Peg化的多肽的纯化的制作方法

专利名称：Peg化的多肽的纯化的制作方法
PEG化的多肽的纯化本发明属于用于纯化多肽、尤其是PEG化的红细胞生成素的色谱分离方法领域。
背景技术：
在当今的医疗产品中蛋白质具有重要作用。对于人应用而言，每种治疗性蛋白质 均必须符合独特的标准。为了确保生物药物对人的安全性，尤其必须除去生产过程中累积 的副产物。为了满足管理规范，在生产过程之后必须进行一个或多个纯化步骤。其中，纯度、 流通量和产率在确定适宜的纯化方法中起重要作用。已确立了不同的方法并广泛用于蛋白质的纯化，例如使用微生物蛋白的亲和色谱 法(例如蛋白A或蛋白G亲和色谱法)、离子交换色谱法(例如阳离子交换(磺丙基或羧甲 基树脂)、阴离子交换(氨基乙基树脂)和混合模式的离子交换)、亲硫吸附色谱法(例如使 用β -巯基乙醇和其它SH配体)、疏水作用色谱法或芳烃吸附色谱法(例如使用苯基_琼 脂糖、亲氮杂_芳烃树脂(aza-arenophilic resin)或间-氨基苯基硼酸)、金属螯合亲和 色谱法(例如使用Ni (II)-和Cu (II)-亲和物质)、尺寸排阻色谱法和电泳方法(例如凝胶 电泳、毛细管电泳)(Vijayalakshmi, Μ. A.，Appl. Biochem. Biotech. 75(1998)93-102)。针对例如聚乙二醇(PEG)和白介素-6 (EP 0442724)、PEG和红细胞生成素(TO 01/02017)、包含内皮抑制素和免疫球蛋白的嵌合分子(US 2005/008649)、基于分泌的抗体 的融合蛋白(US 2002/147311)、包含白蛋白的融合多肽(US 2005/0100991 ；人血清白蛋白 US 5，876，969)、PEG化的多肽(US 2005/0114037)和干扰素融合物报道了缀合物。Necina, R.等人(Biotechnol. Bioeng. 60 (1998) 689-698)报道了 用表现出高电 荷密度的离子交换媒介物直接从细胞培养物上清液中捕获人单克隆抗体。在WO 89/05157 中，报道了一种通过直接将细胞培养基进行阳离子交换处理纯化免疫球蛋白产物的方法。 Danielsson, A.等人，J. Immun. Meth. 115 (1988)，79-88 描述了来自小鼠腹水的单克隆 IgG 抗体的一步纯化。在WO 2004/024866中报道了一种通过离子交换色谱法纯化多肽的方 法，其中使用梯度洗脱将感兴趣的多肽与一种或多种污染物拆分开。在EP 0530447中，报 道了一种通过三个色谱步骤的组合纯化IgG单克隆抗体的方法。Yu，G.等人在Process Biotechnol. 42(2007)971-977中报道了单PEG化的白介素-1受体拮抗剂的温和纯化。 Wang等人(Wang，H.等人，Peptides 26(2005) 1213-1218)报道了通过两步阳离子交换 色谱法进行的对大肠杆菌(E.coli)中表达的hTFF3的纯化。Yim等人(Yim，Q.等人， J. Biotechnol. 118(2005)67-74)报道了通过两个连续的离子交换色谱步骤进行的对PEG 化的rhG-CSF的纯化。WO 2007/039436和WO 01/087329报道了与聚(乙二醇)基团共价 连接的红细胞生成素以及包含红细胞生成素蛋白的液体药物组合物。发明概述本发明包括纯化单PEG化的红细胞生成素的方法，其包括以下步骤提供包含 单_、多-和未-PEG化的红细胞生成素的溶液，进行两个连续的阳离子交换色谱步骤，和回 收在第二个阳离子交换色谱步骤中纯化的单PEG化的红细胞生成素，其中在所述两个阳离 子交换色谱步骤中使用相同类型的阳离子交换材料。在所述方法的一个实施方案中，所述两个连续的阳离子交换色谱步骤是使用不同的洗脱方法进行的。在另一个实施方案中，所述两个连续的阳离子交换色谱步骤包括以下 步骤a)在适于所述单PEG化的红细胞生成素与第一阳离子交换色谱柱中所含有的阳 离子交换材料结合的条件下，将包含单-、多-和未-PEG化的红细胞生成素的混合物的缓冲 水溶液加样在所述第一柱上，b)利用穿流缓冲液的离子强度步进增加的分步洗脱方法从第一阳离子交换色谱 柱上回收单PEG化的红细胞生成素，其中与步骤a)中加样的混合物相比，所述单PEG化的 红细胞生成素的分数增加，c)在适于所述单PEG化的红细胞生成素与第二阳离子交换色谱柱中所含有的阳 离子交换材料结合的条件下，将回收的单PEG化的红细胞生成素加样在所述第二柱上，其 中所述第二柱中所含有的阳离子交换材料与第一柱中的阳离子交换材料是相同类型的，d)利用穿流缓冲液的离子强度连续增加的连续洗脱方法从所述第二阳离子交换 色谱柱上回收基本同质的形式的纯化的单PEG化的红细胞生成素。在所述方法的一个实施方案中，阳离子交换材料是强阳离子交换材料。在一个优 选的实施方案中，阳离子交换材料是磺丙基阳离子交换材料。尤其优选的是Toyopearl SP 650M。在另一个实施方案中，单PEG化的红细胞生成素在步骤d)中以大于95面积 纯度的基本同质的形式被回收。在所述方法的另一个实施方案中，所述方法的步骤b)中的 离子强度的步进增加是两步离子强度增加。优选地，在所述分步洗脱方法的第二步、即在离 子强度第二次增加后回收单PEG化的红细胞生成素。本发明的另一方面是制备单PEG化的红细胞生成素的方法，其包括以下步骤a)使用PEG化试剂将红细胞生成素PEG化，b)使用两个连续的阳离子交换色谱步骤纯化PEG化的红细胞生成素，其中第一和 第二阳离子交换色谱采用相同类型的阳离子交换材料，c)从第二阳离子交换色谱柱上回收基本同质的形式的单PEG化的红细胞生成素。发明详述本发明包括纯化单PEG化的红细胞生成素的方法，其包括两个阳离子交换色谱步 骤，其中在所述两个阳离子交换色谱步骤中使用相同类型的阳离子交换材料。本申请中所用的术语“离子交换材料”表示不动的高分子量基质，其带有共价结合 的荷电取代基，用作离子交换色谱的固定相。为了达到整体电荷中性，非共价结合的抗衡离 子与之结合。“离子交换材料”具有将其非共价结合的抗衡离子交换成周围溶液中的类似荷 电的离子的能力。根据其可交换的抗衡离子的电荷，“离子交换树脂”被归类为阳离子交换 树脂或阴离子交换树脂。根据荷电基团(取代基)的性质，“离子交换树脂”例如在阳离子 交换树脂的情况下被归类为磺酸树脂(S)或磺丙基树脂(SP)或羧甲基树脂(CM)。根据荷 电基团/取代基的化学性质，“离子交换树脂”又可以分为强或弱离子交换树脂，这取决于共 价结合的荷电取代基的强度。例如，强阳离子交换树脂具有磺酸基、优选具有磺丙基作为荷 电取代基，弱阳离子交换树脂具有羧基、优选具有羧甲基作为荷电取代基，弱阴离子交换树 脂具有二乙氨基乙基作为荷电取代基。不同类型的离子交换材料(即固定相)可以以不同的名称、从许多公司获得，例 如，阳离子交换材料Bio-Rex (例如70型)、Chelex (例如100型)、Macro-Prep (例如 CM、High S、25S 型)、AG (例如通、MP 型)均可从 BioRad Laboratories 获得， WCX 2 可从 Ciphergen 获得，Dowex MAC-3 可从 Dow 化学公司获得，Mustang C 和 Mustang S 可从 PallCorporation 获得，Cellulose CM(例如 23、52 型)、hyper—D、partisphere 可 从 Whatman pic.获得，Amberlite IRC(例如 76、747、748 型)、Amberlite GT 73、 Toyopearl (例如 SP、CM、650M 型)均可从 TosohBioscience GmbH 获得，CM 1500 和 CM 3000 可从 BioChrom Labs 获得，SP-S印harose 、CM-S印harose 可从 GE Healthcare 获得， Poros 树脂可从 PerS印tive Biosystems 获得，Asahipak ES (例如 502C 型)、CXpak P、IEC CM (例如 825、2825、5025、LG 型)、IEC SP (例如 420N、825 型)、IEC QA (例如 LG、825 型) 可从 Shoko America Inc.获得，50W 阳离子交换树脂可从 Eichrom Technologies Inc.获
得。优选地，阳离子交换材料是强阳离子交换材料，例如Macro-Prep High S或25S、或 MacroCap SP、或Toyopearl SP 650M、或 Source S、或 SP S印harose、或POLYCAT A。举例 性的阴离子交换材料有可从Dow化学公司获得的Dowex 1、可从Bi0Rad Laboratories 获得的AG (例如 U、4 型)、Bio-Rex 5、DEAEBio-Gel 1、Macro-Prep DEAE、可 从Eichrom Technologies Inc.获得的1型阴离子交换树脂、可从GE Healthcare获得的 Source Q、ANX S印harose4、DEAE S印harose (例如 CL-6B、FF 型)、Q S印harose、Capto Q、CaptoS、可从 PerkinElmer 获得的 AX-300、可从 Shoko America Inc.获得的 Asahipak ES-502C、AXpak WA (例如 624、G 型)、IEC DEAE,可从 TosohBioscience GmbH 获得的
Amberlite IRA"96> Toyopearl DEAE, TSKgelDEAE、可从 Pall Corporation 获得的 Mustang Q0在一个实施方案中，阳离子交换材料是磺丙基阳离子交换材料。术语“相同类型的阳离子交换材料”表示采用完全一致的阳离子交换材料进行两 个连续的离子交换色谱步骤。这意味着，所述连续的阳离子交换色谱步骤是通过对第一个 阳离子交换色谱步骤使用第一份阳离子交换材料并且对第二个阳离子交换色谱步骤使用 第二份相同的阳离子交换材料或者对两个阳离子交换色谱步骤使用相同的阳离子交换材 料来进行的。在一个实施方案中，第二阳离子交换材料与第一阳离子交换材料是相同类型 的阳离子交换材料，但不是同一份阳离子交换材料。术语“分步洗脱”和“分步洗脱方法”在本申请中可互换使用，表示一种方法，其中 例如导致洗脱(即结合的化合物从材料上解离下来)的物质的浓度立刻升高或降低，即从 一个值/水平直接升高或降低至下一个值/水平。在该“分步洗脱”中，一个或多个条件例 如PH、离子强度、盐浓度和/或色谱流速均立刻从第一值、例如起始值变为第二值、例如最 终值，即条件是递增变化的，即不同于线性变化的步进变化。在“分步洗脱方法”中，离子强 度每次升高后均收集新的级分。该级分含有随着离子强度的相应增加从离子交换材料上回 收的化合物。每次增加后，保持条件不变，直到洗脱方法的下一步骤。在“分步洗脱”中，一个 或多个条件均立刻从第一值、例如起始值变为第二值、例如最终值。在一个实施方案中，所 述变化是导致洗脱的物质浓度的10%或10%以上。也就是说，在该实施方案中，导致洗脱 的物质的浓度在第一步中是100%，在第二步中是110%或110%以上，在第三步中是120% 或120%以上。在另一个实施方案中，所述变化是导致洗脱的物质的浓度的50%或50%以 上。在另一个实施方案中，所述变化是导致洗脱的物质的浓度的120%或120%以上。“分步洗脱”表示条件是递增变化的，即不同于线性变化的步进变化。术语“连续洗脱”和“连续洗脱方法”在本申请中可互换使用，表示一种方法，其中 例如导致洗脱(即结合/吸附的化合物从色谱材料上解离下来)的物质的浓度连续升高或 降低，即浓度通过一个序列的多个小步骤进行变化，每个小步骤的变化不大于引起洗脱的 物质的浓度的2%、优选1%。在该“连续洗脱”中，一个或多个条件例如pH、离子强度、盐浓 度和/或色谱流速可以线性或指数式或渐近地变化。优选所述变化是线性的。本申请中所用的术语“加样”及其语法上的等价表述表示纯化方法的一个部分步 骤，其中使含有待纯化的感兴趣的物质的溶液与固定相接触。这表示a)将溶液加入固定 相位于其中的色谱装置中，或b)将固定相加入溶液中。在a)的情况下，含有待纯化的感 兴趣的物质的溶液通过固定相、从而使固定相与溶液中的物质相互作用而被纯化。根据条 件例如PH、电导率、盐浓度、温度和/或流速，溶液中的一些物质与固定相结合，从而被从 溶液中除去。其它物质留在溶液中。留在溶液中的物质能在穿流液中找到。“穿流液”表 示通过色谱装置后获得的溶液，其可以是加样的含有感兴趣的物质的溶液或者用于冲洗柱 或导致一种或多种与固定相结合的物质洗脱的缓冲液。在一个实施方案中，色谱装置是 柱或板(cassette)。能通过本领域技术人员熟悉的方法例如沉淀法、盐析法、超滤、渗滤 (diafiltration)、冷冻干燥、亲和色谱法或减少溶剂体积从纯化步骤后的溶液中回收感兴 趣的物质，从而以基本均质的形式获得感兴趣的物质。在b)的情况下，将固定相加入、例如 以固体形式加入含有待纯化的感兴趣的物质的溶液中，从而使固定相与溶液中的物质相互 作用。相互作用后，取出固定相，例如通过过滤取出固定相，感兴趣的物质与固定相结合，与 其一起从溶液中被取出，或者感兴趣的物质不与固定相结合，留在溶液中。本申请中所用的术语“在适于......结合的条件下”及其语法上的等价表述表示
感兴趣的物质例如PEG化的红细胞生成素当与固定相例如离子交换材料接触时与之结合。 这不必然表示100%感兴趣的物质与固定相结合，而表示基本100%感兴趣的物质与固定 相结合，即至少50%感兴趣的物质与固定相结合、至少75%感兴趣的物质与固定相结合、 至少85%感兴趣的物质与固定相结合或者95%以上感兴趣的物质与固定相结合。本申请中所用的术语“缓冲”表示其中由于酸性或碱性物质的加入或释放导致的 PH变化被缓冲物质所消除。能使用任何产生该效果的缓冲物质。优选使用可药用的缓冲物 质，例如磷酸或其盐、乙酸或其盐、柠檬酸或其盐、吗啉、2-(N-吗啉代)乙磺酸或其盐、组氨 酸或其盐、甘氨酸或其盐或者三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)或其盐。在一个实施方案中， 使用磷酸或其盐或者乙酸或其盐或者柠檬酸或其盐或者组氨酸或其盐作为缓冲物质。缓冲 溶液可以任选包含另外的盐，例如氯化钠、硫酸钠、氯化钾、硫酸钾、柠檬酸钠或柠檬酸钾。本领域技术人员了解一般的色谱方法及其使用。参见例如Chromatography， 第 5 版，A 部 分！Fundamentals and Techniques, Heftmann, Ε·(编 辑)，Elsevier Science Publishing Company, 纽 约，(1992) ；Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Deyl, Z.(编辑)，Elsevier Science BV,阿 姆斯特丹，荷兰，(1998) ；Chromatography Today, Poole, C. F.，和 Poole，S. K.，Elsevier SciencePublishing Company，纽约，(1991) ；Scopes, Protein Purification :Principles and Practice (1982) ；Sambrook, J·等人(编■ )，MolecularCloning :A Laboratory Manual,第 2 版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, N. Y.,1989 ；或 Current Protocols in MolecularBiology, Ausubel, F. Μ.等人(编辑)，John ffiley&Sons, Inc.，纽约。红细胞生成素的PEG化通常产生不同化合物的混合物，所述不同化合物例如多 PEG化的红细胞生成素、单PEG化的红细胞生成素、未-PEG化的红细胞生成素、活性PEG酯 的水解产物例如游离的PEG化的酸以及红细胞生成素本身的水解产物。为了获得基本同质 的形式的单PEG化的红细胞生成素，必须对这些物质进行分离，必须纯化感兴趣的化合物。因此，本发明的一个方面提供了获得基本同质的形式的单PEG化的红细胞生成素 的方法，其包括以下步骤a)使用分子量为20kDa至40kDa的活性PEG化试剂将红细胞生成素PEG化，b)使用两个连续的阳离子交换色谱步骤纯化步骤a)中获得的PEG化的红细胞生 成素，其中第一个和第二个阳离子交换色谱步骤采用相同类型的阳离子交换材料，c)从第二阳离子交换色谱柱上回收基本同质的形式的单PEG化的红细胞生成素。该方法尤其用于纯化PEG化的重组多肽，所述多肽是糖基化的，即其已被哺乳动 物细胞、优选CHO细胞、HEK293细胞、BHK细胞、Per.C6 细胞或HeLa细胞产生并且之后被 化学PEG化。在所述方法的第一步中，红细胞生成素被PEG化。PEG化反应中所用的聚(乙二 醇)(PEG)聚合物分子具有约20kDa至40kDa的分子量(此处所用的“分子量”应当被理解 为PEG的平均分子量，因为PEG作为聚合物不是以一种确定的分子量被获得的，事实上是具 有一种分子量分布；术语“约”表示在所述的PEG制品中，一些分子的重量大于标示分子量， 一些分子的重量小于标示分子量，即术语“约”是指这样一种分子量分布其中95%的PEG 分子具有+/-10%标示分子量以内的分子量。例如，30kDa的分子量表示27kDa至33kDa的 范围。术语“红细胞生成素”是指具有序列SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 2的蛋白质，或 者基本上与之同源的蛋白质或多肽，其生物学性质与刺激红细胞产生和刺激骨髓中定向红 系祖细胞的分裂和分化有关。可以利用重组DNA技术或利用内源性基因活化通过在真核细 胞中例如在CHO细胞或BHK细胞或Hela细胞中表达来制备重组红细胞生成素。例如，如 US 5，733，761、US 5，641，670、US 5，733，746、WO 93/09222、WO 94/12650、WO 95/31560、 WO 90/11354、WO 91/06667和WO 91/09955中所报道的那样，通过内源性基因活化表达红 细胞生成素糖蛋白。在一个实施方案中，本发明的红细胞生成素基于人EPO的序列。在另 一个实施方案中，人红细胞生成素具有SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2中所列出的氨基酸序 列，优选地，人红细胞生成素具有SEQ ID NO :1中所列出的氨基酸序列。术语“红细胞生成 素”还表示SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2的蛋白质的变体，其中一个或多个氨基酸残基被 改变、缺失或插入，并且其具有与未修饰的蛋白质相同的生物学活性，例如EP 1064951或 US 6，583，272中所报道的那些。变体可以具有含有1_6个另外的糖基化位点的人红细胞生 成素的氨基酸序列。PEG化的红细胞生成素的比活性能通过本领域已知的多种测定法来测 定。本发明的纯化的PEG化的红细胞生成素的生物活性使得通过给人类患者注射施用所述 蛋白质导致其骨髓细胞与未注射或对照组的患者相比网织红细胞和红细胞的产生增加。能 通过 Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2)的方法测试根据本发 明获得和纯化的PEG化的红细胞生成素的生物活性。
本发明的“PEG”或“PEG基团”意指含有聚(乙二醇)作为基本部分的残基。所述 PEG能含有对于结合、即缀合、反应而言必要的其它化学基团，其由分子的化学合成产生，或 者就分子各部分的最佳距离而言其是间隔基。这些其它化学基团不用于计算PEG聚合物分 子的分子量。此外，所述PEG能由一个或多个连接在一起的PEG侧链组成。具有一个以上 PEG链的PEG被称为多臂或分支PEG。分支PEG能例如通过将聚环氧乙烷加入各种多元醇 (包括甘油、季戊四醇和山梨醇)中来制备。分支PEG在例如EP 0473084,US 5，932，462中 有描述。在一个实施方案中，使用线性PEG分子作为分子量为20-35kDa的PEG，使用分支 PEG作为分子量大于35kDa、尤其是分子量为40kDa的PEG聚合物。在一个实施方案中，使 用双臂PEG作为PEG 40kDa。术语“PEG化”意指聚(乙二醇)残基在内在赖氨酸残基和/或多肽的N-末端 处的共价连接。蛋白质的PEG化在现有技术中是公知的，综述于例如Veronese，F. Μ.， Biomaterials 22 (2001) 405-417中。能使用不同的官能团和具有不同分子量的聚乙二 醇、线性和分支PEG以及不同的连接基团连接PEG(还参见Francis，G. Ε.等人，Int. J. Hematol. 68(1998) 1-18 ；Delgado, C.等 人，Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Systems 9(1992)249-304)。能如例如WO 00/44785中所述用PEG化试剂在水溶液中进行红细胞 生成素的PEG化，在一个实施方案中，使用NHS-活性线性或分支PEG分子(分子量为 5kDa至40kDa)进行红细胞生成素的PEG化。也能根据Lu，Y.等人，ReactivePolymers 22(1994)221-229在固相上进行PEG化。非任意地，N-末端PEG化的多肽也能根据WO 94/01451 制备。所述方法产生了在赖氨酸残基的一个或多个ε -氨基处和/或在N-末端氨基处 被PEG化的红细胞生成素。在N-末端氨基酸处的选择性PEG化能根据Felix，A.M.等人， ACS Symp. Ser. 680 (Poly (ethylene glycol)) (1997)218-238 进行。选择性 N-末端 PEG 化 能在固相合成过程中通过将N α -PEG化的氨基酸衍生物偶联到肽链的N-I末端氨基酸上来 实现。侧链PEG化能在固相合成过程中通过将Ne-PEG化的赖氨酸衍生物偶联到生长链上 来进行。如上所述在固相合成内或通过将活性PEG试剂加至氨基脱保护的肽上经由液相合 成进行N-末端和侧链的组合PEG化是可行的。合适的PEG衍生物是平均分子量为约5至约40kDa的活性PEG分子，在一个实施 方案中是平均分子量为约20至约40kDa、优选约30kDa至约35kDa的活性PEG分子。在一 个实施方案中，PEG衍生物是线性或分支PEG。适合用于制备PEG-蛋白质和PEG-肽缀合物 的各种 PEG 衍生物能从 Shearwater Polymers (Huntsville, AL, U. S. Α. ；www. nektar. com)获得。活性PEG衍生物在本领域中是已知的，其在例如Morpurgo，M.等人，J. Bioconjug. Chem. 7 (1996) 363-368中有描述(针对PEG-乙烯基砜)。线性链和分支链PEG种类适合用 于制备PEG化的片段。活性PEG试剂的实例有碘-乙酰基-甲氧基-PEG或甲氧基-PEG-乙 烯基砜(m优选是约450至约900的整数，R是具有1至6个碳原子的直链或支链C1-至 C6-烷基，例如甲基、乙基、异丙基等，其中在一个实施方案中R =甲基) 这些碘代活性物质的使用是本领域已知的，例如Hermanson，G. T在Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996) p. 147-148 中对其进行了描述。在一个实施方案中，所述PEG种类是活性PEG酯，例如丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯 或丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯或N-羟基琥珀酰亚胺类例如PEG-NHS (Monfardini, C.等人， Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69)。在一个实施方案中，所述活性N-羟基琥珀酰亚胺酯 是 使用烷氧基-PEG-N-羟基琥珀酰亚胺，例如甲氧基-PEG-N-羟基琥珀酰亚胺(MW 30000 ；Shearwater Polymers，Inc.)，其中R和m如上文所定义。在一个实施方案中，所述 PEG种类是甲氧基聚(乙二醇)_ 丁酸的N-羟基琥珀酰亚胺基酯。术语“烷氧基”是指烷 基醚基团，其中术语“烷基”意指含有至多4个碳原子的直链或支链烷基，例如甲氧基、乙氧 基、正-丙氧基等，优选甲氧基。本申请中所用的术语“基本同质的形式”表示所获得的、所含有的或所使用的PEG 化的红细胞生成素是具有确定数量的附加PEG基团的那些。在一个实施方案中，PEG化的红 细胞生成素是单PEG化的红细胞生成素。该制品可以含有未反应的(即缺少PEG基团的) 红细胞生成素、多PEG化的红细胞生成素以及在PEG化反应过程中产生的多肽片段。在一个 实施方案中，术语“基本同质的形式”表示单PEG化的红细胞生成素制品含有至少50% (w/ w)单PEG化的红细胞生成素、至少75%单PEG化的红细胞生成素、至少90%单PEG化的红 细胞生成素或95%以上单PEG化的红细胞生成素。所述百分比数值是以对应于由其获得单 PEG化的红细胞生成素的阳离子交换色谱纯化的色谱图的面积％为基础的。本申请报道了一种纯化单PEG化的红细胞生成素以获得基本同质的形式的单PEG 化的红细胞生成素的方法。已经令人惊讶地发现，采用相同类型的阳离子交换材料的两 个连续的阳离子交换色谱步骤的组合提供了基本同质的形式的单PEG化的红细胞生成素。 因此本发明提供了一种纯化单PEG化的红细胞生成素的方法，其包括以下步骤提供包含 单_、多-和未-PEG化的红细胞生成素的溶液，进行两个连续的阳离子交换色谱步骤，和回 收在第二个阳离子交换色谱步骤中纯化的单PEG化的红细胞生成素，其中在所述两个阳离 子交换色谱步骤中使用相同类型的阳离子交换材料。在一个实施方案中，第一个阳离子交 换色谱步骤中的回收与第二个阳离子交换色谱步骤中的回收是通过不同的洗脱方法进行的。在另一个实施方案中，阳离子交换色谱柱在第一个阳离子交换色谱步骤后和在第二个 阳离子交换色谱步骤后被再生。在第二个阳离子交换色谱步骤中，回收纯化的单PEG化的红细胞生成素是通过从 第二阳离子交换色谱材料上洗脱单PEG化的红细胞生成素进行的。在本发明的方法的一个 实施方案中，两个阳离子交换色谱步骤采用的洗脱方法不同。在该实施方案中，第一个阳离 子交换色谱步骤以分步洗脱方法进行，即所用缓冲液的离子强度步进增加，即从一个离子 强度值立刻变为下一个离子强度值，优选以10%或10%以上的变化步进增加。在一个实施 方案中，该分步洗脱方法以三步洗脱方法进行。在第一步中，主要将多PEG化的红细胞生成 素从阳离子交换色谱柱上洗脱下来。离子强度的第二次增加基本上将单PEG化的红细胞生 成素洗脱下来，基于对应的尺寸排阻色谱图面积，其纯度大于60% (面积_%)。离子强度 的第三次增加主要将剩余的未PEG化的红细胞生成素从柱上洗脱下来。在一个实施方案中，第二个阳离子交换色谱步骤以连续洗脱方法进行，即缓冲液 的离子强度连续增加、优选以小于5%的变化连续增加。合并洗脱的含有单PEG化的红细胞 生成素的级分以获得基本同质的形式的单PEG化的红细胞生成素。在一个实施方案中，基 于对应的色谱图的面积其含有小于0.5%的低分子量形式。缓冲液的浓度优选是IOmM至 250mM,在一个实施方案中是50mM至150mM，在另一个实施方案中是约100mM。因此，在本发 明的方法中，所述两个连续的阳离子交换色谱步骤是以下步骤a)在适于所述单PEG化的红细胞生成素与第一阳离子交换色谱柱中所含有的阳 离子交换材料结合的条件下，将包含单-、多-和未-PEG化的红细胞生成素以及低分子量形 式的混合物的缓冲水溶液加样在所述第一柱上，b)利用穿流缓冲液的离子强度步进增加的分步洗脱方法从第一阳离子交换色谱 柱上回收单PEG化的红细胞生成素，其中与步骤a)中加样的混合物相比，所述单PEG化的 红细胞生成素在回收溶液中的相对含量增加，c)在适于所述红细胞生成素与第二阳离子交换色谱柱中所含有的阳离子交换材 料结合的条件下，将步骤b)中回收的单PEG化的红细胞生成素加样在所述第二柱上，其中 所述第二柱中所含有的阳离子交换材料与第一柱中的阳离子交换材料是相同类型的，d)利用穿流缓冲液的离子强度连续增加的连续洗脱方法从所述第二阳离子交换 色谱柱上回收基本同质的形式的纯化的单PEG化的红细胞生成素。多肽的PEG化通常不提供同质的形式的PEG化产物。其以单PEG化、多PEG化和 未PEG化产物的混合物的形式被获得。因此，所述方法的步骤a)中加样的PEG化的红细胞 生成素的溶液是单_、多-和未-PEG化的红细胞生成素以及低分子量形式或片段在缓冲水 溶液中的混合物。这些不同物质的相对含量是用尺寸排阻色谱法(SE-HPLC)测定的。图1 给出了一幅举例性的色谱图。图1中相关峰面积、即峰下面积的总和是尺寸排阻色谱图的 总面积。单个峰的分数以面积_%、即色谱图总面积的相对面积分数的形式给出。—般色谱方法、其使用和有关术语是本领域技术人员已知的，参见例如 Chromatography,第 5 版，Part A !Fundamentals and Techniques, Heftmann, Ε.(编辑), Elsevier Science Publishing Company，纽约，(1992)和其它相关教科书。在色谱处理过 程中，缓冲液穿过阳离子交换色谱柱流动。根据色谱方法步骤的要求对该“穿流缓冲液”进 行调节。其将感兴趣的物质运送至(加样)并运送出(洗脱)色谱材料。
在第一个阳离子交换色谱步骤中，将单PEG化、多PEG化和未PEG化的红细胞生成 的混合物以0. 7至1. 5mg/ml、优选约lmg/ml的蛋白质浓度在缓冲水溶液中加样到第一阳 离子交换色谱柱上。在一个实施方案中，所述缓冲水溶液含有约IOOmM磷酸钾，pH约3.0。 本申请中所用的术语“约”表示给定值10%左右、即士 10%的范围。在一个实施方案中，在 加样前和加样后，将所述第一柱用相同的缓冲液洗涤。在洗脱方法的第一步中，将缓冲液 变为含有约IOOmM磷酸钾、约90mM氯化钠的pH约3. 0的缓冲液。用该缓冲液将水解的活 性PEG试剂、即相应的PEG化的碳酸、未反应的偶联试剂和多PEG化的红细胞生成素从阳离 子交换色谱柱上洗脱下来。在三步洗脱方法的第二步中，将缓冲液变为含有约IOOmM磷酸 钾、约250mM氯化钠的pH约3. 0的缓冲液。在该步中单PEG化的红细胞生成素被从第一阳 离子交换色谱柱上回收。将收集的该洗脱步骤的穿流缓冲液用纯水稀释约1 5(v/v)至 1 8(v/v)、优选1 5(v/v)。图2给出了一幅举例性的第一阳离子交换色谱图。在三步 洗脱方法的第三步中，将缓冲液变为含有约IOOmM磷酸钾、约750mM氯化钠的pH约3. 0的 缓冲液。在该步中未-PEG化的红细胞生成素被从第一阳离子交换色谱柱上回收。收集的第一阳离子交换色谱的第二步的穿流缓冲液含有相对含量增加的单PEG 化的红细胞生成素，即与第一个阳离子交换色谱步骤之前相比，单PEG化的红细胞生成素 的重量或面积(在收集的第二步的穿流缓冲液的尺寸排阻色谱法的色谱图中)分数增 加。在一个实施方案中，单PEG化的红细胞生成素的相对含量是至少60面积-%。在另一 个实施方案中，单PEG化的红细胞生成素的相对含量是至少80面积。为了进一步纯化单PEG化的红细胞生成素，进行第二个阳离子交换色谱步骤。在 该第二阳离子交换色谱中，将被调节至磷酸钾浓度为约IOOmM且pH为约3. 0的收集的和稀 释的第二个洗脱步骤的穿流缓冲液加样到含有与第一阳离子交换色谱柱相同类型的阳离 子交换材料的第二阳离子交换色谱柱上。在一个实施方案中，第二阳离子交换柱和其中所 含有的阳离子交换材料与第一个阳离子交换色谱步骤中的相同。通过应用线性梯度从第二 阳离子交换色谱柱上回收单PEG化的红细胞生成素，所述线性梯度以pH约3. 0的含有约 50mM氯化钠的浓度约IOOmM的磷酸钾缓冲液开始，以pH约3. 0的含有约500mM氯化钠的浓 度约IOOmM的磷酸钾缓冲液结束。氯化钠浓度历经十倍柱体积的变化是线性的。分级收集 穿流缓冲液，将每个级分用IM磷酸氢二钾稀释以将pH值升高至约pH 6-8。图3给出了一 幅举例性的色谱图。在第二个阳离子交换色谱步骤后，获得了基本同质的形式的单PEG化的红细胞生 成素，在一个实施方案中其纯度为以面积计至少95%。本领域技术人员熟知离子交换色谱技术。在回收与阳离子交换材料结合的多肽的 步骤中，增加穿过离子交换柱的缓冲液/溶液的离子强度，即电导率。这能通过增加缓冲盐 浓度或通过向缓冲液中加入其它盐(所谓的洗脱盐)来实现。根据洗脱方法的不同，通过 分级加入缓冲盐或洗脱盐浓溶液立刻(分步洗脱方法)或连续(连续洗脱方法)增加缓冲 液/盐浓度。优选的洗脱盐有柠檬酸钠、氯化钠、硫酸钾、磷酸钠、氯化钾、硫酸钾、磷酸钾或 其它柠檬酸或磷酸盐，或这些组分的任意混合物。在一个实施方案中，洗脱盐是柠檬酸钠、 氯化钠、氯化钾或其混合物。在本方法的一个实施方案中，阳离子交换材料是强阳离子交换材料，例如优选 Toyopearf SP 650M。在一个实施方案中，导致洗脱的盐浓度在5mM至500mM范围内，优选在5mM至400mM范围内，更优选在5mM至250mM范围内。在本发明的另一个实施方案中， 导致洗脱的盐同时被用作缓冲物质，例如柠檬酸或其盐或者磷酸或其盐。单PEG化的红细胞生成素可以通过本领域已知的方法与可药用的载体或介质一 起用在适于注射的药物组合物中。例如，适宜的组合物已经在WO 97/09996、W0 97/40850、 WO 98/58660和WO 99/07401中有描述。其中用于配制本发明的产品的优选的可药用的载 体有人血清白蛋白、人血浆蛋白质等。本发明的化合物可以配制在含有张度剂例如132mM 氯化钠的PH 7的IOmM磷酸钠/钾缓冲液中。药物组合物可以任选含有防腐剂。药物组合物 可以含有不同量的单PEG化的红细胞生成素，例如10-1000 μ g/ml，例如50μ g或400μ g。施用本发明的红细胞生成素糖蛋白产品导致人体内红细胞的形成。因此，施用单 PEG化的红细胞生成素糖蛋白产品是对这种在红细胞产生中起重要作用的红细胞生成素蛋 白质的增补。可以将含有单PEG化的红细胞生成素糖蛋白产品的药物组合物配制成对通过 各种方法施用于人类患者而言有效的强度，所述人类患者患有以低红细胞产生或缺陷性红 细胞产生为特征的血液障碍，其是独立的障碍或者是病症或疾病的一部分。药物组合物可 以通过注射例如皮下或静脉内注射进行施用。单PEG化的红细胞生成素糖蛋白产品的平均 量可以变化。缀合物的精确量取决于诸如所治疗的病症的确切类型、所治疗患者的情况以 及组合物中的其它成分等因素。例如，可以施用0.01至10 μ g/kg体重，优选0. 1至Iyg/ kg体重，例如每周施用一次。提供下文的实施例、序列表和附图目的在于帮助理解本发明，本发明的实际范围 在所附的权利要求中给出。应当理解的是，在不背离本发明的主旨的情况下能对所给出的 操作进行修改。


图1不同PEG化的红细胞生成素的混合物的SE-HPLC，包括峰和物质的相关性。图2分步洗脱方法的举例性色谱图。图3连续洗脱方法的举例性色谱图。材料和方法SE-HPLCSE-HPLC根据蛋白质的表观分子量对其进行分离。因此，该方法能检测单PEG化 的红细胞生成素、低分子量形式和片段、多PEG化的形式和红细胞生成素的高级聚集物 的存在。HPLC 装配有 220-nm 检测器和 Superose 6HR 柱(尺寸 10X 300mm，Pharmacia Biotech, Cat-Nr 17-0537-01)或 Superose 6 10/300GL 柱(Pharmacia Biotech,Cat-Nr 17-5172-01)。色谱柱于室温在等浓度条件下操作，流速约0. 4ml/min。流动相缓冲液是pH 6. 8的含有300mM氯化钠的50mM磷酸钠缓冲液。根据所用的HPLC系统，该方法能以100 μ L 或500 μ L的进样体积进行。将样品用流动相缓冲液稀释至蛋白质浓度为约0. 5mg/mL(进 样100 μ L)或0. lmg/mL (进样500 μ L)。蛋白质浓度低于0. lmg/mL的样品能不经稀释使 用。将洗脱的蛋白质在220nm检测波长下进行检测。实施例1红细胞生成素的发酵和纯化红细胞生成素能例如根据WO 01/87329制备，如WO 96/135718中所报道的那样纯化。实施例2施用双功能试剂进行红细胞生成素的PEG化a)红细胞生成素的活化向苄基保护的红细胞生成素溶液(此处是向Iml 5mg/ml蛋白质在IOmM磷酸钾缓 冲液中的溶液，其中添加有50mM氯化钠，pH7. 3)中加入规定量的含有被保护的硫羟基的试 剂SATA(乙酰基硫代乙酸琥珀酰亚胺酯)或SATP(乙酰基硫代丙酸琥珀酰亚胺酯)(溶于 DMSO, 10mg/ml)。搅拌反应混合物约30分钟(在25°C下)，通过加入IM赖氨酸溶液至终浓 度为IOmM停止反应。通过用pH 6. 2的包含50mM氯化钠和2mM EDTA的IOmM磷酸钾缓冲 液进行透析除去过量的SATA和SATP。用羟胺除去保护的乙酰基。b)活化的红细胞生成素的PEG化将380mg 甲氧基-PEG-马来酰亚胺(MW 30. OOO ；Shearwater Polymers, Inc.， Huntsville (Alabama, USA))溶于含有95mg活化的红细胞生成素的溶液(4. 5mg/ml，在pH 6. 2的含有50mM氯化钠和2mM EDTA的IOmM磷酸钾缓冲液中)。所得的溶液中的活化的红 细胞生成素与甲氧基-PEG-马来酰亚胺的摩尔比为1 2至1 4。通过向上述溶液中加 入IM羟胺水溶液至终浓度为30mM(pH 6. 2)，将活化的红细胞生成素的共价连接的被保护 的硫羟基去保护。所得的在溶液反应混合物中的活化的红细胞生成素含有游离的硫羟基 (-SH)。将硫羟基去保护后，立即将现在含有游离硫羟基(-SH)的活化的红细胞生成素与甲 氧基-PEG-马来酰亚胺进行偶联反应90分钟(搅拌，在25°C下)。通过向反应混合物中加 入0. 2M半胱氨酸水溶液至终浓度为2mM停止偶联反应。30分钟后，通过加入0. 5M N-甲基 马来酰亚胺在DMSO中的溶液至终浓度为5mM对未与甲氧基-PEG-马来酰亚胺反应的活化 的红细胞生成素的过量游离硫羟基进行保护。30分钟后，所得的现在含有PEG化的红细胞 生成素的反应混合物能被纯化。实施例3单PEG化的红细胞生成素的纯化a)在SP Toyopearl 650M上进行的第一个色谱步骤产品的第一个色谱步骤在填充有SP Toyopearl 650M的磺丙基(SP)柱上进行。该 柱在室温下操作。第一柱的最大荷载能力被定义为1.5g蛋白质/升柱体积(CV)。将柱用 PH 2. 9-3. 1的IOOmM磷酸钾缓冲液(SP-A缓冲液)平衡。在上样步骤后，洗柱，用一系列含 有增加量的NaCl的磷酸钾缓冲液洗脱。水解的PEG试剂和多PEG化的形式在穿流液中以 及在随后的分别用SP-A缓冲液和含有90mM氯化钠的pH 2. 9-3. 1的IOOmM磷酸钾缓冲液 (SP-B缓冲液)进行的洗涤步骤中被除去。使用含有250mM氯化钠的pH 2. 9-3. 1的IOOmM磷酸钾缓冲液(SP-C缓冲液)洗 脱单PEG化的红细胞生成素，收集至容器中，直接用纯水1 5稀释。该收集的洗脱液称为 "SP洗脱液集合I”。随后用含有750mM氯化钠的pH 2. 9-3. 1的IOOmM磷酸钾缓冲液(SP-D缓冲液) 洗柱，以除去未反应的红细胞生成素和将柱再生。b)在SP Toyopearl 650M上进行的第二个色谱纯步骤第二柱在室温下操作。用SP-A缓冲液平衡后，将SP洗脱液集合I加样到柱上，随后用SP-A缓冲液洗柱。使用被pH 2.9-3. 1的IOOmM的磷酸钾缓冲液缓冲的斜率为 50-500mM氯化钠的线性梯度(历经10倍柱体积)洗脱单PEG化的红细胞生成素。将产物 峰分级收集在至多8个单独的级分中，将每个级分直接用IM磷酸氢二钾稀释以使pH增加 至 6-8。单PEG化的红细胞生成素洗脱完全后，可增加梯度的斜率，从而立即用含有500mM 氯化钠的PH 2. 9-3. 1的IOOmM磷酸钾洗柱。c) SP Toyopearl 650M 柱的再生将两根柱的树脂通过一个7步顺序再生。将柱用纯水冲洗，随后用0. 5M氢氧化钠 溶液冲洗。用纯水置换碱溶液，随后用酸(0. 5M磷酸二氢钠，IM磷酸)洗涤。在进行另一个 纯水步骤后，将柱用0. 5M氢氧化钠除热原> 4小时。腐蚀性再生后，将柱再次用纯水洗涤。 关于柱参数的总结，参见表1和表2。表1 第一色谱柱参数 n. a.不适用表2 第二色谱柱参数 n. a.不适用
权利要求
纯化单PEG化的红细胞生成素的方法，其包括以下步骤提供包含单-、多-和未-PEG化的红细胞生成素的溶液，进行两个连续的阳离子交换色谱步骤，和回收在第二个阳离子交换色谱步骤中纯化的单PEG化的红细胞生成素，其特征在于，在两个阳离子交换色谱步骤中使用相同类型的阳离子交换材料。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述方法中，两个连续的阳离子交换色 谱步骤是用不同的洗脱方法进行的。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，两个连续的阳离子交换色谱步骤包括以 下步骤a)在适于所述单PEG化的红细胞生成素与第一阳离子交换色谱柱中所含有的阳离子 交换材料结合的条件下，将包含单_、多_、未-PEG化的红细胞生成素以及低分子量形式的 混合物的缓冲水溶液加样在所述第一柱上，b)利用穿流缓冲液的离子强度步进增加的分步洗脱方法从第一阳离子交换色谱柱上 回收单PEG化的红细胞生成素，其中与加样的混合物相比，所述单PEG化的红细胞生成素在 回收溶液中的分数增加，c)在适于所述单PEG化的红细胞生成素与第二阳离子交换色谱柱中所含有的阳离子 交换材料结合的条件下，将步骤b)中回收的单PEG化的红细胞生成素加样在所述第二柱 上，其中所述第二柱中所含有的阳离子交换材料与第一柱中的阳离子交换材料是相同类型 的，d)利用穿流缓冲液的离子强度连续增加的连续洗脱方法从所述第二阳离子交换色谱 柱上回收基本同质的形式的纯化的单PEG化的红细胞生成素。
4.根据前面任意一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述阳离子交换材料是磺丙 基阳离子交换材料。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的该方法的步骤b)中的离子强度的 步进增加是三步离子强度增加。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤b)中回收的单PEG化的红细胞生成 素在所述分步洗脱方法的第二步中被回收。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述的步骤b)中，多PEG化的红细胞生 成素在穿流缓冲液的第一次离子强度增加后被回收，单PEG化的红细胞生成素在穿流缓冲 液的第二次离子强度增加后被回收，未PEG化的红细胞生成素在穿流缓冲液的第三次离子 强度增加后被回收。
8.根据权利要求3至7中任意一项所述的方法，其特征在于，在步骤b)的分步洗脱方 法中，导致洗脱的盐浓度的差异在所述分步洗脱方法的各步的每一步中为120%或120% 以上。
9.根据权利要求3至8中任意一项所述的方法，其特征在于，所述缓冲水溶液含有磷酸 或其盐或者柠檬酸或其盐或者组氨酸或其盐作为缓冲物质。
10.根据权利要求3至9中任意一项所述的方法，其特征在于，在所述的步骤d)中，通 过应用线性梯度从第二阳离子交换色谱柱上回收单PEG化的红细胞生成素，所述线性梯度 以PH约3. 0的含有约50mM氯化钠的浓度约IOOmM的磷酸钾缓冲液开始，以pH约3. 0的含 有约500mM氯化钠的浓度约IOOmM的磷酸钾缓冲液结束，其中氯化钠浓度历经十倍柱体积的变化是线性的。
11.制备单PEG化的红细胞生成素的方法，其包括以下步骤a)将红细胞生成素PEG化，b)使用两个连续的阳离子交换色谱步骤纯化单PEG化的红细胞生成素，其中第一个和 第二个阳离子交换色谱步骤采用相同类型的阳离子交换材料，c)从第二阳离子交换色谱柱上回收基本同质的形式的单PEG化的红细胞生成素。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，在所述方法中，两个连续的阳离子交换 色谱步骤是用不同的洗脱方法进行的。
13.根据前面任意一项权利要求所述的方法，其特征在于，第二阳离子交换材料与第一 阳离子交换材料是相同类型的阳离子交换材料，但不是同一份阳离子交换材料。
14.根据前面任意一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述PEG残基在线性PEG的 情况下具有20-35kDa的分子量，在分支PEG的情况下具有40kDa的分子量。
15.根据前面任意一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述单PEG化的红细胞生 成素以基本同质的形式被获得，经尺寸排阻HPLC测定，所述基本同质的形式含有以面积计 95%以上的单PEG化的红细胞生成素。
16.根据前面任意一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述单PEG化的红细胞生成 素在第一个阳离子交换色谱步骤中被回收，经尺寸排阻HPLC测定，纯度为以面积计60%以 上。
17.根据权利要求3至16中任意一项所述的方法，其特征在于，所述缓冲水溶液含有约 IOOmM磷酸钾缓冲物，并且pH为约3. 0。
18.根据前面任意一项权利要求所述的方法，其特征在于，在所述色谱步骤中，溶液的 PH值为约3.0。
19.根据前面任意一项权利要求所述的方法，其特征在于，导致PEG化的红细胞生成素 从阳离子交换柱上洗脱的盐是柠檬酸钠或氯化钠或氯化钾。
20.根据前面任意一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述红细胞生成素具有SEQ ID NO :1或2的氨基酸序列。
全文摘要
本发明包括用于纯化单PEG化的红细胞生成素的方法，其包括两个阳离子交换色谱步骤，其中在两步阳离子交换色谱步骤中使用相同类型的阳离子交换材料，本发明还包括制备基本同质的形式的单PEG化的红细胞生成素的方法。
文档编号C07K14/505GK101889023SQ200880024804
公开日2010年11月17日 申请日期2008年7月15日 优先权日2007年7月17日
发明者A·施罗特, A·维斯纳, H·舒里格, J·伯格, K·雷彻特 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司