通过模拟移动床层析纯化多肽的方法

专利名称：通过模拟移动床层析纯化多肽的方法
技术领域：
本发明涉及使用模拟移动床层析(simulated moving bedchromatography)来纯化多肽的方法以及适于纯化多肽的模拟移动床层析系统和装置。
背景技术：
和介绍用于蛋白质纯化的层析分离通常以批处理方式(batch mode)来进行，即，使用单个填充柱并随后进行平衡、装载、洗涤、洗脱和再生/净化。该方式导致过程比较长而总产量相当低。此外，由于批处理方式中蛋白质吸收的动力学限制，层析柱只能装载至它们所谓的动态负载量(capacity)，其通常是它们平衡负载量的30至50％。如果该柱子在平衡中运行，这依次需要使用体积是通常所需的2到3倍的柱子。由于蛋白质层析树脂非常昂贵，这具有增加产品纯化成本的主要经济后果。此外，批处理柱层析中的洗涤和洗脱过程需要相当大的流体体积，其也是由于批处理方式操作中，由于使用的纯化水必须是特殊处理的而具有的经济后果。
模拟移动床(SMB)层析已经用于石化和矿业中。还发现SMB层析应用于医药工业中来分离对映体。
SMB层析的其他应用包括，例如，从果糖-葡萄糖溶液中分离果糖和从甜菜或甘蔗糖浆中分离蔗糖。通过离子交换树脂有差异地吸收溶液成分以致在模拟移动床中显现分离波形。
发明概述本发明涉及使用模拟移动床(“SMB”)层析通过与至少一种非本质(immaterial)成分分离来纯化免疫反应性蛋白质的方法、这些方法中可用的SMB系统和装置、通过SMB层析分离的免疫反应性蛋白质和使用分离的免疫反应性蛋白质治疗患者的方法。
一方面，本发明涉及使用模拟移动床层析将在流体混合物中的免疫反应性化合物与至少一种非本质成分分离的方法。根据这个方面，该方法包括步骤(a)提供模拟移动床装置，其包括流体中进行交流(conducting communication)的多个组件，所述组件包括至少一种固相；(b)将流体混合物连续引入所述模拟移动床装置中，其中流体混合物以逆流方式和所述固相接触；(c)实现免疫反应性化合物与至少一种非本质成分的分离；和(d)收集免疫反应性成分来提供其纯化的成分。根据这方面的一个实施方案，免疫反应性化合物和固相的结合程度比至少一种非本质成分高或低。优选，免疫反应性化合物和固相的结合程度比至少一种非本质成分高。根据另一实施方案，该方法进一步包括通过将促进免疫反应性成分分离的洗脱剂和固相接触来实现所述分离的步骤。合适的洗脱剂包括酸性缓冲剂。合适的固相包括结合蛋白质A或蛋白质G的支持物质。可以使用层析方法如吸附层析、分配层析、离子交换层析、大小排阻层析或亲和层析来实现分离。优选，使用亲和层析实现分离。本发明还涉及根据这些方法制得的免疫反应性化合物。
另一方面，本发明涉及当免疫反应性化合物和至少一种非本质成分两者都存在于流体混合物中时，将免疫反应性化合物与至少一种非本质成分分离的模拟移动床(“SMB”)系统。根据这方面，SMB系统包括多个区域，区域含有逆流地和所述流体混合物接触的固相，其中所述区域包括(i)结合区域，其中免疫反应性化合物和至少一种非本质成分与固相差异结合；(ii)洗涤区域，其中至少一种非本质成分优先与固相分离；和(iii)洗脱区域，其中免疫反应性化合物优先与固相分离。根据一个实施方案，洗涤区域是在结合区域和洗脱区域的中间。固相可以优先和免疫反应性化合物结合。根据该实施方案的一个方面，固相包含用于亲和层析的配体。合适的固相可以包含蛋白质A或蛋白质G。另一合适固相包含阳离子交换树脂。根据该实施方案的一个方面，模拟移动床系统进一步包括洗脱区域和结合区域中间的洗脱洗涤区域。以及，该实施方案可以进一步包括洗脱洗涤区域和结合区域中间的再生区域，以及在再生区域和结合区域中间的平衡区域。本发明还涉及包括使用模拟移动床系统将免疫反应性化合物与至少一种非本质成分分离的方法，以及使用该模拟移动床系统制得的纯化的免疫反应性化合物。
根据另一方面，本发明涉及使用模拟移动床层析从抗体和至少一种非本质成分两者都存在的流体混合物中将抗体与至少一种非本质成分分离的方法，其包括步骤(a)提供模拟移动床装置，包括流体中进行交流的多个组件，所述组件包括至少一种固相，其包含优先和抗体结合的亲和层析配体；(b)将流体混合物连续引入所述模拟移动床装置中，其中流体混合物以逆流方式和固相接触；(c)实现抗体与至少一种非本质成分的分离；和(d)收集抗体来提供其纯化的成分。
再一方面，本发明涉及模拟移动床(“SMB”)系统，用于抗体和至少一种非本质成分两者都存在的流体混合物中将抗体与至少一种非本质成分分离。根据这个方面，SMB系统包括含有固相的多个区域，固相含有亲和树脂，其和流体混合物是逆流地接触，其中所述区域包括(i)结合区域，其中抗体和至少一种非本质成分与固相有差异地结合；(ii)第一洗涤区域，其中至少一种非本质成分优先与固相分离；和(iii)洗脱区域，其中抗体优先与固相分离。
另一方面，本发明涉及使用模拟移动床层析将流体混合物中的免疫反应性化合物与至少一种非本质成分分离的方法，包括步骤(a)提供模拟移动床装置，其包括至少一个与所述装置进行交流的流体中的组件，所述组件包括至少一种固相，且其中所述装置包括多个由组件穿过的区域；(b)将流体混合物连续引入结合区域的组件中，其中流体混合物以逆流方式和固相接触，且其中免疫反应性化合物和固相结合；(c)将洗涤缓冲液连续引入洗涤区域中含有结合的免疫反应性化合物的组件中，其中洗涤缓冲液以逆流方式和固相接触，并基本从所述组件移除至少一种非本质成分；(d)将洗脱缓冲液连续引入洗脱区域中含有结合的免疫反应性化合物的组件中，其中洗脱缓冲液以逆流方式和固相接触，并借此将免疫反应性化合物与固相基本分离；和(e)从组件连续地移除含有免疫反应性化合物的产物流。根据一个实施方案，模拟移动床装置包括多个组件。优选，固相包括亲和配体。合适的亲和配体包括蛋白质A或蛋白质G。根据一方面，免疫反应性化合物包括抗体或抗体片段。本发明还涉及通过这些方法大量制得的纯化的抗体或抗体片段。
根据另一方面，本发明提供了从至少一种非本质成分纯化免疫反应性化合物的改良方法，改进包括使用了含有蛋白质A或蛋白质G固相的模拟移动床亲和层析。
使用本发明SMB方法分离的合适免疫反应性化合物包括抗体和抗体片段。这样的免疫反应性化合物包括结合选自CD20、CD40、CD40L、CD23、CD4、CD80和CD86抗原的那些。
定义根据本发明以及如在此所用的，将以下术语定义成具有以下的意思，除非另外明确地规定术语“免疫反应性化合物”指的是包括来自免疫球蛋白的抗原结合区域和/或恒定区的化合物。一方面，包括结合抗原的化合物。免疫反应性化合物另外可以包括来自非抗体化合物的肽序列，如细胞因子、细胞因子配体和其他抗原。这样的免疫反应性化合物包括抗体、抗体片段、结构域缺失的抗体，或连接另一特定结合成分的抗体或其混合物。结构域缺失的抗体包括如那些WO02/060995中描述的化合物，其所公开的在此引入作为参考。其他免疫反应性化合物包括融合蛋白，其包括免疫球蛋白链和氨基酸序列如配体结合配偶体的氨基酸序列或粘着物氨基酸序列变体融合的区域。这样的融合蛋白包括美国专利No.5,428,130和5,565,335中所描述的那些，其所公开的在此引入作为参考。
在此术语“抗体”以最宽的理解来使用并特别涵盖完整的单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两个完整抗体形成的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、人源化抗体、灵长类源化抗体、结构域缺失抗体，和抗体片段，只要它们显示了所需的生物活性。
“抗体片段”包括完整抗体的一部分，优选包括抗原结合区域或其可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)Z，和Fv片段；双体；线性抗体；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。结构域缺失抗体也可以考虑为抗体片段用于本发明的目的，该抗体含有其中一个或多个恒定区的至少一部分已经改变或删除来提供改良生理特性(例如缩短了血清半衰期)的免疫球蛋白。优选实施方案中，结构域缺失的抗体包括缺失CH2结构域的恒定区。
“层析”指的是任何用于混合物和成分化学分离的分析技术，其依赖于混合物中成分对于固相的选择性吸附。实例包括吸附层析、分配层析、离子交换层析、大小排阻层析，和亲和层析。
在此所用的“吸附剂”通常指的是层析中所用的固相，对其移动相成分显示了选择性的亲和性。因为这样的亲和性可以采取吸附以外的各种方式(包括大小排阻或络合)，所以该术语指的是吸附混合物中成分的固相和非技术上从移动相吸附成分的固相，但是通过减缓了层析系统中一种成分相对于另一种成分的迁动速度其仍然起吸附剂的作用。
当涉及成分或级分时“纯化的”表明其相对浓度(成分或级分的重量除以混合物中所有成分或级分的重量)至少增加20％。一系列实施方案中，相对浓度至少增加40％、50％、60％、75％、100％、150％或200％。当从其得到纯化的成分的相对浓度(从其得到纯化的成分或级分的重量除以混合物中所有成分或级分的重量)减少至少20％、40％、50％、60％、75％、85％、95％、98％或100％时也可以认为该成分或级分得到了纯化。仍然另一系列的实施方案中，成分或级分纯化至相对浓度至少为50％、65％、75％、85％、90％、97％、98％或99％。当一个实施方案中成分或级分是与其它成分或级分“分离”时，将理解为另一个实施方案中成分或级分是以在此所提供的水平得到了“纯化”。
“组件”指的是模拟移动床装置的一部分。一个组件可以包括一个或多个柱子或管子(vessel)。
“环”用来描述SMB系统的组件怎样在SMB系统中互相之间以循环的方式来配置，因为每个组件的出口包括下一个组件的进口。因此术语“环”不应限制地理解为组件和组件中柱子的环状结构。
“多成分混合物”指的是包括可以使用前述层析方法分离的三种或多种成分或级分的流体混合物，因为每种成分或级分对所用的吸附剂显示了不同的亲和性。
“非本质成分”指的是存在于含有免疫反应性化合物的流体混合物中的成分，其不是免疫反应性化合物，并将其和免疫反应性成分分离。非本质成分可以包括宿主细胞蛋白(HCP)、抗生素和其它存在于流体混合物中的成分。
“传质效应(mass transfer effects)”通常指的是导致混合物的成分显示与在所给系统中混合物不同的扩散行为并脱离理想系统的那些物理现象。传质效应因此包括使用轴向扩散系数、粒子内部扩散系数、和膜传质系数模建的效应。因此传质效应还包括由于附加柱的死体积向前(fronting)和扩散。如果在所述的平衡3-6的任何区域中传质校正项(以下将更详细讨论)多于移动相速度(理想系统的移动相速率)的2％，来获得前述的纯度和产量的分离就受到不可忽略的传质效应的阻碍。本发明的设计还延及其中传质校正速度增大或减小了对于理想系统的移动相速度多于1、3、5、7.5、10、15、20、30、50、75、100％、200％、400％、600％、1000％，或更高的系统。
如在此所用的，“与其它成分基本分离”意思是分离的成分含有的每种其它成分不超过约20％重量，优选每种其它成分不超过约5％重量，以及更优选每种其它成分不超过约1％重量。
如在此所用的，“不含有基本量成分的液流(stream)”意思是液流至多含有约20％重量的成分，优选至多约5％重量的成分，以及更优选至多含有约1％重量的成分。
附图简述

图1描述了分离和纯化免疫反应性化合物如细胞培养中产生的抗体的常规方法流程图。
图2描述了免疫反应性化合物如来自细胞培养的抗体分离和纯化另一常规方法的流程图。
图3描述了本发明的四(4)区域模拟移动床层析(SMB)系统图。
图4描述了根据图3的SMB系统的实施方案图。
图5描述了本发明另一四(4)区域SMB系统图。
图6描述了根据图5的SMB系统的实施方案图。
图7描述了本发明八(8)区域SMB系统图。
图8描述了本发明具有二十(20)个柱子的八(8)区域模拟移动床(SMB)系统图。图8表示了圆盘传送带(carousel)装置的二维图，其中柱子以圆周排列。
图9描述了本发明具有二十(20)个柱子的八(8)相模拟移动床层析系统的另一实施方案图。
图10描述了本发明具有二十(20)个柱子的八(8)相模拟移动床层析系统的另一实施方案图。
图11描述了如实施例3中所述的图9中描述的SMB装置的一个循环转换中二十个(20)柱子洗涤1的UV结果。
图12描述了图9中所描绘的SMB系统的九个(9)完整旋转的抗体浓度(IgG滴度)、IgG流量和宿主细胞蛋白质浓度(HCP)的曲线。在该图中顶端菱形(◆)曲线表示IgG流量；较低的菱形(◆)曲线表示IgG滴度；以及方块(■)曲线表示HCP。
发明详述根据一方面，本发明涉及模拟移动床(“SMB”)系统和适用于免疫反应性化合物如细胞培养中制得的抗体分开和分离过程中的模拟移动床层析方法。本发明的SMB系统和方法可以用于如图1中步骤D或步骤F或图2中的步骤B或D所指示的过程。
这些过程通常包括一个或多个层析步骤。由于蛋白质层析树脂非常昂贵，批处理方式中使用的层析柱只能装载至它们所谓的动态负载量(其通常是它们平衡负载量的30至50％)，如果柱子在平衡中运行，需要使用体积是通常所需的2到3倍的柱子(即，装载至它们的平衡负载量)。因此，使用批处理方式的层析步骤具有主要的经济后果。此外，批处理柱层析的洗涤和洗脱过程需要大量的流体体积，其也是由于批处理操作模式。以连续、逆流模式使用其中柱子装载至平衡容量的连续层析将需要较小的柱容积。此外更有效地洗涤和洗脱过程可以导致大量减少缓冲剂的消耗。实现这的途径之一是使用模拟移动床层析。
典型的模拟移动床系统具有充填固相的至少一个组件或多个组件。组件可以包括一个或多个柱子或管子。流体导管相互连接系统的上流和下流端来形成回路，通过其流体混合物连续循环。在特定点可以引入液体流和在另外的点可以移出流出液流。通过回路的流体恒定流动称为“内部再循环流动(internal recirculation flow)”。选择性提供管道和阀门的歧管(manifold)系统来放置进料的进口、洗脱缓冲液的进口(将成分与固相分离)、分离成分的出口和未结合(或较少结合)成分的出口。每个进口和出口和分离的组件(或管子或柱子)连通。进料在指定点进入系统并通过连续内部再循环流动通过固相。该移动接触导致成分的层析分离。以相对快速率流动的未结合成分从未结合成分出口移除，如通过移除第一洗涤流出液流。将使结合化合物与固相分离的缓冲剂(洗脱缓冲液)在结合和未结合成分各自出口阀门位置之间的进口阀门加入。
以预定的时间间隔(转换时间)将指定进口和出口阀门位置向下流移动歧管上的一个位置至下一个固相床组件，其可以是管道离散的部分，(如柱子)，或独立的管子，如柱子。选择该步骤的时间以致阀门的指定和内部再循环流动完全同步。在这些条件下，系统实际上达到了稳定状态，在每个阀门位置预定的间隔依次显示了特定产物特征。该类型的系统模拟单个位置固定的阀门而固相以恒定和连续的速率围绕每个阀门产生恒定质量产物的再循环回路移动。另一装置实际上间歇地移动柱子-经常固定在圆盘传送带上-而阀门位置是固定的。
如果增加组件(或管道或柱子)和阀门位置的数量，模拟模型将更接近达到实际移动床系统的特征。批处理和模拟移动床系统之间的重要区别是在模拟移动床方法中内部再循环流动是连续的。除了控制内部压力的非常小的调节，进入和流出速率是连续的和恒定的，因此尽可能精密地近似实际的移动床系统。
平衡的SMB系统显示了沿着再循环回路路径的稳定状态成分分离波形。该波形伴随着阀门同步转换沿着再循环回路移动来保持所期望的稳定状态。在这样的SMB系统中，可以将区域看成是固定的，组件穿过区域移动。
模拟移动床方法实现了固相和液相的逆流移动以及伴随的连续移动床超越无固体物理移动批处理层析的优势。SMB方法利用了含有至少一种固相的系列组件连接形成循环。在一些系统中，每个组件包含至少一个或两个或比较均匀大小的柱子，且这些柱子连接形成连续的循环。通过以移动(液)相流动方向周期性地将一个组件(如果组件包括多个柱子，一个柱子)的进口和出口端口向前移动来模拟固相移动，以致产物端口总是接近系统中产物的部分分离浓度波。与连续移动床系统相似，将端口转换时间、区域长度、和区域流动速率全部平衡，达到目的水平的产物流纯度。因此，可以将区域看成是固定的，组件通过一个区域至另一个移动。
1.免疫反应性蛋白质分离的一般方法本发明的SMB方法可以用作将免疫反应性化合物如细胞培养制得的抗体与非本质成分分离的方法的一部分。
图1绘制了将免疫反应性化合物如细胞培养制得的抗体与至少一种非本质成分分离和分开的一般方法示意图。本发明的方法可以用作该一般方法中的分离步骤或作为其他本领域所用一般方法中的分离步骤来分离和纯化免疫反应性化合物如通过重组和细胞培养方法生产的抗体。
根据图1所示的方法，处理步骤A中的细胞培养物悬液来收集细胞。步骤B中，澄清细胞悬液(除去细胞、细胞碎片和沉淀)。适于步骤B的方法之一是深部过滤；其他合适的方法包括离心和切向流过滤。步骤C中滤液用Triton X-100温育，适合在容器如储罐中。认为用TritonX-100处理可以灭活可能存在的病毒。步骤D中，滤液含有至少一种非本质成分，如宿主细胞蛋白(“HCP”)，为了除去宿主细胞蛋白(“HCP”)和其他非本质成分将免疫反应性化合物进行根据本发明方法的模拟移动床层析。优选使用亲和层析。根据优选方面，使用含有蛋白质A或蛋白质B的固相。可以使用带有任何常用固相主链(包括，例如，琼脂糖、受控制的纯玻璃、合成有机聚合物，等等)的天然或重组蛋白质A或蛋白质G的任何蛋白质A或蛋白质G亲和吸附剂。根据一方面，固相含有重组蛋白质A。合适的固相包括那些Prosept rA(Millipore，Bedford，MA)和MabSelect(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)。可以使用本领域技术人员公知的其他固相用于将免疫反应性化合物如抗体与HCP和其他非本质化合物分离。步骤E中，将产物流进行低pH温育步骤。储罐可以方便地用于该步骤。相信根据该步骤的低pH温育可以灭活溶液中可能存在的病毒。步骤F包括阳离子交换层析，优选使用结合和洗脱模式的阳离子交换固相。合适的阳离子交换固相包括使用复合材料如Hyper D(Biosepra)的SP Sepharose XL树脂和触手(tentacle)树脂(Merck或Tosohaas)的强阳离子交换吸附剂，和使用羧甲基(CM)配体的弱阳离子交换吸附剂。本发明的SMB方法可以用于该分离步骤中(以及步骤D)。相信步骤F可以去除沥滤了的蛋白质A(其中步骤D使用了含有蛋白质A的固相的亲和层析)并且还可以去除可能存在的病毒和其他污染物。步骤G包括阴离子交换层析，优选使用流动通过模式的强阴离子交换固相。合适的固相包括Fractogel TMAC。相信由于阴离子交换剂吸附，步骤G可以去除残余的污染物(包括DNA)和可能存在的病毒。步骤H包括纳滤(nanofiltration)步骤。合适的方法包括死端(dead end)过滤，相信步骤H通过大小排阻可以去除可能存在的病毒。步骤I包括超滤或透滤步骤。步骤I用来将溶液中的抗体浓度调节成适于保存的浓度，和如果显示了，进行缓冲剂交换使其成为适于保存的缓冲剂。
大规模生产抗体的另一方法显示于图2中。该方法的步骤包括(a)补料分批发酵CHO细胞培养物产生15.000升培养液，含有0.5-2g/L抗体；(b)离心来去除生物质；(c)蛋白质A层析(该步骤的主要目的是去除(大多数的)宿主细胞蛋白质(HCP))；(d)阳离子交换层析(该步骤的主要目的是去除从亲和凝胶中漏出的任何蛋白质A配体，由于蛋白质A配体和抗体都结合至凝胶，并在选择性洗脱过程中发生分级)；以及(e)阴离子交换层析(主要目的是去除(吸附的)DNA，未吸附的MAb，由于其本质上是相当碱性的)。
2.SMB系统的描述本发明涉及使用SMB系统作为免疫反应性化合物如细胞培养物产生的抗体或抗体片段分离和纯化方法一部分的方法。
本发明的一方面，SMB系统可以用来使用蛋白质A亲和树脂将免疫反应性化合物与宿主细胞蛋白和其他非本质成分分离。为了适应蛋白质A亲和方法中可靠的免疫反应性化合物分离所需的所有步骤，使用了实验装置，其包括区域，区域用于将免疫反应性化合物与固相结合、去除未结合成分、从固相分离/洗脱免疫反应性化合物和固相再生/再平衡。
根据本发明的这个方面，免疫反应性化合物在中性pH和蛋白质A组件结合，在一个或两个洗涤步骤中去除未结合成分，在低pH分离/洗脱免疫反应性化合物，且通过一个、两个或三个连续的步骤再生和再平衡组件。所有这些步骤通过含有至少一个组件的SMB系统连续进行，组件通过具有多个区域的环移动。
根据本发明的一个方面，所述环由多个区域组成，合适的是四至八个区域，取决于所用的洗涤和再生/平衡步骤的数量。根据本发明的方法，获得了纯化的免疫反应性化合物的连续流，使用的固相和所用缓冲剂的量与批处理方式相比大量减少。本发明的一方面涉及如此所述的多区域SMB系统用于使用蛋白质A亲和吸附剂的抗体纯化。
蛋白质A亲和SMB层析是减少蛋白质A亲和层析中巨大成本的强有力途径。组件(或柱子)体积的减少立刻导致减少的商品成本，此外，较小的组件更容易充填并在操作过程中通常导致较少的问题。完全自动连续的系统需要更少的操作者操纵，因此减少了失败的风险。
根据本发明的另一个方面，在此描述的SMB系统还可以适用抗体纯化过程中的阳离子交换层析步骤，其通常发生在蛋白质A亲和层析步骤之后。该步骤使用SMB系统的经济效益和蛋白质A亲和层析步骤是相似的。
A.一般的四(4)区域SMB系统(i)图3图3绘制了本发明的四区域SMB系统。
根据一实施方案，将进料加至两个(2)并联的柱子，并使得二次穿过两个(2)并联的柱子。因此传质(mass transfer)遍布至四个柱子。圆盘传送带或其它相似装置可以用来相对于固定阀门以及进口和出口流地移动柱子。柱子从吸附区域移动至左边进入吸附洗涤(或第一次洗涤)区域。在此所用的缓冲剂洗涤未结合物质并除去内毒素。将吸附洗涤的(或第一洗涤)区域的流出液进料回吸附区域来最小化产品的损耗。吸附洗涤(或第一洗涤)区域由两个(2)柱子串联组成，因此减少了所需缓冲剂量约40％。在由两个(2)柱子串联组成的洗脱区域洗脱产物，再次利用所得到的逆流效应。接着洗脱区域是洗脱洗涤区域。在该区域所用的缓冲剂可以是稀释的平衡缓冲剂，其缓冲剂容量比洗脱区域的缓冲剂容量要低得多。将洗脱洗涤缓冲剂循环进洗脱区域以减少水成本。
图4绘制了图3SMB系统另一实施方案的方法流程图，用于抗体分离的四区域SMB系统。根据该实施方案，吸附区域的柱子(位置7和位置8)是并联连接的来减少压力下降。吸附区域吸附剂(固相)的量是dimensioned以致传质不受限制。根据该实施方案的一方面，柱子排列在圆盘传送带上。圆盘传送带的旋转时间设定成满足进料流所需的容量。
图4所示的系统中，将从吸附区域进入洗涤(或第一洗涤)区域的隙间液体洗出并将其回料入吸附区域。大多数内毒素和宿主细胞蛋白在此除去并在从吸附区域流出的废物流中结束。洗涤(或第一洗涤)区域后，抗体在洗脱区域得到洗脱；位置3和4的柱子包括洗脱区域。位置1和2的柱子包括洗脱洗涤区域并用来洗出隙间洗脱剂并将其回料入洗脱区域因此节约洗脱剂。为了在洗脱区域获得所需的pH，将洗脱缓冲剂运用至该实施方案中的洗脱区域，然而，需要浓缩。
(ii)图5图5绘制了四(4)区域SMB系统的另一个实施方案。该系统不同于图3中所示的那个。
根据一实施方案，吸收区域具有2乘以3个并联柱子，因此略微增加了凝胶的使用。吸附区域、吸附洗涤(或第一洗涤)区域，和洗脱区域基本上和图3的系统相同；然而，没有洗脱洗涤区域。这可能导致产物回收降低因为小量洗脱剂将进入吸附区域的最后一个柱子。将来自产物罐的小液流泵入盐/pH梯度区域。该区域建立了pH和盐浓度的梯度过渡。保持流速低于隙间液体转移的速度(回至洗脱区域)来保证最小化产品损耗。用洗脱剂和产物预饱和柱子也将提高洗脱区域的效率。
图5 SMB系统的另一实施方案绘制于图6中。原理与上述图3和4的系统相似，省略了洗脱洗涤区域。然而，该实施方案包括了另一个区域，夹带物滤去(entrainment rejection)区域。这考虑到较高的流出液浓度。此外，该区域将在系统中产生pH分布(位置3和4的柱子中)。这可以给予经过蛋白质的等电点的相对平稳地过渡，因此最小化产品的分解。
用于图6中所示实施方案的各个柱子可以比图3或图4系统中所用的那些小得多。系统体积和凝胶的利用率也显著较高。其主要原因是在吸附区域为活性的凝胶体积的级分高于图3或图4系统中的(12个柱子中的6个而不是4个中的2个)。吸附区域的凝胶绝对量大约和图3或图4系统中的相同。
B.一般的八(8)区域SMB系统图7绘制了本发明的八(8)区域SMB系统。根据一实施方案，所有方法步骤在两相中进行。吸附和洗脱区域具有二乘以二的并联柱子来降低线性流速。所有其他区域具有两个串联的柱子来利用逆流效应。
图8至10描述了本发明八(8)区域SMB系统的另一实施方案。
实施例1描述了使用图8实施方案进行的方法。
实施例2描述了使用图9实施方案进行的方法。
图10绘制了八(8)区域SMB系统另一实施方案。在该实施方案中，包括吸附剂的再生。每批次运行系统只消毒一次，即，每15,000升一次。吸附区域包括四个柱子，其连接成二乘以二的并联柱子。在第一洗涤区域隙间液体回料至吸附区域。第一洗涤区域中，三个柱子串联连接来最大化逆流接触的效果。为了最小化高盐浓度和浓缩MAb溶液之间的接触将第一洗涤缓冲剂以上升流(upflow)引入。当柱离开吸附区域后，床的顶端比底部含有更多的浓缩进料溶液。图10的实施方案中，用用于第二个洗涤区域的流出液或缓冲剂稀释第一洗涤区域缓冲剂来获得节约用水。第二洗涤区域具有两个柱子并设计在其移动至位置11之前在位置12建立低盐浓度。在其移动至洗脱区域前将来自产物罐的非常低的产物流泵入柱子11来预饱和柱子。因此位置11的唯一功能是产物浓缩，该处理步骤的普通名称是夹带物滤过。在洗脱区域，将洗脱缓冲剂以上升流引入二乘二的并联柱子中。用用来从洗脱洗涤区域的位置5和6洗出洗脱剂的洗脱洗涤缓冲剂稀释洗脱缓冲剂。因而，为了补偿稀释效果运用至洗脱区域的洗脱缓冲剂必须浓缩。柱子1至4用来平衡和再生并包括平衡区域和再生区域。如果再生需要特定浓度的氢氧化钠，运用至系统的再生缓冲剂必须具有较高浓度来适应稀释。图10绘制的该系统尤其适合于圆盘传送带型SMB系统，其具有在一个系统中使用不同流向的适应性。
为了有助于理解，现在将通过以下实施例进一步说明本发明。当然，涉及本发明的实施例不应视作是特异性地限制发明，本领域技术人员理解范围内的本发明这样的改变，现在已知或后来发展的，将认为是落入如在此所述和此后所要求的本发明范围内的。
实施例实施例1使用八区域模拟移动床系统纯化单克隆抗体将模拟移动床(SMB)技术运用至单克隆抗体的蛋白质A初步纯化步骤中。系统由20个二十个柱子组成，柱子放置于旋转的圆盘传送带上排列成环状。八个独立的区域建为SMB连续系统。
A.设备描述中心阀门(valve)，其由三个部分组成(顶端、中部和底部)，描绘了八个处理区域。在过程中阀门的顶部件保持固定并且出口的内部连接划定了处理区域。阀门的中间部分是Teflon环可以使底部自由旋转。阀门的底部与每个柱子的顶端和底部连接。
每个处理区域需要特定的缓冲剂和流速。使用八个HPLC泵将持续流体流传递至阀门的顶部的进口部分。
通过以特定间隔旋转圆盘传送带的控制器保持柱子的旋转。特定停留时间后，圆盘传送带旋转一个位置至下一个位置，创造逆流流动来减少缓冲剂消耗和增加树脂容量。
B.区域描述在该实施例中，二十个柱子连接至中心阀门上(参见图8)。在一瞬间，将标记一至二十的柱子对应下列洗涤区域(i)平衡区域从柱子一开始，将平衡缓冲剂(10mM EDTA/50mM Tris(碱)/0.5MNaCl，pH7.5)以向上方向运用至柱子中。柱子一的流出液送往柱子二的底部，收集其流出液于样品管中用于将来的分析。
(ii)再生区域将再生缓冲剂(4M尿素/50mM Tris(碱)pH7.0)以向下方向运用至柱子三。柱子三的流出液送往柱子四的顶部，收集其流出液于样品管中用于将来的分析。
(iii)CIP区域原地清洗，将CIP区域缓冲剂(1％磷酸)以向下方向运用至柱子五的顶部。柱子五柱子的流出液送往柱子六的顶部，收集其流出液于样品管中用于将来的分析。
(iv)洗脱洗涤区域将纯化水(MilliQ)以向上方向运用至柱子七，将其流出液以向上方向运用至柱子八。柱子八的流出液通过UV仪监控并收集于样品管中用于将来的分析。
(v)洗脱区域将洗脱区域缓冲剂(100mM甘氨酸/200mM乙酸pH3.5)以向上方向运用至并联方式的的柱子九和柱子十。将柱子九和十的流出液合并成单流，然后将其分开以向上方式来洗涤柱子十一和十二。将柱子十一和柱子十二的流出液合并形成产物流，其通过UV仪监控并收集于样品管中用于将来的分析。
(vi)第二洗涤区域将第二洗涤区域缓冲剂(50mM Tris(碱)/100mM甘氨酸pH7.5)以向下方向运用至柱子十三。将柱子十三的流出液以向下流动运用至柱子十四，收集其流出液于样品管中用于将来的分析。
(vii)第一洗涤区域将第一洗涤区域缓冲剂(10mM EDTA/50mM Tris(碱)/0.5M NaCl)以向下方向运用至柱子十五。柱子十五的流出液通过UV仪监控，然后以向下方向运用至柱子十六。柱子十六的流出液和进料流合并。
(viii)吸附区域将进料流，其含有宿主细胞蛋白和单克隆抗体以及其它成分的混合物，在线和柱子十六的流出液混合。然后将新的液流分开并以向下方向平行运用至柱子十七和柱子十八。将柱子十七和柱子十八的流出液混合然后分开并以向下方向平行运用至柱子十九和柱子二十。将柱子十九和柱子二十的流出液合并并收集于样品管中用于将来的分析。
C.处理描述通过以上所示的柱子编号的区域描述表示了一瞬间。当特定的停留时间过去以后，圆盘传送带以顺时针方向旋转一步。如实施例，这意味着先前暴露于向下方向平衡缓冲剂中的柱子一现在位于柱子二十之前所在的位置。因此，柱子二十现在位于柱子十九之前的位置，诸如此类延及整套柱子。从处理角度来说，这意味着柱子十九和柱子十八的流出液合并然后分开以向下方向运用至柱子二十和柱子一。持续柱子旋转直至再没有进料处理。
区域描述中的每个区域在进料处理中具有特定的目的。从CIP区域开始，再生步骤作为加工-清洗步骤来进行。再生区域确保任何非特异性结合化合物与树脂分离。实施平衡区域来置换再生区域缓冲剂并在柱子中创造出初始装载阶段中允许抗体结合的环境。在吸附区域，进料流将所需产物引至柱子。第一洗涤区域置换了装载进料和洗出非特异性蛋白质和其它杂质。实施第二洗涤区域使传导性达到可接受基线。创造洗脱区域来将抗体与蛋白质A配体分离并收集抗体。洗脱洗涤区域是测试部分，检测在洗脱区域中是否所有抗体都得到了有效地洗出。
由于方法的经济效果依赖于处理过程中消耗的缓冲剂体积，进行实验来测定进行上述分配给每个区域的任务所需缓冲剂的最小量。表I描述了每个部分测试的柱容积范围。
表I
B.结果处理液流中发现的产物、宿主细胞蛋白(HCP)和庆大霉素相对量的概述显示于以下的表II中。
表II
NA-未获得。对于洗涤1的情况，该液流是和进料流合并的，因而，没有分别测量。
使用该实施例所述的SMB方法获得了83.8％的蛋白质回收。产物未计入的量可能在再生部分发现。产物集合中的抗体浓度比进料流中高～8.6倍。就单聚物含量和抗体完整性而言的产物质量通过SEC和CE-SDS来研究，并显示了具有和批处理蛋白质A层析相当的数值。
洗脱集合中HCP降低3.05对数(＞99.9％去除)和庆大霉素下降3.46对数(＞99.96％去除)。HCP浓度和按比例扩大运行的常规蛋白质A层析所得到的结果非常相似。庆大霉素含量低四倍。
实施例2使用另一八区域模拟移动床系统纯化单克隆抗体将与实施例1所述SMB系统相似的模拟移动床系统用于纯化抗体。该系统也是由二十(20)个柱子组成，柱子附着在旋转圆盘传送带上排列成圆环。建立了八个独立区域用于SMB连续系统。该系统图绘制于图9中。
该系统的结构与图8中所述的不同之处在于(a)所有柱子以下流方式操作和(b)洗脱洗涤区域使用了四(4)个串连的柱子和洗脱区域使用了两个(2)串连的柱子。
实施例3抗体纯化可再现性的证明实施例2(以及图9中所示的)所述的模拟移动床系统用来检验本发明抗体纯化方法的可再现性。SMB系统中单个柱子(该情况中为20个柱子)之间和SMB循环之间(旋转)都需要可再现性。通过比较来自洗涤1的UV结果柱子之间的可再现性显示于图11中。检测器绘制于图9中如柱子15和柱子16之间的UV。来自该检测器的信号显示了20个柱子的转换，表示了SMB循环两个独立的旋转在该特定位置的来自20个独立柱子的洗涤1。如从图11可见的，来自所有20个转换的记录信号是一致的，甚至两个独立旋转有重叠，因此证明柱子到柱子的纯化可再现性。
旋转(系统20个柱子的)之间的可再现性显示于图12中。图12绘制了抗体浓度(IgG滴度)、IgG流量(flux)，和宿主细胞蛋白浓度(显示了SMB系统9个全旋转的HCP)的曲线。IgG流量(mg/ml)通过顶端菱形曲线(◆)来表示。IgG滴度(mg/ml)通过较低的菱形曲线(◆)来表示。HCP(ppm)通过方块(■)曲线来表示。
权利要求
1.使用模拟移动床层析从流体混合物中将免疫反应性化合物与至少一种非本质成分分离的方法，包括步骤(a)提供模拟移动床装置，其包括流体中进行交流的多个组件，所述组件包括至少一种固相；(b)将流体混合物连续引入所述模拟移动床装置中，其中流体混合物以逆流方式和固相接触；(c)实现免疫反应性化合物与至少一种非本质成分的分离；和(d)收集免疫反应性化合物来提供其纯化的组分。
2.根据权利要求1的方法，其中所述免疫反应性化合物和固相的结合程度比至少一种非本质成分高或低。
3.根据权利要求2的方法，其中所述免疫反应性化合物和固相的结合程度比至少一种非本质成分高。
4.根据权利要求3的方法，进一步包括通过将促进免疫反应性化合物分离的洗脱剂和所述固相接触来实现所述分离的步骤。
5.根据权利要求4的方法，其中所述固相包括和蛋白质A或蛋白质G结合的支持物材料。
6.根据权利要求5的方法，其中所述洗脱剂包括酸性缓冲剂。
7.根据权利要求1的方法，其中使用吸附层析、分配层析、离子交换层析、大小排阻层析或亲和层析来实现分离。
8.根据权利要求7的方法，其中使用亲和层析实现分离。
9.根据权利要求1的方法制备的免疫反应性化合物。
10.用于当免疫反应性化合物和至少一种非本质成分两者都存在于流体混合物中时将免疫反应性化合物与至少一种非本质成分分离的模拟移动床(“SMB”)系统，其中SMB系统包括多个含有固相的区域，固相逆流地和所述流体混合物接触，且其中所述区域包括结合区域，其中免疫反应性化合物和至少一种非本质成分与固相有差异地结合；第一洗涤区域，其中至少一种非本质成分优先与固相分离；和洗脱区域，其中免疫反应性化合物优先与固相分离。
11.根据权利要求10的模拟移动床系统，其中所述第一洗涤区域是在所述结合区域和所述洗脱区域中间。
12.根据权利要求10的模拟移动床系统，其中所述固相优先和所述免疫反应性化合物结合。
13.根据权利要求12的模拟移动床系统，其中所述固相包含用于亲和层析的配体。
14.根据权利要求13的模拟移动床系统，其中所述固相包含蛋白质A或蛋白质G。
15.根据权利要求12的模拟移动床系统，其中所述固相包含阳离子交换树脂。
16.根据权利要求10的模拟移动床系统，其进一步包括在所述洗脱区域和所述结合区域之间的洗脱洗涤区域。
17.根据权利要求16的模拟移动床系统，其进一步包括在所述洗脱洗涤区域和所述结合区域之间的再生区域。
18.根据权利要求17的模拟移动床系统，其进一步包括在所述再生区域和所述结合区域中间的平衡区域。
19.将免疫反应性化合物与至少一种非本质成分分离的方法，其包括使用权利要求10的模拟移动床系统。
20.使用权利要求10的模拟移动床系统制备的纯化的免疫反应性化合物。
21.使用权利要求20的免疫反应性化合物治疗需要治疗的患者的方法。
22.当抗体和至少一种非本质成分两者都存在于流体混合物中时使用模拟移动床层析将抗体与至少一种非本质成分分离的方法，包括步骤(a)提供包括进行交流的流体中多个组件的模拟移动床装置，所述组件包括至少一种固相，其含有优先结合抗体的亲和层析配体；(b)将流体混合物连续引入所述模拟移动床装置中，其中流体混合物以逆流方式和固相接触；(c)实现抗体与至少一种非本质成分的分离；和(d)收集抗体来提供其纯化的组分。
23.用于当抗体和至少一种非本质成分两者都存在于流体混合物中时将抗体与至少一种非本质成分分离的模拟移动床(“SMB”)系统，其中SMB系统包括多个含有固相的区域，固相包括亲和树脂，其逆流地和所述流体混合物接触，且其中所述区域包括结合区域，其中抗体和至少一种非本质成分与固相有差异地结合；第一洗涤区域，其中至少一种非本质成分优先与固相分离；和洗脱区域，其中抗体优先与固相分离。
24.使用模拟移动床层析将在流体混合物中的免疫反应性化合物与至少一种非本质成分分离的方法，包括步骤(a)提供模拟移动床装置，其包括与所述装置进行交流的流体中的至少一个组件，所述组件包括至少一种固相，且其中所述装置包括多个组件通过的区域；(b)将流体混合物连续引入结合区域中的组件，其中流体混合物以逆流方式和固相接触，且其中免疫反应性化合物和固相结合；(c)将洗涤缓冲剂连续引入洗涤区域中含有结合免疫反应性化合物的组件中，其中洗涤缓冲剂以逆流方式和固相接触，并从所述组件基本去除至少一种非本质成分；和(d)将洗脱缓冲剂连续引入洗脱区域中含有结合免疫反应性化合物的组件中，其中洗脱缓冲剂以逆流方式和固相接触，并因此将免疫反应性化合物基本与固相分离；和(e)连续从组件移除含有免疫反应性化合物的产物流。
25.根据权利要求24的方法，其中所述模拟移动床装置包括多个组件。
26.根据权利要求24的方法，其中所述固相包括亲和配体。
27.根据权利要求26的方法，其中所述亲和配体包括蛋白质A或蛋白质G。
28.根据权利要求24的方法，其中所述免疫反应性化合物包括抗体。
29.基本通过权利要求28的方法制备的纯化的抗体。
30.在从至少一种非本质成分中纯化免疫反应性化合物的方法中，改良包括使用带有含有蛋白质A或蛋白质G的固相的模拟移动床亲和层析。
全文摘要
本发明提供了使用模拟移动床(“SMB”)系统将免疫反应性化合物与至少一种非本质成分分离的方法以及用于这些方法的SMB装置。还提供了使用SMB方法和装置制得的纯化的免疫反应性化合物以及使用纯化的免疫反应性化合物的治疗方法。
文档编号B01D15/18GK1777435SQ03824460
公开日2006年5月24日 申请日期2003年9月12日 优先权日2002年9月13日
发明者J·P·特梅斯, A·M·索南斐尔德, J·P·皮拉希, L·康利, M·比绍普斯, M·潘宁斯 申请人:拜奥根Idec公司