检测食品中蜡样芽孢杆菌的含扩增内标的pcr方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测食品中蜡样芽孢杆菌的有扩增内标 的PCR方法及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 蜡样芽孢杆菌是一种产芽孢的革兰氏染色阳性杆菌，在自然界中分布广泛，常存 在于土壤、灰尘、污水中，植物和许多生熟食品中常见。目前已从多种食品种分离出该菌，包 括肉、乳制品、蔬菜、鱼、土豆、糊、酱油、布丁、炒米饭以及各种甜点等。人类食用受蜡样芽孢 杆菌污染的食物可能引起食物中毒，症状通常表现为恶心、呕吐、腹泻等胃肠道感染症状， 也可导致胃肠外感染，如脑膜炎、肺炎、心内膜炎和全身性感染等。我国每年都有很多因食 用受蜡样芽孢杆菌污染的食品而导致的食物中毒事件，严重威胁人民群众的生命健康。因 此，建立一种能快速检测食品中蜡样芽孢杆菌的检测方法，对我国人民的公共卫生安全具 有重要意义。
[0003] 目前蜡样芽孢杆菌的检测方法主要有培养法、实时荧光定量PCR (real-time PCR) 方法、环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)方法和酶 联免疫吸附方法（Enzyme Linked ImmunosorbentAssay，ELISA)等。我国赌样芽孢杆菌的 国家标准检测方法（GB 4789. 14-2014)以及出入境检验检疫行业标准（SN/T 0176-2013) 都采用的是培养法，需要经过增菌培养、分离纯培养、生化鉴定等实验过程，耗时费力特异 性不强，对于仍然具有致病性的"活的非可培养状态"（Viable But Non-Culturable，VBNC) 的细菌敏感性较低，可能导致检测结果呈假阴性。
【发明内容】
[0004] 鉴于上述各种方法的不足，本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种检测周期 短、敏感性高、特异性强、操作简单、成本低廉、可准确地检测食品中蜡样芽孢杆菌的试剂盒 及方法，可在Id之内得到结果，同时无需昂贵的仪器和复杂的试剂，避免因为样品存在DNA 聚合酶的抑制因子而得到假阴性结果，可用于多种食品中蜡样芽孢杆菌的检测等。
[0005] 本发明的技术解决方案是：
[0006] -种检测食品中蜡样芽孢杆菌的有扩增内标的PCR方法及试剂盒，其特殊之处在 于：
[0007] 该试剂盒包含：无菌去离子水，PCR反应预混液，对照品：
[0008] 所述PCR反应预混液含有PCR反应缓冲液，MgCl2，脱氧核糖核苷三磷酸，检测用引 物，扩增内标对照Taq DNA聚合酶，DNA染料；
[0009] 所述检测用引物为如下4条引物的混合物：
[0010] A：AAGAATCCTGATGTGAATTTTGAGG
[0011] B:CCCTTGCTACTCCGACTATAATACC
[0012] C：GGAATTCGCAGTGATCGCCGCTTGAG
[0013] D:CGCGTCGACAGCATCGCGGTTATAGG
[0014] 所述对照品分为阴性对照品和阳性对照品，阴性对照品为引物C和引物D为引物 进行PCR扩增后得到的扩增产物的重组质粒，阳性对照品为混合质粒。
[0015] 所述重组质粒的制备方法是：分别用A/B和C/D两对引物与相应的模板DNA进行 扩增，将扩增产物回收纯化后连接至PMD 19 (simple)-T载体，转化至大肠杆菌T0P10感受 态细胞，接种至含抗生素的培养基上培养，PCR筛选阳性菌落后进行测序验证。取经验证后 序列正确无误的细菌进行扩大培养，提取质粒，再把两种质粒进行混合，作为阳性对照。
[0016] 一种检测食品中蜡样芽孢杆菌的有扩增内标的PCR方法，其具体操作步骤是：
[0017] (a)样品的米集：无菌米集可疑食品；
[0018] (b)增菌培养：将采集的可疑食品混合均匀后无菌取样25g，放入无菌研钵、组织 研磨器内研磨碎或放入均质袋内均质2min，加入无菌的LB培养基225ml，37 ± I °C振荡培养 l〇h，得增菌液；
[0019] ((3)0嫩提取：取培养后的增菌液，振荡混匀，取1.51111于离心管中100017^11离心 lmin，除去较大块的食品碎片，取上清10000r/min离心10min，除去上清液，用无菌去离子 水重悬、洗绦沉淀，l〇〇〇〇r/min离心10min，弃上清，用少量无菌去离子水重悬沉淀，沸水浴 5min，冰浴5min，取上清液，得样品模板DNA ;
[0020] (d)PCR反应管制备：PCR反应管的制备及PCR反应预混液的融化置于冰上进行。 依次取PCR反应预混液24ul、样品模板DNA Iul加入至PCR反应管中混合均匀，制得样品模 板DNA的PCR反应管；按样品模板DNA的PCR反应管的制备方法依次制备阴性对照品和阳 性对照品的PCR反应管；阴性对照品的PCR反应管中的样品模板DNA用试剂盒中的阴性对 照品代替，阳性对照品的PCR反应管中的样品模板DNA用试剂盒中提供的阳性对照品代替； 每扩增一次都要至少有一管阴性对照和一管阳性对照。
[0021] (e)扩增检测：将制备好的样品模板DNA、阴性对照品、阳性对照品的PCR反应管置 于PCR仪上进行PCR扩增，得PCR扩增产物，PCR的具体反应程序为：94°C预变性4min ;94°C 变性30s，51. 2°C退火30s，72°C延伸75s，共30个循环；72°C延伸IOmin。
[0022] (f)检测结果判定：取I. 5g琼脂糖溶于IOOrnl电泳缓冲液中，混合均匀后煮沸，冷 却，倾倒凝胶板；凝胶冷却凝固后，将PCR扩增产物2-5ul加入凝胶孔中进行电泳；电泳结 束后，将凝胶放置于紫外灯下观察，判定结果：①阳性对照的凝胶孔有2条电泳条带而阴性 对照的凝胶孔有1条带，则PCR反应检测成功；②若阳性对照的凝胶孔有2条带，阴性对照 有1条带，被检样品无条带，则说明提取的DNA中含有抑制PCR反应的因素，建议重新提取 DNA后再进行检测；③若阴性对照有2条带，说明PCR反应管制备过程中有交叉污染，结果 不可靠，建议重新进行PCR检测；④阳性对照有2条带，阴性对照有1条带，被检样品的凝 胶孔只出现1条约1164bp的电泳条带与阳性对照的凝胶孔相应条带大小一致，则结果判断 为阴性；⑤被检样品的凝胶孔出现的2条电泳条带与阳性对照的凝胶孔中相应条带大小一 致，阴性对照有1条带，则判定为被检样品阳性。
[0023] 所LB培养基是采用胰蛋白胨10g、酵母5g、氯化钠 IOg及蒸馏水1000ml，加热搅拌 溶解，使用氢氧化钠调节pH至7. 0,在121 °C高压蒸汽灭菌20min制得。
[0024] 所述电泳的条件为电场强度5V/cm，电泳时间40min。
[0025] 本发明的有益效果：与现有的检测方法相比，本试剂盒及检测方法使用方便、可靠 性好、检测周期短、灵敏度高、特异性强、成本低廉、操作步骤简单，适用于高通量操作、标准 化操作，又能鉴别因试剂中存在PCR反应抑制成分而导致的假阴性结果，对提高食品安全 水平具有重要意义。
【附图说明】
[0026] 图1检测成功的结果；
[0027] 图2提取的DNA中有PCR抑制剂时扩增得到的结果；
[0028] 图3 PCR反应管制备过程中有交叉污染时扩增得到的结果；
[0029] 图4检测样品中蜡样芽孢杆菌阴性时扩增得到的结果；
[0030] 图5检测样品被蜡样芽孢杆菌污染，扩增呈阳性时得到的结果。
[0031] 图中：M-DNA分子量标准；阳-阳性对照品；阴-阴性对照品；检-检测的可疑样 品。
【具体实施方式】
[0032] 实施例
[0033] 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0034] 1.采集食品样品，混合均勾后无菌采集25g或25ml，用无菌均质袋均质2min，与 225ml无菌营养肉汤培养基混合，置于37±1°C增菌培养8-1