基本相同的指示是由第一核酸编码的多肽与针对由第二核 酸编码的多肽产生的抗体有免疫交叉反应，如下所述。因此，例如，当两个肽仅保守取代不 同时，多肽与第二多肽通常是基本相同的。两条核酸序列基本相同的另一指示是，如下所 述，在严格条件下两个分子或其互补链彼此杂交。而两条核酸序列基本相同的另一指示是 可以使用相同的引物扩增该序列。当被使用在描述抗原结合区如何被连接在本发明的PARI-结合分子内时，术语 “连接”涵盖物理结合该区域的全部可能的方式。多数抗原结合区通常由化学键，例如共价 建(例如，肽键或二硫键)或非共价键连接，其可以是直接的结合(即，在两个抗原结合区 之间没有接头)或间接的结合(即，在两个或多个抗原结合区之间具有至少一个接头分子 的辅助)。术语“治疗可接受的量”指足以作用产生期望结果的量(即，靶标细胞的凋亡)。 优选的，治疗可接受的量不产生不期望的副作用。可以通过先施用低剂量，然后渐增地增加 剂量直至获得期望效果来确定治疗可接受的量。附图简述图1说明包含抗体V-区的结构单元的示意图。重链是由三个基因家族(重_V、D 和J)编码，轻链是由两个基因家族(κ或λ的V和J)编码。这些基因的重组产生完整的 V区。⑶R3序列在重链情况下位于重V、D和J基因的重组位点，在轻链情况下在κ或λ 的V和J基因的重组位点。图2说明用人氨基酸序列替代参考抗体氨基酸序列的示意图。
图3说明与对应的人种系可变区(例如，Vhl-46(SEQ ID NO :42和32) ;VKII A3 (SEQ ID NO 56))比较，本发明的改良的可变区氨基酸序列(重链V-区，SEQ ID NO :52、 53和54 ；轻链V-区，SEQ ID NO :57、58和59)的比对。互补决定区(CDR)是有下划线的。 粗体碱基表示与人种系的差异和斜体残基表示在CDR3中的改变。图4说明在ELISA测定中本发明的改良的抗体的高度结合特异性。改良的抗-PARI 抗体结合于PARI，但是不结合于密切相关的蛋白质人PAR2或小鼠PARI或小鼠PAR2。指示 的抗体克隆被以1 μ g/ml的浓度加入。图5说明改良的抗体与短尾猴(Cynom0Igus)PARl具有反应活性。在短尾猴(Cyno) 和人抗体结合表位的序列是相同的(SFLLRNPNDKYEPFWEDEEKNESGLTE ;SEQ ID NO :1)。图6A-C说明改良的抗-PARI抗体以剂量依赖的方式抑制凝血酶介导的PARI的激活。图7说明对本发明的三个改良拮抗剂PARI抗体的比较。发明详述碰本发明的抗体特异性结合蛋白酶激活的受体-I(PARl)。在这样做时，抗体可以阻 断天然配体(例如，凝血酶)的结合，作为拮抗剂作用或作为激动剂作用。在一些实施方案 中，本发明的抗-PARI抗体作为PARI受体的拮抗剂作用。PARI抗体拮抗剂是特异性结合 PARI、并抑制或减少PARI-介导的细胞内信号传导的抗体。抗-PARI抗体任选的可以是多 聚化的，根据本发明的方法使用。抗-PARI抗体可以是全长的四聚体抗体(S卩，具有两个轻 链和两个重链)、单链抗体(例如，ScFv)、或包含形成一个或多个抗原结合位点和赋予PARI 结合特异性的抗体片段(例如包含重链和轻链可变区(例如，Fab'或其它相似片段))的 分子。可以通过本领域公知的任何方式产生抗-PARI抗体片段，包括但不限于，抗体四 聚体的重组表达、化学合成和酶消化，而可以通过，例如，杂交瘤或重组生产获得全长的单 克隆抗体。重组表达可以是来自本领域公知的任何合适的宿主细胞，例如，哺乳动物宿主细 胞、细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞等。当存在时，抗-PARI抗体的恒定区可以 是适当的任意类型或亚型，可以是选择来自通过当前方法处理的受试物种(例如，人、非人 灵长类或其它哺乳动物，例如，农业哺乳动物(例如，马、绵羊、牛、猪、骆驼(camelid))、家 养哺乳动物(例如，犬、猫)或啮齿类(例如，大鼠、小鼠、仓鼠、兔子)。本发明的抗-PARI抗体或抗原结合分子也包括具有骆驼支架的单结构域抗原结 合单元。骆驼家族的动物包括骆驼、骆马(llama)和羊驼。骆驼产生缺乏轻链的功能抗 体。重链可变(VH)结构域自主折叠，作为抗原结合单元独立的作用。与经典抗原结合分 子(Fab)或单链可变片段(scFv)中的六个CDR相比，其结合表面包括仅三个CDR。骆驼抗 体能够获得与那些传统抗体可相比的结合亲和力。可以使用本领域众所周知的方法，例如， Dumoulin ^A, Nature Struct. Biol. 11 500 515,2002 ；Ghahroudi 等)κ, FEBS Letters 414:521 526，1997 ；和 Bond 等人，J Mol Biol. 332 :643_55，2003，产生具有这里举例的小 鼠抗-PARI抗体的结合专一性的基于骆驼支架的抗-PARI分子。a.抗-PARI抗体可变区本发明的抗-PARI抗体的可变区衍生自已知以高亲和力结合PARI的参考单克隆
15抗体，并作为拮抗剂作用。通过减少对应于非人物种(例如，小鼠)的氨基酸序列区段和增 加对应于人种系氨基酸序列的氨基酸序列区段来改良或优化抗体。以这一方式，能够在人 宿主中诱导针对抗-PARI抗体的免疫应答的可能序列被减少、最小化或消除。已经描述了 基因工程设计人抗体的方法。见，例如，美国专利公开号2005/0255552和美国专利公开号 2006/0134098，其二者的公开在此以其整体作为参考被并入用于全部目的。本发明的改良的抗-PARI抗体是基因工程设计的人抗体，其具有的V-区序列与 人种系V-区序列有基本的氨基酸序列同一性，而保留了参考抗体的特异性和亲和力。见， 美国专利公开号2005/0255552和美国专利公开号2006/0134098。该改良操作鉴定了为 确定来自参考抗体可变区的抗原结合特异性所需的最小序列信息，并转移该信息至人部 分V-区基因序列的文库以产生人抗体V-区的表位集中的文库。可以使用基于微生物的 分泌系统表达文库成员如抗体Fab’片段，并例如使用菌落转移结合测定法(colony-lift binding assay)筛选文库的抗原结合Fab，。见，例如，美国专利公开号2007/0020685。阳 性克隆可以进一步表征以鉴定具有最高亲和力的那些。产生的基因工程设计的人Fab’保 留了亲本(参考抗-PARI抗体)的结合特异性，通常具有与亲本抗体相比相当的或更高的 对抗原的亲和力，并具有与人种系抗体V-区相比具有高度序列同一性的V-区。为产生表位集中的文库所需的最小结合特异性决定簇(BSD)通常是由重链⑶R3 中的序列(“CDRH3，，)和轻链CDR3中的序列(“CDRL3，，)呈现。BSD可以包含⑶R3的部分 或全长。BSD可以由连续的或非连续的氨基酸残基组成。在一些情况下，从人V-区段序列 构建表位集中的文库，所述人V-区段序列连接于来自含有BSD和人种系J-区段序列的参 考抗体的独特⑶R3-FR4区(见，图1和美国专利公开号2005/0255552)。或者，可以通过相 继的表达盒替代产生人V-区段文库，其中仅部分的参考抗体V-区段一开始被人序列文库 替代。在残留的参考抗体氨基酸序列的情况下支持结合的鉴定的人“表达盒”接着在第二 次文库筛选中被重组以产生全人V-区段(见，美国专利公开号2006/0134098).在各个情况下，使用含有来自参考抗体特异性决定簇的成对重链和轻链CDR3区 段、CDR3-FR4区段或J-区段来限制结合特异性，从而从文库获得的抗原结合子保留了参考 抗体的表位特异性。在文库构建期间在各个链的CDR3区中可以引入额外的成熟改变以鉴 定具有最佳结合动力学的抗体。产生的基因工程设计的人抗体具有衍生自人种系文库的 V-区段序列，保留了来自CDR3区内的短BSD序列并具有人种系骨架4(FR4)区。因此，在一些实施方案中，抗-PARI抗体含有衍生自原始单克隆抗体的重链和轻 链的CDR3之中的最小结合序列决定簇(BSD)。重链和轻链可变区的保留序列(CDR和FR)， 例如，V-区段和J-区段，是来自对应的人种系氨基酸序列。V-区段可以选自人V-区段文 库。可以通过亲和力成熟实现进一步的序列改进。在另一实施方案中，抗-PARI抗体的重链和轻链含有来自对应的人种系序列的人 V-区段(FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3)，例如，选自人V-区段文库，和来自原始单克隆抗体的 CDR3-FR4序列区段。可以通过用相应的人种系序列替代序列区段和/或通过亲和力成熟进 一步改进⑶R3-FR4序列区段。例如，在BSD周围的FR4和/或⑶R3序列可以用对应人种 系序列替代，而来自原始单克隆抗体CDR3的BSD被保留。在一些实施方案中，重链V-区段的对应人种系序列是Vhl-46。在一些实施 方案中，重链J-区段的人种系序列是JH6。在一些实施方案中，重链J-区段包含人种系JH6部分序列DVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO :66)。来自人种系JH6的全长J-区段是 YYYYYGMDVffGQGTTVTVSS0可变区基因参考免疫球蛋白可变区基因标准命名法提及。当前 免疫球蛋白基因信息可以通过互联网获得，例如，在ImMunoGeneTicsaMGT)、V-base和 PubMed 数据库，又见，Lefranc，Exp Clin Immunogenet. 2001 ； 18 (2) 100-16 ；Lefranc, Exp Clin Immunogenet. 2001 ； 18(3) 161-74 ；Exp Clin Immunogenet. 2001 ； 18 (4) :242_54 ；禾口 Giudicelli 等人，Nucleic Acids Res. 2005 Janl ；33 (Database issue) :D256_61。在一些实施方案中，轻链V-区段的对应人种系序列是VKII A3。在一些实施方案 中，轻链J-区段的对应人种系序列是Jk2。在一些实施方案中，轻链J-区段包含人种系Jk2 部分序列IFGQGTKLEIK。来自人种系Jk2的全长J-区段是YIFGQGTKLEIK。在一些实施方案中，重链V-区段与氨基酸序列(Q/E) VQLVQSGAEVKKPG (A/ S)SVKVSCK (A/V)SG (Y/G)TF (N/S) (N/S)Y (Y/V) (M/F) (N/H)WVRQAPGQGLEffMG (V/I)I(N/ D)P(S/H)GG(R/S)T(R/S)Y(A/N)QKFKGRVTMT(T/R)DTSTST(V/A)YMELSSL(R/T)S(D/E) DTAVYYCAR(SEQ ID NO 41)共有至少 90%、93%、95%、96%、97%、98%、99%或 100%的序 列同一性。在一些实施方案中，轻链V-区段与氨基酸序列DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQ SLLH(R/S)NG(Y/N)NYL(D/E)WYLQKPGQSPQLLIY(K/L)(G/I)SNR(A/F)SGVPDRFSGSGSGTDFTLKI SRVEAEDVGVYYC(SEQ IDNO 46)共有至少 90%,93%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 的序列同一性。在一些实施方案中，重链V-区段与选自以下的氨基酸序列共有至少90 %、93 %、 95 %、96 %、97 %、98 %、99 % 或 100 % 的序列同一性QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFNSY YMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR(SEQ ID NO 42)、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFNSYYMNWVRQAPGQGLEWMGVIDPHGGRTRYNQKFKGRVTMTTD TSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR(SEQ ID NO 43), QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFNSYYMNWV RQAPGQGLEWMGVIDPHGGRTRYNQKFKGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLTSDDTAVYYCAR(SEQ ID NO 44)和 EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKVSGGTFSNYVFNWVRQAPGQGLEWMGVINPHSGRTRYNQKFKGRVTMTTDTSTS TAYMELRSLTSDDTAVYYCAR(SEQ ID NO :45)。在一些实施方案中，轻链V-区段与选自以下的氨基酸序列共有至少90 %、93 %、 95 %、96 %、97 %、98 %、99 % 或 100 % 的序列同一性DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHS NGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC(SEQ ID NO :47)、D IVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHRNGNNYLEWYLQKPGQSPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTL KISRVEAEDVGVYYC(SEQ ID NO :48)、DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHRNGNNYLEWYLQKPGQ SPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC(SEQ ID NO 49)和 DIVMTQSPLSLPVT PGEPASISCRSSQSLLHRNGNNYLEWYLQKPGQSPRLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVY YC(SEQ ID NO 50)。在一些实施方案中i)重链CDR3包含氨基酸序列基序DDX1X2SX3WX4FDV,其中X1是6或I，X2是？或Y， X3 是 H、L、P、Μ、E、W、T、S、Q 或 A，X4 是 Y 或 F (SEQID NO 10)，ii)轻链CDR3包含氨基酸序列基序FQGX5X6VPFT,其中X5是S、D、A或V，X6是H、 R、T、S 或 K(SEQ ID NO 20)。在一些实施方案中
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i)重链⑶R3包含氨基酸序列，所述氨基酸序列选自DDGPSMWYFDV(SEQ ID NO: 11),DDGPSLffYFDV(SEQ ID NO 12)和 DDGPSHWYFDV(SEQ IDNO 13)；禾口ii)轻链CDR3包含氨基酸序列，所述氨基酸序列选自MQALQTP (SEQ ID NO 21)、 FQGSSVPFT(SEQ ID NO 22)和 FQGSHVPFT(SEQ ID NO :23)。在一些实施方案中，本发明的抗体包含的重链可变区包含含有氨基酸序列S/N) Y(Y/V) (M/F) (N/H) (SEQ ID NO 2)的 CDRl ；含有氨基酸序列(I/V) I (N/D) P (S/H) (S/G)G(R/ S) T (R/S) Y (A/N) QKF (K/Q) G (SEQ ID NO 6)的 CDR2 ；和含有氨基酸序列 DDX1X2SX3WX4FDV 的 CDR3，其中 X1 是 G 或 I，X2 是 P 或 Y，X3 是 H、L、P、Μ、E、W、T、S、Q 或 A，X4 是 Y 或 F(SEQ ID NO 10)。在一些实施方案中，本发明的抗体包含的轻链可变区包含含有氨基酸序列 RSSQSLLH(R/S)NG(Y/N)NYL(D/E) (SEQ ID NO 14)的 CDRl ；含有氨基酸序列(L/K) (G/I) SNR(A/F)S(SEQ ID NO 17)的 CDR2 ；和含有氨基酸序列 FQGX5X6VPFT 的 CDR3，其中 X5 是 S、 D、A 或 V，X6 是 H、R、T、S 或 K(SEQID NO :20)。在一些实施方案中，重链可变区包含含有氨基酸序列(E/Q)VQLVQSGAEVKKPG(S/ A) SVKVSCK (V/A) SG (G/Y) TF (S/N) (SEQ ID NO : 24)的 FRl ；含有氨基酸序列 WVRQAPGQGLEWMG (SEQ ID NO 27)的 FR2 ；含有氨基酸序列 RVTMT (R/T) DTSTST (V/A) YMEL (S/ R) SL (R/T) S (E/D) DTAVYYCAR (SEQ ID NO 28)的 FR3 ；和含有氨基酸序列 WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO 32)的FR4。鉴定的氨基酸序列可以具有一个或多个取代的氨基酸(例如，来自亲和 力成熟)或一个或两个保守取代的氨基酸。在一些实施方案中，轻链可变区包含含有氨基酸序列 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISC(SEQ ID NO 33)的 FRl ；含有氨基酸序列 WYLQKPGQSP(Q/R)LLIY(SEQ ID NO 34)的 FR2 ；含有氨基酸序列 GVPDRFSGSG(S/A) GTDFTLKISRVEAEDVGVYYC(SEQ ID NO :37)的 FR3 ；和含有氨基酸序列 FGQGTKLEIK(SEQ ID NO 40)的FR4。鉴定的氨基酸序列可以具有一个或多个取代的氨基酸(例如，来自亲和力 成熟)或一个或两个保守取代的氨基酸。在全长范围，本发明的抗-PARI抗体的可变区通常具有总的可变区(例如， FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4)与对应人种系可变区氨基酸序列共有至少约90%，例 如，至少约 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或 100%氨基酸序列同一 性。例如，抗-PARI抗体的重链与人种系可变区Vhl-46/JH6共有至少约91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的氨基酸序列同一性。抗-PARI抗体的轻链与人 种系可变区 VKIIA3/Jk2 共有至少约 91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100%氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，本发明的抗-PARI抗体包含具有与SEQ ID NO :51的重链可 变区至少有 90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100%氨基酸序列 同一性的重链可变区，和包含具有与SEQ ID NO :55的轻链可变区至少90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%氨基酸序列同一性的轻链可变区。在一些实施方案中，本发明的抗-PARI抗体包含重链可变区，其与选自SEQ ID NOS :52、53 和 54 的重链可变区具有至少 90 % ,91 % ,92 % ,93 % ,94 % ,95 % ,96 % ,97 %, 98%、99%或100%氨基酸序列同一性，并包含轻链可变区，其与选自SEQ ID NOS =56,57,58和 59 的轻链可变区具有至少 90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100%氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，本发明的抗-PARI抗体包含与SEQ ID NO :52的重链可变区具 有至少 90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100%氨基酸序列同一 性的重链可变区，并包含与SEQ ID N0:57(即，克隆LDW653)的轻链可变区具有至少90%、 91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,100% 氨基酸序列同一性的轻链可变区。在一些实施方案中，本发明的抗-PARI抗体包含与SEQ ID NO :53的重链可变区具 有至少 90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100%氨基酸序列同一 性的重链可变区，和包含与SEQ ID N0:58(S卩，克隆LDS 900)的轻链可变区具有至少90%、 91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,100% 氨基酸序列同一性的轻链可变区。在一些实施方案中，本发明的抗-PARI抗体包含与SEQ ID NO :54的重链可变区具 有至少 90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100%氨基酸序列同一 性的重链可变区，和包含与SEQ ID N0:59(S卩，克隆LDS 896)的轻链可变区具有至少90%、 91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,100% 氨基酸序列同一性的轻链可变区。为了长度小于20个氨基酸的鉴定的氨基酸序列，可以容忍一个或两个保守氨基 酸残基取代，而仍然保留期望的特异性结合和/或拮抗剂活性。本发明的抗-PARI抗体通常以小于约ICT8M或ΙΟΙ，例如，小于约ΙΟ,Μ或IiT11M, 在一些实施方案中小于约10_12Μ或10_13Μ的平衡解离常数(Kd)结合PARI。b. PARI抗体拮抗剂和筛选方法可以根据本发明的方法使用任何类型的抗-PARI抗体拮抗剂。通常，使用的抗体 是单克隆抗体，其可以通过本领域公知的任一方法(例如，杂交瘤和重组表达)产生。在 一些实施方案中，使用包含重链和轻链可变区的抗体片段而不是全长抗体来构建本发明的 PARI-结合分子。在一些实施方案中，PARI-结合分子的抗原结合区是单链抗体(ScFv)。产生ScFv 和抗体的有用的技术是本领域公知的，描述在例如，美国专利号4，946，778和5，258，498 ； Huston ^A, Methods in Enzymology203 46-88(1991) ；Shu ^A, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7995-7999(1993)；和 Skerra 等人，Science 240:1038-1040(1988)。可以使用本领域众所周知的技术鉴定特异性结合于PARI的抗-PARI抗体，例如， ELISA、表面等离子共振、干涉量度法(例如，使用ForteBio Octet生物传感器系统)。可以 通过检测抗体抑制或减少PARI-介导的事件的能力，例如，在表达PARI的细胞中的钙流出、 凝血酶诱导的IL-8分泌的抑制等，来鉴定PARI抗体拮抗剂。可以使用多种本领域公知的 测定检测对PARI介导的事件的存在和抑制的诱导。可以使用PARI-依赖的钙流出测定筛选功能性PARI拮抗剂抗体。已知凝血酶切 割PARI的N-末端结构域，除去约15个氨基酸。保留的N-末端结构域称为系锁配体，负责 起始PARI介导的信号传导。由凝血酶对PAR-I的这一切割产生细胞中快速和瞬时的钙流 出，其可以使用可商购的试剂(例如，可从Molecular Devices商购)测量。具体的，可以使用表达PARI的细胞，例如，HT-29、HCT-116或DU145细胞，评估抗体在凝血酶处理之后抑 制钙流出的能力。可以使用本领域公知的任何方法测定钙流出。在一个实例中，在FlipR 染料(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)中的细胞用抗体预孵育(例如，约1小时)，用 不同浓度的凝血酶诱导Ca2+流出。在检测PARI拮抗剂活性之前可以使用本领域公知的任 何方法纯化抗体。对照细胞未用抗体预孵育，或用对PARI之外的抗原特异的抗体预孵育， 或用已知不作为拮抗剂作用的抗-PARI抗体预孵育。与在对照细胞中凝血酶-诱导的钙流 出相比，在用本发明的PARI拮抗剂抗体预孵育的细胞中，凝血酶-诱导的钙流出可检测的 被抑制或减少。例如，与对照细胞相比，暴露于PARI拮抗剂抗体的细胞中，凝血酶-诱导的 钙流出减少至少约10 %，例如，至少30 %、50 %或80 %，或完全被抑制。也可以通过测量候选抗-PARI拮抗剂抗体对来自合适靶标细胞(例如，HUVEC)的 凝血酶介导的IL-8分泌的抑制来测定抗体的PARI拮抗剂活性。可以使用本领域任何公知 的方法测量来自靶标细胞的凝血酶-介导的IL-8分泌。在一个实例中，细胞被暴露于凝血 酶过夜，产生分泌进入培养基的IL-8的升高。在检测样品中，在先于凝血酶处理之前约1 小时加入抗体。可以通过ELISA测量培养基中的IL-8。与对照细胞相比，抗-PARI拮抗剂 抗体抑制用凝血酶处理的靶标细胞的IL-8分泌的增加。对照细胞未用抗体预孵育，或用对 PARI之外的抗原特异的抗体预孵育，或用已知不作为拮抗剂作用的抗-PARI抗体预孵育。 与来自对照细胞的凝血酶诱导的IL-8分泌相比，在用本发明的PARI拮抗剂抗体预孵育的 细胞中，凝血酶-诱导的IL-8分泌可检测的被抑制或降低。例如，与对照细胞相比，在暴 露于PARI拮抗剂抗体的细胞中，凝血酶-诱导的IL-8分泌被减少至少约10%，例如，至少 30 %、50 %或80 %，或完全被抑制。c.产牛抗-PARI抗体的多核苷ll、iH本禾Π宿t细朐,本发明提供多核苷酸(DNA或RNA)，其编码的多肽包含以上所述抗-PARI抗体链或 抗原结合分子的区段或结构域。在一些实施方案中，多核苷酸是基本纯化或分离的。本发明 的一些多核苷酸包含编码重链可变区的多核苷酸序列，其选自SEQ ID NO :51、52、53和54， 和编码轻链可变区的多核苷酸序列，其选自SEQ ID N0:55、56、57、58和59。本发明的一些 多核苷酸包含重链可变区的核苷酸序列，其由选自SEQ ID N0:60、61和62的多核苷酸序列 编码，和轻链可变区的核苷酸序列，其由选自SEQ IDNO :63、64和65的多核苷酸序列编码。 本发明的一些其它的多核苷酸包含的核苷酸序列，其与在SEQ ID NO :60-65所述核苷酸序 列之一是基本相同的(例如，至少70%、80%、95%、96%、97%、98%或99%)。当从合适的 表达载体表达时，由这些多核苷酸编码的多肽能够显示抗原结合能力。在本发明中还提供多核苷酸，其编码在以下实施例中所述小鼠抗-PARI抗体的重 链或轻链的至少一个CDR区和通常全部三个CDR区。一些其它的多核苷酸编码小鼠抗-PARI 抗体的重链和/或轻链的全部或基本全部可变区序列。例如，这些多核苷酸中的一些编 码与在SEQ ID NO :51、52、53或54中所示重链可变区具有至少约90%、93%、95%、96%、 97%、98%、99%或100%序列同一性的氨基酸序列，和/或与在SEQ ID NO :55、56、57、58 和59中所示轻链可变区具有至少约90%、93%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列 同一性的氨基酸序列。因为密码子简并性，许多核酸序列编码各个免疫球蛋白氨基酸序列。本发明的多核苷酸能够仅编码抗-PARI抗体的可变区序列。它们也可以编码抗体 的可变区和恒定区。一些本发明核酸的多核苷酸序列编码成熟的重链可变区序列，其与在
20SEQ ID NO :5或7所示成熟重链可变区序列是基本相同的(例如，至少80%、90%或99%)。 一些其它的多核苷酸序列编码成熟的轻链可变区，其与在SEQ ID NO :6或8所示成熟轻链 可变区序列是基本相同的。一些多核苷酸序列编码多肽，该多肽包含示例小鼠抗-PARI抗 体之一的重链和轻链的可变区。一些其它的多核苷酸编码两个多肽区段，其分别与小鼠抗 体之一的重链和轻链的可变区基本相同。可以通过从头固相DNA合成或通过对编码抗-PARI抗体或其结合片段的现存序列 (例如，在以下实施例中所述序列)的PCR诱变产生多核苷酸序列。可以通过本领域公知 的方法实现核酸的直接化学合成，例如Narang等人的磷酸三酯法，Meth. Enzymol. 68 :90， 1979 ；Brown 等人的磷酸二酯法，Meth. Enzymol. 68 :109，1979 ；Beaucage 等人的二乙基磷酰 胺酸法，Tetra. Lett. ,22 =1859,1981 ；和美国专利号4，458，066的固相支持法。通过PCR向 多核苷酸序列引入突变可以按照在例如，PCR Technology principles and Applications for DNA Ampl ification，H. A. Erl ich(编)，Freeman Press, NY, NY, 1992 ； PCR Protocols A Guide to Methods andApp 1 ications, Innis 等人(编)，Academic Press, San Diego, CA, 1990 ；Mattila 等人，Nucleic Acids Res. 19 -.967,1991 ；和 Eckert 等人，PCR Methods and Applications 1 -.17,1991 中所述执行。本发明还提供产生上述抗-PARI抗体的表达载体和宿主细胞。可以使用多种表 达载体表达编码抗-PARI抗体链或结合片段的多核苷酸。可以使用基于病毒的和非病毒 的表达载体在哺乳动物宿主细胞中产生抗体。非病毒载体和系统包括质粒、附加型载体 (通常具有表达蛋白质或RNA的表达盒)，和人工人类染色体(见，例如，Harrington等 人，Nat Genet 15:345,1997)。例如，对于在哺乳动物(例如，人)细胞中表达抗-PARI多 核苷酸和多肽有用的非病毒载体包括pThioHis A、B和C、pcDNA3. 1/His、pEBVHis A、B和 C(Invitrogen,San Diego，CA)、MPSV载体和本领域公知的表达其它蛋白质的多种其它的载 体。有用的病毒载体包括基于反转录病毒的载体、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒，基于SV40 的载体、乳头瘤病毒、HBP非洲淋巴细胞瘤病毒、痘苗病毒载体和西门利克森林病毒(SFV)。 见，Brent 等人，如上；Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49 :807，1995 ；禾口 Rosenfeld 等人，Cell 68 :143，1992。表达载体的选择依赖于载体待表达的预期宿主细胞。通常，表达载体含有能够被 有效连接于编码抗-PARI抗体链或片段的多核苷酸的启动子和其它调节序列(例如，增强 子)。在一些实施方案中，使用诱导型启动子阻止在除诱导条件下之外插入序列的表达。 诱导型启动子包括，例如，阿拉伯糖、半乳糖苷酶基因(IacZ)、金属硫蛋白启动子或热 休克启动子。可以在非诱导条件下扩增转化生物体的培养物而不使种群偏向编码序列，编 码序列的表达产物被宿主细胞更好地耐受。除了启动子，也可能需要或期望其它调节元件 以有效表达抗-PARI抗体链或片段。这些元件通常包括ATG起始密码子和相邻的核糖体 结合位点或其它序列。此外，可以通过包含对使用的细胞系统合适的增强子来提高表达效 率(见，例如，Scharf 等人，Results Probl. Cell Differ. 20 125，1994 ；和 Bittner 等人， Meth. Enzymol.，153 :516，1987)。例如，可以使用SV40增强子或CMV增强子在哺乳动物宿 主细胞中增加表达。表达载体也可能提供分泌信号序列位置以与由插入的抗-PARI抗体序列编码的 多肽形成融合蛋白。更多情况下，插入的抗-PARI抗体序列在被包含在载体之前即连接于
21信号序列。用来接受编码抗-PARI抗体轻链和重链可变域序列的载体有时也编码恒定区或 其部分。这类载体使可变区能够与恒定区作为融合蛋白表达，藉此致使产生完整的抗体或 其片段。通常，这类恒定区是人的。包含和表达抗-PARI抗体链的宿主细胞可以是原核或真核的。大肠杆菌是对于克 隆和表达本发明的多核苷酸有用的一个原核宿主。适合使用的其它微生物宿主包括杆菌， 例如枯草杆菌(Bacillus subtilis)，和其它肠杆菌，例如，沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷 菌属(Serratia)，和多种假单胞菌(Pseudomonas)物种。在这些原核宿主中，人们也可以制 备表达载体，其通常含有与宿主细胞兼容的控制序列(例如，复制起始点)。此外，会存在任 意数目的多种众所周知的启动子，例如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内 酰胺酶启动子系统或来自噬菌体λ的启动子系统。启动子通常控制表达，任选通过操纵基 因序列进行，并具有用于起始和完成转录和翻译的核糖体结合位点序列等。也可以使用其 它微生物，例如，酵母，来表达本发明的抗-PARI多肽。也可以使用昆虫细胞与杆状病毒载 体的组合。在一些优选的实施方案中，使用哺乳动物宿主细胞表达和产生本发明的抗-PARI 多肽。例如，它们可以是表达内源性免疫球蛋白基因的杂交瘤细胞系(例如，在实施例中所 述骨髓瘤杂交瘤克隆)或含有外源表达载体的哺乳动物细胞系(例如，以下示例的SP2/0 骨髓瘤细胞)。这些包括任何正常必死的或正常或非正常永生的动物或人细胞。例如，已经 发展了能够分泌完整免疫球蛋白的多种合适的宿主细胞系，包括CHO细胞系、多种Cos细胞 系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系、转化的B-细胞和杂交瘤。表达多肽的哺乳动物组织细胞培养 物的使用被广泛讨论在，例如，Winnacker，From Genes to Clones, VCH Publishers, N. Y., N. Y.，1987。用于哺乳动物宿主细胞的表达载体可以包括表达控制序列，例如，复制起始点、 启动子和增强子(见，例如，Queen等人，Immunol. Rev. 89 =49-68,1986)，和必需的加工信息 位点，例如核糖体结合位点、RNA剪切位点、多聚腺苷酸化位点和转录终止序列。这些表达载 体通常含有衍生自哺乳动物基因或来自哺乳动物病毒的启动子。合适的启动子可能是组成 型的、细胞类型特异性的、阶段特异性的、和/或可调节或可调控的。有用的启动子包括，但 不限于，金属硫蛋白启动子、组成型腺病毒主要晚期启动子、地塞米松诱导的MMTV启动子、 SV40启动子、MRP polIII启动子、组成型MPSV启动子、四环素诱导的CMV启动子(例如，人 即刻早期CMV启动子)、组成型CMV启动子、和本领域公知的启动子_增强子组合。引入含有目的多核苷酸序列的表达载体的方法依赖于细胞宿主类型而改变。例 如，氯化钙转染是通常用于原核细胞的方法，而磷酸钙处理或电穿孔可以被用于其它细胞 宿主(通常见Sambrook等人，supra)。其它方法包括，例如，电穿孔、磷酸钙处理、脂质体 介导的转化、注射和显微注射、生物弹法、病毒体、免疫脂质体、多聚阳离子、核酸缀合物、 裸DNA、人工病毒粒子、融合于疱疹病毒结构蛋白VP22 (Elliot和0，Hare, Cell 88 :223， 1997)、试剂增强的DNA摄取和离体转导。为了长期、高产率的生产重组蛋白，通常希望稳定 的表达。例如，可以使用本发明的表达载体制备稳定表达抗-PARI抗体链或结合片段的细 胞系，所述本发明的表达载体含有病毒复制起始点或内源表达元件和可选择的标记基因。 在引入载体之后，可使细胞在转入选择培养基之前在富集培养基中生长1-2天。可选择标 记的目的是赋予选择抗性，其存在使成功表达引入序列的细胞在选择培养基中能够生长。 使用适合细胞类型的组织培养技术可以增殖有抗性的、稳定转染的细胞。
抗-PARI抗体或抗原结合分子的特件一旦从宿主细胞中的表达载体或在杂交瘤中内源性合成或表达上述抗-PARI抗 体或抗原结合分子，它们可以从，例如，培养基和宿主细胞容易的被纯化。通常，抗体链表达 时具有信号序列，因此释放至培养基。然而，如果抗体链不是由宿主细胞天然的分泌，可以 通过用温和去污剂处理来释放抗体链。然后可以通过常规方法纯化抗体链，包括硫酸铵沉 淀、对固定靶标的亲和色谱法、柱色谱法、凝胶电泳等。这些方法均是本领域众所周知和常 规操作的，例如 Scopes，Protein Purification, Springer-Verlag, NY, 1982 ；禾口 Harlow & Lane,同上。例如，表达本发明的抗-PARI抗体的选择的杂交瘤可以在转瓶中生长用于单克隆 抗体纯化。可以过滤上清液并用蛋白质A-琼脂糖或蛋白质G-琼脂糖柱通过亲和色谱法浓 缩。可以通过凝胶电泳和高效液相色谱法检查从柱洗脱的IgG分子以保证纯度。缓冲液可 以被交换为PBS，可以通过0D280读数确定浓度。单克隆抗体可以等分试样和贮存在-80°C。无论其制备方法，本发明的抗-PARI抗体或抗原结合分子特异性结合于PARI或 其抗原片段。当抗体结合PARI或其抗原片段的解离常数彡1 μ Μ,优选彡IOOnM,和最优 选彡InM时，存在特异性结合。可以通过直接标记目标抗体检测抗体结合于PARI的能力， 或者抗体可以是未标记的，使用多种夹心式测定法间接的检测结合。见，例如，Harlow & Lane，如上。具有这类结合特异性的抗体更可能享有由在以下实施例中讨论的小鼠或嵌合 抗-PARI抗体呈现的有利的特性。通常，本发明的抗-PARI抗体或抗原结合分子以至少 1 X IO7M-1UO8M-1UO9M-1或IOkT1的平衡缔合常数(Ka)结合于PARI多肽或抗原片段。此夕卜， 它们还具有约Ixio-ViUxio-V1Uxio-V1或更低的动力学解离常数(kd)，和以至少大 于其结合非特异性抗原(例如，BSA)亲和力两倍的亲和力结合人PARI (hPARl)。在一些实施方案中，本发明的抗体相对来自其它哺乳动物物种，例如，来自啮齿动 物物种，包括小鼠、大鼠、兔和仓鼠的PARI，优选的结合人PARI。在一些实施方案中，本发明 的抗体相对于其它PAR亚型，例如，PAR2、PAR3或PAR4，优选的结合于PARI。在一些实施方案中，本发明的抗-PARI抗体或抗原结合分子阻断或与参考 抗-PARI抗体竞争结合PARI多肽。参考抗-PARI抗体能够特异性结合具有包含 SFLLRNPNDKYEPFffEDEEKNESGLTE (SEQ ID NO 1)氨基酸序列或其片段(例如，至少 8、9、10、 11、12、13、14或15个连续氨基酸的片段)的PARI表位。这些可以上述的全人抗-PARI抗 体。它们也可以是与参考抗体结合相同表位的其它小鼠、嵌合或人源化的抗-PARI抗体。阻 断或与参考抗体竞争结合PARI的能力表明所测试的抗-PARI抗体或抗原结合分子结合于 由参考抗体定义的相同或相似表位，或与参考抗-PARI抗体结合的表位足够接近的表位。 这类抗体尤其可能具有鉴定的参考抗体的有利特性。阻断或与参考抗体竞争的能力可以通 过，例如，竞争结合测定来确定。使用竞争结合测定，在测试中检查该抗体抑制参考抗体特 异性结合共同抗原(例如，PARI多肽)或抗原上的表位的能力。如果过量的检测抗体基本 抑制参考抗体的结合，则检测抗体与参考抗体竞争对抗原或表位的特异性结合。基本抑制 意指检测抗体通常以10 %、25 %、50 %、75 %或90 %减少参考抗体的特异性结合。有多种公知的竞争结合测定可以被用于评估检测抗-PARI抗体或抗原结合分子 与参考抗-PARI抗体对结合人PARI (hPARl)的竞争。这些包括，例如，固相直接或间接放 射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(见Stahli等人，
23Methods in Enzymology 9 :242_253，1983)；固相直接生物素-亲和素 EIA(见 Kirkland 等人，J. Immunol. 137 =3614-3619,1986)；固相直接标记测定、固相直接标记夹心测定 (见Harlow& Lane，如上)；使用1-125标记的固相直接标记RIA(见Morel等人，Molec. Immunol. 25 :7-15，1988)；固相直接生物素-亲和素 EIA(Cheung 等人，Virology 176 546-552，1990)；和直接标记的 RIA(Moldenhauer 等人，Scand. J. Immunol. 32 :77_82， 1990)。通常，这类测定涉及使用结合于固体表面的纯化的抗原或带有抗原的细胞、未标记 的测试抗-PARI抗体和标记的参考抗体。通过在测试抗体存在下测定结合固体表面或细胞 的标记的量测量竞争抑制。通常测试抗体是过量存在的。通过竞争测定鉴定的抗体(竞争 抗体)包括与参考抗体结合于相同表位的抗体、和结合于与参考抗体结合的表位足够接近 而发生位阻的邻近表位的抗体。为了确定是否测试抗-PARI抗体或抗原结合分子和参考抗体结合唯一表位，可以 使用可商购试剂(例如，来自Pierce，Rockford，IL的试剂)对各个抗体生物素化标记。使 用PARI多肽包被的ELISA平板可以进行用未标记单克隆抗体和生物素化的单克隆抗体的 竞争研究。可以用链霉抗生物素蛋白-碱性磷酸酶探针检测生物素化的MAb的结合。为 了确定纯化的抗-PARI抗体的同种型，可以执行同种型ELISA。例如，可以用1 μ g/ml的抗 人IgG包被微孔板的孔，在4°C过夜。在用BSA封闭之后，用1 μ g/ml或更少的单克隆 抗-PARI抗体或纯化的同种型对照与平板在室温反应1至2小时。然后可以将孔与人IgGl 或人IgM-特异性碱性磷酸酶缀合探针反应。然后显影平板和分析，从而可以测定纯化抗体 的同种型。为了证明单克隆抗-PARI抗体或抗原结合分子对表达PARI多肽的活细胞的结合， 可以使用流式细胞计数仪。简言之，可以将表达PARI的细胞系(在标准生长条件下生长) 与多种浓度的抗-PARI抗体在含有0. 1% BSA和10%胎牛血清的PBS中混合，和在37°C孵 育1小时。洗涤之后，在与一级抗体染色相同的条件下，细胞与荧光素标记的抗人IgG抗体 反应。可以通过流式细胞计分析样品，使用光和侧散射特性门控单个细胞。可以使用荧光 显微镜作为(另外或代替)流式细胞计数测定的备选测定。如上对细胞染色和通过荧光显 微镜检测。还可以通过免疫印迹检测本发明的抗-PARI抗体与PARI多肽或抗原片段的反应 性。简言之，可以制备纯化的PARI多肽或融合蛋白质，或来自表达PARI细胞的细胞提取物， 进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳之后，将分离的抗原转移到硝酸纤维素膜， 用10%胎牛血清封闭，和用待检测的单克隆抗体作为探针检测。可以使用抗人IgG碱性磷 酸酶和用BCIP/NBT底物片剂(Sigma Chem. Co.，St. Louis, MO)显影来检测人IgG结合。治疗应用和药物组合物通过抑制PARI信号传导活动，这里所述抗-hPARl抗体或抗原结合分子可以用在 许多治疗或预防应用。在治疗应用中，将包含抗-hPARl拮抗剂抗体或抗原结合分子的组合 物施用于已经患有由PARI信号传导介导、引起或有关疾病或病症的受试者。该组合物含有 足以抑制、部分阻碍或可检测的降低病情及其并发症发展的量的抗体或抗原结合分子。在预防应用中，将含有抗-hPARl抗体或抗原结合分子的组合物施用于尚未患有 PARI-信号传导相关病症的患者。而将它们施用于具有发展这类病征风险或倾向的受试者。 这类应用使受试者能够增加患者的抗性或者延缓由PARI信号传导介导的病征的进程。
24
多种疾病是由异常或反常地高的PARI-介导的细胞内信号传导介导。异常高的 PARI-介导的细胞内信号传导可以是由，例如，受体暴露于异常高浓度的激活蛋白酶(例 如，凝血酶)或异常高的细胞表面PARI表达水平而引起。抑制PARI对于治疗血栓形成和 血管增生的病症以及抑制癌症(cancer)进程是有用的，所述癌症，例如，癌(carcinomas) 或上皮癌，包括例如皮肤癌(包括黑色素瘤)、胃肠癌(包括结肠癌)、肺癌和乳腺癌(包 括乳房和导管癌)、前列腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、腺癌等。见，例如，Darmoul等人，Mol Cancer Res (2004) 2 (9) :514_22 和 Salah，等人，Mol Cancer Res (2007) 5 (3) :229_40。抑 制PARI还发现用于预防或抑制慢性肠炎，包括炎性肠病(IBD)、肠易激惹综合征(IBS)和溃 疡性结肠炎；和纤维变性病，包括肝纤维化和肺纤维化。见，例如，Vergnolle等人，J Clin Invest(2004) 114(10) 1444 ；Yoshida,等人，AlimentPharmacol Ther (2006)24(Suppl 4) 249 ；Mercer 等人，Ann NY Acad Sci (2007) 1096 :86_88 ;Sokolova和 Reiser，Pharmacol Ther(2007)PMID 17532472。能够通过本发明的抗-PARI抗体抑制或预防的癌症包括，不限于，上皮癌包括 癌(carcinomas)；神经胶质瘤、间皮瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病、腺癌、乳腺癌、卵巢癌、 宫颈癌、胶质母细胞瘤、白血病、淋巴瘤、前列腺癌、和伯基特淋巴瘤、头颈癌、结肠癌、结直 肠癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、食管癌、胃癌、胰腺癌、肝胆管癌、胆囊癌、小肠癌、直肠 癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、阴茎癌、尿道癌、睾丸癌、宫颈癌、阴道癌、子宫癌、卵巢癌、甲 状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、胰腺内分泌癌、类癌、骨癌、皮肤癌、视网膜母细胞瘤、多 发骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤、和非霍奇金淋巴瘤(对于另外的癌症，见，CANCER PRINCIPLES ANDPRACTICE (DeVita, V. Τ.等人编辑 1997))。抑制PARI还发现用于预防或抑制可能是或不是由异常或反常地高的PARI表达或 细胞内信号传导介导的疾病。例如，抑制PARI对于预防或抑制局部缺血再灌注损伤(包括 心肌、肾脏、大脑和肠内的局部缺血再灌注损伤)是有用的。见，例如，Strande等人，Basic Res. Cardiol (2007) 102 (4) :350_8 ；Sevastos 等人，Blood (2007) 109(2) :577_583 Junge 等人，Proc Natl Acad Sci USA. (2003) 100(22) :13019_24 和 Tsuboi 等人，Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol (2007) 292 (2) :G678_83。也可以将抑制 PARI 细胞内信号传 导用于抑制单纯疱疹病毒(HSV1和HSV2)对细胞的感染。见，Sutherland等人，J Thromb Haemost (2007)5 (5) 1055-61。本发明提供药物组合物，其包含与可药用载体一起配制的抗-hPARl抗体或抗原 结合分子。该组合物可以另外含有适合治疗或预防特定病征的其它治疗物质。制药载体提 高或稳定该组合物，或有利于组合物的制备。可药用载体包括生理可兼容的溶剂、分散剂、 包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。可以通过本领域公知的多种方法施用本发明的药物组合物。施用的途径和/或方 式可以根据期望效果而改变。优选施用是静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下的，或施用于靶标 位点附近。可药用载体应该适合静脉内、肌肉内、皮下、胃肠外、脊柱或表皮的施用(例如， 通过注射或灌输)。由施用途径决定，可以将有活性化合物(即，抗体、双特异性和多特异性 分子)包被在材料中，以保护化合物免受可能灭活该化合物的酸和其它天然条件作用。在一些实施方案中，组合物是无菌和液体的。可以例如，通过使用包衣例如卵磷 脂，通过维持分散情况下所需颗粒大小和通过使用表面活性剂来维持合适的流动性。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如，糖、多元醇诸如甘露醇或山梨醇、和氯化钠。 可以通过在组合物中包括延迟吸收的物质，例如，单硬脂酸铝或明胶带来可注射组合物的 长效吸收。可以根据本领域众所周知的方法和常规操作制备本发明的药物组合物。见，例如， Remington :The Science and Practice of Pharmacy, MackPublishing Co. ,20 版，2000 ； 禾口Sustained and Controlled Release DrugDelivery Systems,J. R. Robinson,编，Marcel Dekker, Inc. , New York，1978。药物组合物优选在GMP条件下制备。通常，在本发明的药 物组合物中使用治疗有效剂量或有效剂量的抗-hPARl抗体。通过本领域技术人员公知的 常规方法将抗-hPARl抗体配制成为可药用剂型。调整给药方案以提供最佳期望应答(例 如，治疗反应)。例如，可以施用单个团注，可以在一段时间内施用数次分份剂量，或可以按 照治疗情况紧急程度指示成比例的减少或增加剂量。以剂量单元形式配制胃肠道外的组合 物对于容易的施用和均勻剂量是特别有利的。这里使用的剂量单元指对于要治疗的受试者 适合作为单元剂量的物理分离的单元；各个单元含有结合了需要的治疗载体的、计算出的 产生期望治疗效果的活性化合物的预定的量。可以改变本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平以获得对于特定患者、 组合物和施用方式有效实现所期望治疗应答，而对患者没有毒性的活性成分的量。选择的 剂量水平取决于多种药物动力学因素，包括使用的本发明的特定组合物、或其酯、盐或酰胺 的活性，施用途径，施用时间，使用的特定化合物的排泄速率、治疗持续时间、与使用的特定 组合物组合使用的其它药物、化合物和/或物质，所治疗患者的年龄、性别、体重、状态、整 体健康和先前病史，等等因素。医生或兽医可以在药物组合物中以低于获得期望治疗效果所需水平开始使用本 发明的抗体的剂量，逐渐增加剂量直至获得期望效果。通常，本发明组合物的有效剂量依据 许多不同因素而改变，包括要治疗的特定疾病或病征、施用方式、靶标位点、患者的生理学 状态、患者是人或动物、施用的其它药物、和治疗是预防还是治疗的。需要滴定治疗剂量以 优化安全性和有效性。对于抗体施用，剂量范围从宿主体重的约0. 0001至100mg/kg，和更 通常从0. 01至5mg/kg。例如，剂量可以是lmg/kg体重或10mg/kg体重或在l-10mg/kg范 围之内。示例性的治疗方案要求施用每两周一次或每月一次或每3至6个月一次。在其中该物质是核酸的实施方案中，典型剂量范围可以从约0. lmg/kg体重达并 包括约100mg/kg体重，优选在约lmg/kg体重至约50mg/kg体重之间。更优选约1、2、3、4、 5、10、15、20、30、40 或 50mg/kg 体重。通常以多次施用抗体。在单剂量之间的间隔可以是每周、每月或每年。如通过测 量患者中抗-hPARl抗体的血液水平所示，间隔也可以是不规律的。在一些方法中，调节剂 量以获得血浆抗体浓度为1-1000 μ g/ml和在一些方法中25-300 μ g/ml。或者，可以将抗体 作为持续释放制剂施用，此种情况下需要施用的频率较少。依据在患者中抗体的半衰期改 变剂量和频率。通常，人源化抗体显示比嵌合抗体和非人抗体更长的半衰期。施用的剂量 和频率可以依据治疗是预防性或治疗性的而变化。在预防性应用中，在长时间以相对不频 繁间隔施用相对低剂量。一些患者在余生中持续接受治疗。在治疗应用中，有时需要相对 短时间间隔、相对高剂量直至减少或终止该疾病进展，优选直至患者显示疾病症状的部分 或全部的改善。此后，患者可以被施用预防性方案。
26实施例提供下列实施例以说明，而非限定要求的发明。实施例1 下列实施例提供对在人中具有最小化免疫原件的抗-Par-I抗体的构津 和筛诜。方法鼠V-区的亚克隆从鼠单克隆4E7. J14亚克隆鼠V-区。使用PCR扩增V-重链和V-κ区的V-基因 和掺入适合克隆进入表达载体的限制性内切酶位点。在PBR322载体系统中，V-区被克隆 为带有人IgGl恒定区的Fab’片段。在大肠杆菌中从pTAC启动子表达Fab’。在ELISA测 定中，纯化的Fab’蛋白(克隆冊15-5)显示结合Par-I抗原。Fab，和 Fab 纯化使用表达载体通过从大肠杆菌分泌表达Fab’和Fab片段。细胞在2xYT培养基中 生长至在600nm波长测量光密度(0D_)为0.6。在33°C使用异丙基-β-D-半乳糖硫吡喃 糖苷(IPTG)诱导表达3小时。从胞质部分获得装配的Fab’或Fab和根据标准方法使用链 球菌蛋白质G通过亲和色谱法(HiTrap蛋白质GHP柱；GE Healthcare)纯化。在pH 2. O缓 冲液中洗脱Fab，和Fab，立即调节至pH 7. O和对PBS ρΗ7· 4透析(PBS是没有钙和镁的)。ELISA通常，通过在4°C孵育过夜，50ng/孔的Par-I抗原结合于96孔微孔板。用在含有 0. 吐温20的磷酸盐缓冲液(“PBST”)中5%牛奶的溶液在33°C封闭平板1小时。在 PBS中稀释Fab或参考Fab，(PR15-5)和每孔加入50 μ 1。在33°C孵育1小时之后，用PBST 洗平板3次。每孔加入50 μ 1的抗-人-κ链辣根过氧化物酶(HRP)缀合物(Sigma ；在 PBST中稀释至0. lng/ml)和在33°C孵育平板40分钟。用PBST洗平板3次和用PBS洗一 次。每孔加入100 μ 1的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)底物(Sigma)和在室温孵育 5 分钟。为了终止反应，每孔加入100 μ 1的0. 2Ν H2S04。在分光光度计于450nm读取平板。筛选对Fab片段文库的筛选按照在美国专利公开号2005/0255552和2006/0134098中 所述使用重组Par-I抗原包被的硝化纤维素滤器进行。这些专利出版物的全部公开在此通 过其整体参考被并入用于全部目的。亲和力测量使用ForteBio Octet生物传感器分析Fab，和Fab片段的结合动力学。根据厂商 方法使用EZ-Iink生物素化作用试剂盒(Pierce)生物素化重组抗原。然后将抗原偶联于 中和亲和素(neutravidin)包被的传感器(ForteBio)。使用生物涂层干涉量度法分析和由 厂商提供的软件实时监测Fab’和Fab结合。从测定的结合和解离常数计算亲和力。结果V-区的克隆和表达ForteBio Octet检测证实亚克隆的V-区的Par-Ι抗原结合活性。对鼠V-区克隆、测序和表达。V-区被克隆为带有人IgGl恒定区的Fab’片段和在 大肠杆菌中表达。在Par-I抗原结合的ForteBio Octet检测中，克隆的Fab，冊15_5产生
27依赖于抗体浓度的结合曲线。见，表1。表权利要求
结合蛋白酶激活受体 1(PAR1)的抗体，其中该抗体包含(a)重链可变区，其包含人重链V 区段、重链互补决定区3(CDR3)、和重链构架区4(FR4)，和(b)轻链可变区，其包含人轻链V 区段、轻链CDR3、和轻链FR4，其中i)重链CDR3包含氨基酸序列DDX1X2SX3WX4FDV，其中X1是G或I，X2是P或Y，X3是H、L、P、M、E、W、T、S、Q或A，X4是Y或F(SEQ ID NO10)；ii)轻链CDR3可变区包含氨基酸序列FQGX5X6VPFT，其中X5是S、D、A或V，X6是H、R、T、S或K(SEQ ID NO20)；其中该抗体是PAR1拮抗剂。
2.权利要求1的抗体，其中重链V-区段与SEQID NO :41共有至少90%序列同一性， 其中轻链V-区段与SEQ ID NO 46共有至少90%序列同一性。
3.权利要求1的抗体，其中重链V-区段与选自SEQID NO :42、SEQID NO :43、SEQ ID NO 44和SEQ ID NO 45的氨基酸共有至少90%序列同一性，其中轻链V-区段与选自SEQ ID NO :47、SEQ ID NO :48、SEQ ID NO 49 和 SEQ ID NO 50 的氨基酸共有至少 90%序列同 一性·
4.权利要求1的抗体，其中i)重链CDR 3 包含选自 SEQ ID NO :11、SEQ ID NO: 12 禾口 SEQ ID NO 13 的氨基酸序 列；和ii)轻链CDR3包含选自SEQID NO 22和SEQ ID NO 23的氨基酸序列。
5.权利要求1的抗体，其中重链FR4是人种系FR4。
6.权利要求5的抗体，其中重链FR4是人种系JH6(WGQGTTVTVSS ；SEQ ID NO 32)。
7.权利要求5的抗体，其中重链J-区段包含人种系JH6部分序列DVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO 66)。
8.权利要求1的抗体，其中轻链FR4是人种系FR4。
9.权利要求8的抗体，其中轻链FR4是人种系Jk2(FGQGTKLEIK ；SEQID NO 40)。
10.权利要求8的抗体，其中轻链J-区段包含人种系Jk2部分序列！FGQGTKLEIK(SEQ ID NO 67)。
11.权利要求1的抗体，其中重链V-区段和轻链V-区段各自包含互补决定区1(⑶Rl) 和互补决定区2(⑶R2)；其中i)重链V-区段的⑶Rl包含SEQID NO 2的氨基酸序列；ii)重链V-区段的⑶R2包含SEQID NO 6的氨基酸序列；iii)轻链V-区段的CDRl包含SEQID NO 14的氨基酸序列；禾口iv)轻链V-区段的⑶R2包含SEQID NO 17的氨基酸序列.
12.权利要求11的抗体，其中i)重链V-区段的CDRl包含SEQID NO 4 ；ii)重链V-区段的CDR2包含SEQID NO 8 ；iii)重链CDR3 包含 SEQ ID NO 11 ；iv)轻链V-区段的CDRl包含SEQID NO 16 ；ν)轻链V-区段的CDR2包含SEQ ID NO 19 ；和vi)轻链 CDR3 包含 SEQ ID NO :22。
13.权利要求11的抗体，其中i)重链V-区段的CDRl包含SEQID NO 4 ；ii)重链V-区段的CDR2包含SEQID NO 8 ；iii)重链CDR3 包含 SEQ ID NO 12 ；iv)轻链V-区段的CDRl包含SEQID NO 16 ； ν)轻链V-区段的CDR2包含SEQ ID NO 19 ；和 vi)轻链 CDR3 包含 SEQ ID NO :23。
14.权利要求11的抗体，其中i)重链V-区段的CDRl包含SEQID NO 5 ；ii)重链V-区段的CDR2包含SEQID NO 9 ；iii)重链CDR3 包含 SEQ ID NO 13 ；iv)轻链V-区段的CDRl包含SEQID NO 16 ； ν)轻链V-区段的CDR2包含SEQ ID NO 19 ；和 vi)轻链 CDR3 包含 SEQ ID NO :23。
15.权利要求1的抗体，其中重链可变区与SEQID NO 51的可变区共有至少90%氨基 酸序列同一性，轻链可变区与SEQ ID NO :55的可变区共有至少90%氨基酸序列同一性。
16.权利要求1的抗体，其中重链可变区与选自SEQID NO 52,SEQ IDN0:53和SEQ ID NO 54的可变区共有至少90%氨基酸序列同一性，轻链可变区与选自SEQ ID NO :57、SEQ ID NO 58和SEQ ID NO 59的可变区共有至少90%氨基酸序列同一性。
17.权利要求1的抗体，其中重链可变区与选自SEQID NO :52、SEQ I DNO :53和SEQ ID NO :54的可变区共有至少95%氨基酸序列同一性，轻链可变区与选自SEQ ID NO 57、SEQ ID NO 58和SEQ ID NO 59的可变区共有至少95%氨基酸序列同一性。
18.权利要求1的抗体，其中重链可变区包含选自SEQID NO :52、SEQID NO 53和SEQ ID NO :54的氨基酸序列，轻链可变区包含选自SEQ IDNO 57、SEQ ID N0:58和SEQ ID NO: 59的氨基酸序列。
19.权利要求1的抗体，其中该抗体以小于IxlO-8M的平衡解离常数(Kd)结合于PARI。
20.权利要求1的抗体，其中该抗体是FAb’片段。
21.权利要求1的抗体，其中该抗体是IgG。
22.权利要求1的抗体，其中该抗体是单链抗体(scFv)。
23.权利要求1的抗体，其中该抗体包含人恒定区。
24.权利要求1的抗体，其中该抗体包含包含SEQID NO 52的重链和包含SEQ ID NO 57的轻链。
25.权利要求1的抗体，其中该抗体包含包含SEQID NO :53的重链和包含SEQ ID NO 58的轻链。
26.权利要求1的抗体，其中该抗体包含包含SEQID NO 54的重链和包含SEQ ID NO 59的轻链。
27.可药用组合物，其包含权利要求1-26的任一项的抗体和生理相容的赋形剂。
28.改善由通过PARI的细胞内信号传导介导的疾病症状的方法，包括向有需要的患者施用权利要求1-26的任一项的抗体，其中该抗体是PARI的拮抗剂。
29.权利要求28的方法，其中由通过PARI的异常细胞内信号传导介导的疾病是慢性肠炎。
30.权利要求28的方法，其中由通过PARI的异常细胞内信号传导介导的疾病是纤维变 性病。
31.权利要求28的方法，其中由通过PARI的异常细胞内信号传导介导的疾病是过表达 PARI的癌症。
32.权利要求28的方法，其中由通过PARI的异常细胞内信号传导介导的疾病是局部缺 血再灌注损伤。
33.特异性结合PARI的抗体，其中该抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可 变区和轻链可变区各自包含下列三个互补决定区(OTR)⑶R1、⑶R2和⑶R3 ；其中i)重链可变区的CDRl包含选自SEQID NO :3、SEQ ID NO :4和SEQ IDNO 5的氨基酸 序列；ii)重链可变区的CDR2包含选自SEQID NO :7、SEQ ID NO :8和SEQ IDNO :9的氨基酸 序列；iii)重链可变区的CDR3 包含选自 SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12 和 SEQ ID NO 13 的氨基酸序列；iv)轻链可变区的⑶Rl包含选自SEQID NO 15和SEQ ID NO 16的氨基酸序列； ν)轻链可变区的⑶R2包含选自SEQ ID NO 18和SEQ ID NO 19的氨基酸序列； vi)轻链可变区的⑶R 3包含选自SEQ ID NO 22和SEQ ID NO 23的氨基酸序列。
全文摘要
本发明提供特异性识别和拮抗PAR1受体的抗体或抗原结合分子。在本发明中还提供编码这类分子的多核苷酸和载体及包含该多核苷酸或载体的宿主细胞。
文档编号C07K16/28GK101977936SQ200880024824
公开日2011年2月16日 申请日期2008年7月17日 优先权日2007年7月17日
发明者K·R·鲁尔森 申请人:Irm责任有限公司