高效降解烯酰吗啉的蜡状芽孢杆菌菌株wl08及其应用及使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物技术领域，尤其是一种高效降解烯酰吗啉的蜡状芽孢杆菌菌株WL08及其应用及使用方法。
【背景技术】
[0002]稀酰吗啉（Dimethomorph)化学名称为（E,Z)-4-[3_(4-氯苯基）3_(3, 4-二甲氧 基苯基）丙烯酰]吗啉。烯酰吗啉属于吗啉类广谱性杀菌剂，是专一杀卵菌纲真菌杀菌剂， 其作用特点是破坏细胞壁膜的形成，对卵菌生活史的各个阶段都有作用，在孢子囊梗和卵 孢子的形成阶段尤为敏感，在极低浓度下（〈0.25yg/ml)即受到抑制，并且对苯酰胺类杀 菌剂的抗性和敏感菌株都有较高的活性。在实际应用中，烯酰吗啉（DMM)是继甲霜灵之后 防治卵菌病害的又一种理想的杀菌荆，特别适合于苯酰胺类杀菌剂抗性病原个体占优势的 田间进行抗药性治理，对农作物发生的霜霉病和疫霉病有特效，是我国当前广泛使用的杀 菌剂之一，可用十字花科蔬菜于葡萄、黄瓜和番茄等作物，有着较广阔的应用前景。
[0003]随着农药使用量的增加及加入WT0后日益森严的检测制度，我国农药残留问题显 得日益突出。就作物种类而言，我国单位面积农药用量最大的是占农作物播种面积10%的 蔬菜，因而蔬菜中农药残留问题最为严重。近年来由于烯酰吗啉及其复配农药品种和使用 量不断增长，其在农产品和环境中的残留问题已引起越来越多的关注。烯酰吗啉可通过叶 面喷雾和土壤灌药进入土壤，烯酰吗啉还可以通过各种途径进入地表水或地下水，对水体 质量构成威胁。此外，由于烯酰吗啉进对水生生物有毒，可能对水体环境产生长期不良影 响。因此，消除环境中烯酰吗啉的残留污染引起科研工作者的高度重视，已成为一个重要的 研究课题。
[0004] 生物修复（Bioremediation)技术因其操作简便、经济实用、环境友好等优点，已 成为处理环境中有机污染物的有效措施。国际上已有利用生物修复技术成功治理石油污染 的先例。近年来，研究利用生物修复技术治理农药残留污染已成为研究热点。目前许多发达 国家和大公司都投入巨资以从事农药残留生物降解制剂的研究和开发，如美国BCI公司、 美国工程服务生物修复公司已经将降解制剂产品规模化生产，国内的北京佳农新贸易发展 有限公司已成功生产"比亚"生物降解制剂可用于去除有机磷类农药残留。但是，由于农药 结构多样性，而微生物降解农药往往具有很强的针对性，导致现有降解菌资源库远不能满 足农药残留污染生物修复的实际需求。目前市场上还没有可以工业化生产和大面积使用的 烯酰吗啉残留降解剂产品问世。因此，有针对性地筛选高效降解菌株，制备微生物修复剂， 通过人工接种加速环境中农药的降解，消除残留药害是一项十分必要的工作和切实可行的 途径。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是：提供一种高效降解烯酰吗啉的蜡状芽孢杆菌菌株WL08。
[0006] 本发明的另一目的是提供该菌株在降解烯酰吗啉农药残留中的应用。
[0007] 本发明的另一目的是提供所述菌株在制备降解烯酰吗啉菌剂中的应用。
[0008] 本发明的另一目的是提供一种降解烯酰吗啉的制剂。
[0009] 本发明是这样实现的：高效降解烯酰吗啉的蜡状芽孢杆菌菌株WL08,其保藏号为 CCTCCNO:M2015399。
[0010] 该菌株16SrDNA序列如SEQIDNO. 1所示。
[0011] 高效降解烯酰吗啉的蜡状芽孢杆菌菌株WL08在降解烯酰吗啉农药残留中的应 用。
[0012] 生产烯酰吗啉残留降解菌剂的方法，包括如下步骤： 1) 将蜡状芽孢杆菌菌株WL08斜面保存试管种子，接种至无机盐培养基中，振荡培养至 对数生长期，获得菌液； 2) 将获得的菌液以10%的体积百分比的接种量接种至含有无机盐培养基的种子发酵 罐中，培养至对数生长期，获得种子液； 3) 将获得的种子液按照10%的体积比的接种量接种入发酵培养基中，在30~35°C、 150~200rpm下发酵培养45-50h，获得发酵液，发酵液的菌数大于3. 0X109cfu/mL，将发 酵液直接稀释5-20倍作为液体菌剂；或将发酵液用生物碳或硅藻土吸附，形成固体菌剂， 调整菌数为1. 5X10s-2. 8X109cfu/g，然后分装为袋装产品。
[0013] 在种子发酵罐和生产发酵罐的培养过程中，无菌空气的通气量为0. 40~0. 60m3/ min，搅拌速度为150~200r/min，温度30~35°C，种子罐的培养时间及生产发酵罐的培 养时间均为45-50h，发酵结束后菌体数量大于3.OX109cfu/mL。
[0014] 步骤2)中所述的发酵培养基与步骤3)中所述的发酵培养基相同，其组成按质量 百分比比计算，包括酵母膏0. 5%，蛋白胨1%，葡萄糖0. 5%，NaCl1%，其余为水，pH7。
[0015] 步骤1)及步骤2)中所述的无机盐培养基，KH2P04 0 . 4g，K2HP04 0 . 4g，NH4C1 1 g，MgCl20.1g，Na2S04 1.42 5g，FeS04.7H20 0.025g，微量元素液 10mL，加蒸馏水定容至 1100mL，pH7. 0,高压蒸汽灭菌（121°C，20min);其中微量元素液组成如下：ZnS04.7H20 1. 1g，MgS04 ?H20 0? 58g，（NH4)6M〇7024 ? 4H20 0? 18g，C〇S04 ? 7H20 0? 024g，CuS04 ? 5H20 0? 077g，H3B03 0? 029g，NaN03 ? 4H20 0? 074g，蒸馏水 1L。
[0016] 蜡状芽孢杆菌UsciWyscereys)WL08,该菌种保存在中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)，地址为中国武汉，武汉大学，保藏号为CCTCCN0:M2015399,保藏日期为2015年6 月19日。
[0017] 所述菌株经形态学特征、生理生化特性、16SrDNA序列分析鉴定为蜡状芽孢杆菌 该菌株在在牛肉膏蛋白胨固体平板上生长很快，呈圆形或近似圆形、 质地软、稍有光泽的白色菌落，生长较快。菌体细胞杆状，成短或长链，芽孢中生，无荚膜。电 子显微镜下观察杆状细胞长直径>1ym。通过生理生化特性测定，显示该菌株革兰氏阳性， 接触酶阳性，氧化酶阴性，VP试验阳性，甲基红试验阳性。该菌可利用葡萄糖、柠檬酸盐；不 利用木糖、L-阿拉伯糖、甘露醇。
【附图说明】
[0018] 附图1为烯酰吗啉标准品色谱图； 附图2为降解菌剂对无机盐培养基中烯酰吗啉（50mg/L)的降解率； 附图3降解菌剂对土壤中烯酰吗啉（50mg/L)的降解动态。
[0019] 由于采用了上述技术方案，本发明筛选获得获得一种蜡状芽孢杆菌 WL08,通过该菌种所制备的烯酰吗啉降解菌剂对烯酰吗啉残留的降解率达到85% 以上，可广泛用于土壤、水体中烯酰吗啉残留污染的修复，也可以在农业生产中直接喷洒于 土壤或植物表面，可在短时间内有效降解去除烯酰吗啉农药残留，保护生态环境和人类健 康，且使用方便，成本低，去除率达到80%以上。
【具体实施方式】
[0020] 本发明的实施例1 :高效降解烯酰吗啉的蜡状芽孢杆菌菌株WL08的分离与鉴定： 1)蜡状芽孢杆菌菌株WL08的分离 称取长期受烯酰吗啉污染土壤10g于250mL三角锥形瓶中，加入100mL无机盐培养 基，添加烯酰吗啉至浓度为100mg/L，三角锥形瓶置于摇床（30°C，200rpm的上培养7d，取 5mL培养液接种至新鲜基础培养基(烯酰吗啉100mg/L)中，然后在30°C摇瓶培养7d，依 次类推，按烯酰吗啉100mg/L的浓度梯度增长，使最终富集培养液除草剂的浓度达到1000 mg/L，得到富集的降解菌株。
[0021] 降解菌株富集分离过程中，每2次转接后，将菌悬液制备成10 2~10 6系列稀释 液，用涂布法分别在固体分离纯化培养基上进行分离，30°C培养两天，根据其不同的外观形 态和特征挑取单菌落，反复划线纯化，并根据菌落外观形态特征和显微形态观察的菌体形 态特征合并相同的菌株，并将所得的菌株接种于固体分离纯化培养基斜面，保存、备用。
[0022] 经过大量的富集培养，分离到能够在含烯酰吗啉1000mg/L的分离培养基上生长 的菌株10余株，并使用气相色谱法（GC)验证其降解效果。进一步筛选后，获得一个编号为 WL08的菌株，命名为降解菌WL08,该菌株能够在纯培养条件下，将初始浓度50. 0mg/L的烯 酰吗啉在7d内降解80%以上。
[0023]GC测定条件：气相色谱仪GC-2010plus(日本岛津公司）；RTX-5毛细管柱（30 mXO. 32mmXO. 25ym);进样口温度290°C;检测器温度300°C;柱温升温程序：120°C保持 2.0min，30°C/min升至 290°C，保持 15min;载气（N2)流速：30mL/min，氢气流速：40mL/ min，空气流速：400mL/min;不分流进样，进样量1yL;保留时间：稀酰吗啉Z式约为16. 1 min、E式约16. 7min，典型色谱图见图1。
[0024] 2)蜡状芽孢杆菌菌株WL08的鉴定 (1)降解菌WL08的形态学鉴定：将处于对数生长期，且菌落大小稳定，上述步骤一分离 并纯化得到的蜡状芽孢杆菌菌株WL08进行单菌落状态描述，主要包括菌落的大小、颜色、 透明度、湿润度、菌落表面状态、菌落边缘状态。对于处于对数生长期的所述降解菌WL08，经 涂片染色后采用光学显微镜观察菌体的形态。
[0025] 结果表明，上述步骤一分离并纯化得到的降解菌WL08在牛肉膏蛋白胨固体平板 上生长很快，呈圆形或近似圆形、质地软、稍有光泽的白色菌落，生长较快。菌体细胞杆状， 成短或长链，芽孢中生，无荚膜。电子显微镜下观察杆状细胞长直径>1ym。
[0026] (2)生理生化特征分析 参考《微生物学实验》（沈萍，范秀容，李广武.微生物学实验（第三版）.北京：高等 教育出版社，1999.)和《常见细菌系统鉴定手册》（东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手 册.北京：科学出版社，2011.)测定降解菌WL08的生理生化特征。
[0027] 测定结果显示该菌株菌株革兰氏阳性，接触酶阳性，氧化酶阴性，VP试验阳性，甲 基红试验阳性。该菌可利用葡萄糖、柠檬酸盐；不利用木糖、L-阿拉伯糖、甘露醇。所述降 解菌WL08的生理生化特征测定结果如表1所示。
[0028] (3)降解菌16SrDNA的同源性分析 DNA测序由中国科学院微生物研究所完成，测序结果用Blast软件Genbank中的16S rDNA序列进行同源性比较。