一种蜡样芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶及基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种含有蜡样芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶基因的克隆表达以及通过大 量表达以及高效亲和层析纯化方法得到纯度较高的亚硝酸盐还原酶（NiR)，从而对重组蛋 白的性质进行研究。
【背景技术】
[0002] 亚硝酸盐是一种潜在的致癌物质，主要原因有2个：（1)大量摄入亚硝酸盐对 人体有害，亚硝酸盐的急性中毒作用是导致高铁血红蛋白症（Methemoglobin)，可产生常 见的亚硝酸盐急性中毒症状，主要表现为组织缺氧、紫绀，伴随口唇、指甲和皮肤的颜色 改变等现象；（2)亚硝酸盐还会造成人体或动物的慢性危害，亚硝酸盐在适宜的条件下， 可与食品中蛋白质的分解产物胺进行反应，生成N-亚硝基化合物，目前已经合成该类化 合物有100多种，已经证实其中约80%对动物有强致癌性，可诱发大肠、胃、肝、食道等器 官的癌症。为预防亚硝酸盐的急性和慢性危害，探索降解食品中潜在致癌物亚硝酸盐的 方法和机制，非常必要。NiR是脱氮过程中的第一限速酶，催化亚硝酸盐降解为一氧化 氮，大部分反硝化细菌中都存在NiR，使得其可以高效快速有效降解亚硝酸盐。许多非食 用细菌中NiR的分离纯化已被报道：Vigara从1944mg Monoraphidium braunii粗蛋白 中纯化得到 〇.29mg 铁氧还原蛋白 _NiR[Vigara J，Garc：[a-S(inchez MI，Garbayo I，et al. Purification and characterization of ferredoxin - nitrite reductase from the eukaryotic microalga Monoraphidium braunii. Plant Physiology and Bioche mistry，2002,40(5):401_405] ;Ichiki 从 6170mg 的 Haloarcula marismortui 粗蛋白 中仅得到 1. 43mg 的 NiR[Ichiki H and Tanaka Y. Purification, characterization, a nd genetic analysis of Cu-containing dissimilatory nitrite reductase from a denitrifying Halophilic Archaeon，Haloarcula marismortui. Journal of Bacteriol ogy，2001，183 (14) :4149 - 4156] ;Inatomi 对 Haloferax denitrificans 中的 NiR 进行纯 化发现1060mg粗蛋白中只能得到0.08mg目的蛋白[Inatomi K and Hochstein LI.The purification and properties of a copper nitrite reductase from Haloferax denitrificans. Current Microbiology，1996, 32:72-76]，国内外未见从錯样芽抱杆菌中 提纯NiR的研究。由于粗酶液中蛋白种类太多，而目的蛋白含量太低，导致纯化工作困难。 为了提高NiR的含量，克隆表达技术得到了广泛的应用。通过克隆NiR基因然后在宿主细 胞中大量表达，同时通过质粒使得重组蛋白带有特定标签从而简化纯化过程。
【发明内容】
[0003] 为研究蜡样芽孢杆菌中NiR的性质，解决由于蜡样芽孢杆菌中NiR含量低而难于 纯化的问题，本发明通过对其NiR编码基因的克隆表达来实现该蛋白在大肠杆菌中的大量 表达，同时通过亲和层析法得到大量纯度较高的NiR，从而实现对LJ01中NiR的提纯。 [0004] 为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
[0005] -种蜡样芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶的基因，其核苷酸序列如NO. 1所示。
[0006] -种蜡样芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶，由权利要求1所述基因编码的蛋白质。
[0007] 含有上述蜡样芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶基因的重组质粒，该重组质粒中含组氨酸 标签。
[0008] -种蜡样芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶的制备方法，包括如下步骤：
[0009] (1)以NCBI中蜡样芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶编码基因为模板，进行上下游引物设 计，设计的酶切位点为Ncol、Sail;
[0010] (2)提取蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus)LJ01的DNA，并以此为模板，通过PCR 技术扩增蜡样芽孢杆菌LJ01亚硝酸盐还原酶的基因片段；所述蜡样芽孢杆菌LJ01的保藏 编号为 CGMCC N0. 9360;
[0011] (3)利用Ncol、Sail工具酶将扩增片段和质粒pET-32a(+)于37°C下分别切成具 有两个粘性末端的片段；采用回收试剂盒回收以上两个片段，并用T4DNA连接酶连接，再转 入重组大肠杆菌中，利用抗生素氨苄青霉素进行筛选即获得阳性工程菌；
[0012] (4)将上述工程菌经诱导表达，采用亲和层析法纯化，即得到蜡样芽孢杆菌亚硝酸 盐还原酶。对经亲和层析纯化后的NiR进行变性和非变性聚丙烯酰胺电泳，同时进行GPC 来检测其纯度和分子量。对重组蛋白进行金属含量的测定，从而确定其活性中心。对重组 蛋白的氧化态和还原态进行UV-可见光全波长扫描，检测其在可见光区域的最大吸收峰。
[0013]所述上游引物为5' -GATGCCATGGATGAGITATGAAAAAGTAT-3'（Ncol)，下游引物为 5, -ACGCGTCGACCTAAGACGCTATTACTTCT-3，（Sail)。
[0014] 所述诱导表达为加入诱导剂IPTG进行诱导，且诱导浓度为0. 1~1. 0mmol/L。
[0015] 所述蜡样芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶在降解亚硝酸盐中的应用，在降解过程中需加 入电子供体蛋白。
[0016] 所述的电子供体蛋白为细胞色素c或从蜡样芽孢杆菌LJ01中提取得到的电子供 体蛋白，其添加量为亚硝酸盐还原酶的1/5~1/15。
[0017] 本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：
[0018] (1)本发明通过对经IPTG诱导的含空质粒和重组质粒大肠杆菌及不加IPTG诱导 的含重组质粒大肠杆菌粗酶液进行SDS-PAGE分析及亲和层析技术来验证工程菌可以诱导 表达亚NiR重组蛋白。
[0019] (2)本发明可以通过IPTG诱导表达得到大量的细胞内NiR，可以应用到工业中进 行大量生产。
[0020] (3)本发明利用亲和层析作用纯化得到纯度较高的NiR重组蛋白，并通过GPC和非 变性聚丙烯酰胺电泳检测其纯度，解决了从蜡样芽孢杆菌中分离出纯度和含量较高NiR的 难题。
[0021] (4)本发明得到的工程菌表达的重组蛋白要添加电子供体蛋白才能有效地降解亚 硝酸盐。
[0022] (5)该克隆表达得到的大量的NiR重组蛋白可以用于食品中的亚硝酸盐的降解； 由于其最适pH为6. 5-7. 5,所以也用于非酸性环境中亚硝酸盐的降解；还可以用于养殖水 体中亚硝酸盐的降解。
[0023] 錯样芽孢杆菌（Bacillus cereus)LJ01的保藏信息：錯样芽孢杆菌LJ01于2014 年6月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏号 CGMCC No. 9360 ;该保藏证明已在中国专利CN104212739A中提交。
【附图说明】
[0024]图1为实施例1中利用蜡样芽孢杆菌LJ01基因组DNA为模板进行PCR扩增产物 鉴定图，其中M为DNA分子量标准；1，2，3为PCR扩增产物。
[0025] 图2为实施例3中构建的重组菌平板生长图，其中a为感受态细胞加无菌水组（阴 性对照组），b为感受态细胞加空质粒组（阳性对照组），c为感受态细胞加重组质粒组（重 组质粒组）。
[0026] 图3为实施例3中构建的重组菌针对NiR基因的PCR目的片段鉴定图，其中M为 DNA分子量标准；1~10为从平皿C上长出的重组菌菌落的PCR扩扩增后的目的片段。
[0027] 图4为实施例4中构建的重组质粒进行酶切鉴定图，a为单酶切鉴定图，