专利名称：一种芽孢杆菌高温大曲的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种酿酒大曲的制备方法，具体说涉及一种酿造中国酱香型白酒的高温大曲的制备方法。
背景技术：
中国酱香型白酒(以茅台酒为代表)所使用的高温大曲是自然接种、开放式固态发酵培养，制曲过程培养温度高达60-65°C。由于高温大曲本身制曲温度高,酵母等大部分不耐高温的微生物被淘汰，高温大曲中微生物菌群结构以嗜热性芽孢杆菌为主，高温大曲中嗜热性芽孢杆菌及其产生酶类在制曲过程中的作用机理与酱香型白酒的酱香特征物质构 成是密切相关，成品曲的香气物质是酱香型白酒的酱香的主要来源之一。本发明通过多年对国内多家酱香型白酒的高温大曲研究认识到可以用某些种类芽孢杆菌经纯种培养后加入在制曲原料中制成芽孢杆菌的高温大曲，这种芽孢杆菌高温大曲外观黄褐色，表皮薄，断面黄褐色有少量灰白色，酱香浓郁的特点，酱香型白酒的酱香的前提物质如酚类、吡嗪等含量比较大，可以作为酿造酱香型白酒增香作用的高温大曲。因此，利用芽孢杆菌高温大曲与原有传统高温大曲搭配，以一定的比例酿造酱香型白酒，可以提高酱香型白酒的质量和产酒率，对于发展高档酱香型白酒，提高企业经济效益具有现实意义和应用前景。
发明内容
本发明拟将芽孢杆菌培养液与制曲原料按一定比例进行混合，通过二次培菌发酵技术制备芽孢杆菌高温大曲。利用这种芽孢杆菌高温大曲与原有传统高温大曲搭配比例进行酿造酱香型白酒可以提升酱香型白酒的质量，提高优质酒产酒率，增加高档酱香型白酒产量。为实现本发明的目的而采用技术方案如下
取ACCC10608腊状芽孢杆菌、ACCCl 1090地衣芽孢杆菌、ACCC10615短小芽孢杆菌、ACCC10618枯草芽孢杆菌和ACCC10152纳豆芽孢杆菌各I株，分别接种于营养肉汁琼脂斜面培养基上，37°C培养18 24h，制成5种芽孢杆菌一级种子。将5种芽孢杆菌斜面培养基的一级种子用无菌水刮洗下来，分别放入内装无菌玻璃珠的灭菌三角瓶中，振荡，分别制成均匀的菌悬液。菌悬液经80°C水浴加热IOmin后，以占液体培养基5%体积的接种量，分别接入液体培养基中，在37°C、pH值7. 0条件下，以200r/min,培养20 48h制成5种芽孢杆菌二级种子液。将5种芽孢杆菌二级种子液分别经80°C水浴加热IOmin后，按占自动控温发酵罐中液体培养基10%体积的接种量，分别接入5个自动控温发酵罐，罐装液量50 75% (v/v)，以150r/min，37°C培养20 25h，制成5罐芽孢杆菌扩大培养种子液。分别取出5罐中的芽孢杆菌扩大培养种子液进行混合，配制成芽孢杆菌混合液备用。芽孢杆菌扩大培养种子液混合的体积量比例为腊状芽孢杆菌地衣芽孢杆菌短小芽孢杆菌枯草芽孢杆菌纳豆芽孢杆菌=1 :1 :1 :0. 5 0. 5。
以小麦和豌豆为原料，分别将小麦和豌豆进行粉碎成粉，按重量计，豌豆粉小麦粉=1 :4 5比例混合后经过蒸汽杀菌、冷却后作为曲料粉备用。小麦粉要求过20目筛子的粗粉粒含有小麦表皮65%，小麦细粉35%，豌豆粉碎成细粉为佳。将备用的芽孢杆菌混合液按照I : 15 20的体积比加水稀释，按Ikg曲料粉加入0. 04kg芽孢杆菌稀释液混合拌匀成带菌的曲料，将带菌的曲料装入曲模踩曲、出模曲块放置阴干I. 5小时后搬入曲房。在曲房里曲块进行第一次自然升温培菌发酵培养，曲块自然升温培菌发酵5 6天后，待中间曲块温度上升至56 58 V时进行翻曲，翻曲后控制曲温不超过翻曲时最高曲温，经9 10天左右进行再次翻曲，再经过15 20天培菌，曲块通风晾干后粉碎为曲块粉，供下一步工序备用。将小麦和高粱分别进行粉碎成粉。小麦粉要求过20目筛子的粗粉粒含有表皮 65%，细粉35%。高粱粉要求过40目筛子的碎粒30%，细粉70%。将曲块粉、高粱粉和小麦粉进行混合拌匀成曲料干粉，按重量计曲块粉高粱粉小麦粉=3 1 6 ;按照曲料干粉的重量加35%水拌成湿曲料，用稀氨水调整pH为7. 2 7. 5。将湿曲料装入曲模踩曲，出模曲块放置I. 5小时后搬入曲房。在曲房进行第二次自然升温培菌发酵培养。培养5 6天后中间曲块温度上升至65 68°C时进行翻曲，翻曲后控制曲温不超过翻曲时最高曲温，经9 10天左右进行再次翻曲，30 40天后将曲块搬入库房贮存。在曲库房贮存3 4个月后出库即制成芽孢杆菌高温大曲的成品曲。芽孢杆菌高温大曲外观黄褐色兼有棕褐色，表皮薄，断面黄褐色有少量灰白色，酱香浓郁的特点，理化指标检测糖化酶活力100-300 (mg葡萄糖/ h. g曲)、水分10 12%、酸度1. 6 2. 2(NaOH mL/g)、酯化力^ 6. 0 (mg/g 100h)。所述的营养肉汁琼脂斜面培养基的配方为蛋白胨5g、牛肉膏30g、NaCl 5g、琼脂15g、IL蒸馏水，调自pH值7. O。所述的液体培养基组成为1L蒸馏水、20g葡萄糖、15g蛋白胨、5g氯化钠、0. 5g牛肉膏，pH值7. 0。所用菌株ACCC10608腊状芽孢杆菌、ACCCl 1090地衣芽孢杆菌、ACCC10615短小芽孢杆菌、ACCC10618枯草芽孢杆菌和ACCC10152纳豆芽孢杆菌购自中国微生物菌种网(http://www. mum800. com)。
具体实施例方式实施例I。芽孢杆菌混合液制备选择ACCC10608腊状芽孢杆菌、ACCCl 1090地衣芽孢杆菌、ACCC10615短小芽孢杆菌、ACCC10618枯草芽孢杆菌和ACCC10152纳豆芽孢杆菌各I株，分别接种于营养肉汁琼脂斜面培养基上，37°C培养20h，制成5种芽孢杆菌一级种子。分别将5种芽孢杆菌斜面培养基一级种子用无菌水刮洗下来，分别放入内装无菌玻璃珠的灭菌三角瓶中，振荡，制成均匀的菌悬液，菌悬液在80°C水浴加热IOmin后，再分别取15ml的菌悬液接种在装有300ml液体培养基的IOOOml三角瓶中，在37°C、pH值7. 0条件下，以200r/min培养30 h制成5种芽孢杆菌二级种子液。分别将5种芽孢杆菌二级种子液经80°C水浴加热IOmin后，再分别取250ml的芽孢杆菌二级种子液接种在装有2500ml液体培养基的5个5L自动控温发酵罐中，以150r/min, 37°C培养20h，制成5罐芽孢杆菌扩大培养种子液。分别取出5罐中的2000ml腊状芽孢杆菌，2000ml份地衣芽孢杆菌，2000ml份短小芽孢杆菌，IOOOml份枯草芽孢杆菌和IOOOml纳豆芽孢杆菌扩大培养种子液进行混合，配制成芽孢杆菌混合液备用。取小麦和豌豆分别粉碎 成粉。小麦粉要求过20目筛子的粗粉粒含有表皮65%，细粉35%，豌豆粉碎成细粉为佳。160kg小麦粉与40kg豌豆粉混合经过蒸汽杀菌、冷却后作为曲料粉备用。取备用的芽孢杆菌混合液6L，加入90L水进行稀释，取稀释后的80kg芽孢杆菌稀释液与200kg的曲料粉混合拌匀成带菌的曲料；将曲料装入曲模踩曲、出模曲块放置I. 5小时后将曲块搬入曲房。在曲房里进行第一次自然升温培菌发酵培养，曲块自然升温培菌发酵6天后，待中间曲块温度上升至56°C后进行翻曲，翻曲后控制曲温不超过56°C，经10天左右进行再次翻曲，再经过18天培菌，曲块通风晾干后粉碎为曲块粉，供下一步工序备用。将小麦和高粱进行粉碎成粉。小麦粉要求过20目筛子的粗粉粒含有表皮65%，细粉35%。高粱粉要求过40目筛子的碎粒30%，细粉70%。按重量份计将150kg曲块粉、50kg高粱粉和300kg小麦粉进行混合拌匀成曲料干粉，按照曲料干粉的重量份加175kg水拌成湿曲料，用稀氨水调整PH为7. 2。将湿曲料装入曲模踩紧，出模曲块自然放置I. 5小时后搬入曲房。在曲房进行第二次自然升温堆曲发酵培养。培养5天后中间曲块温度上升至65°C后进行翻曲，翻曲后控制曲温不超过65°C，经9天左右进行再次翻曲，40天后将曲块搬入库房贮存。在库房贮存4个月后出库即制成芽孢杆菌高温大曲的成品曲。成品曲外观黄褐色，表皮薄，断面黄褐色有少量灰白色，酱香浓郁的特点，理化指标检测糖化酶活力240 (mg葡萄糖 / h. g 曲)、水分 10. 8 %、酸度 2. 0 (NaOH mL/g)、酯化力 6. 5 (mg/g 100h)。上述的营养肉汁琼脂斜面培养基的配方为蛋白胨5g、牛肉膏30g、NaCl 5g、琼脂15g、IL蒸馏水，调自pH值7. O。上述的液体培养基组成为1L蒸馏水、20g葡萄糖、15g蛋白胨、5g氯化钠、0. 5g牛肉膏，pH值7. O。本实施例所用的芽孢杆菌菌种，购自中国微生物菌种网(http://www. mum800. com)。实施例2。选择ACCC10608腊状芽孢杆菌、ACCCl 1090地衣芽孢杆菌、ACCC10615短小芽孢杆菌、ACCC10618枯草芽孢杆菌和ACCC10152纳豆芽孢杆菌各I株，分别接种于营养肉汁琼脂斜面培养基上，37°C培养24h，制成5种芽孢杆菌一级种子。分别将5种芽孢杆菌一级种子用无菌水刮洗下来，分别放入内装无菌玻璃珠的灭菌三角瓶中，振荡，制成均匀的菌悬液，80°C水浴加热IOmin制成，再分别取20ml的孢子悬液接种在装有400ml液体培养基的IOOOml三角瓶中，在37°C、pH值7. 0条件下，以200r/min培养40 h制成5种芽孢杆菌二级种子液。分别将5种芽孢杆菌二级种子液经80°C水浴加热IOmin后，再分别取300ml的芽孢杆菌二级种子液接种在装有3000ml液体培养基的5个5L自动控温发酵罐中，以150r/min, 37°C培养25h，制成5罐芽孢杆菌扩大培养种子液。
分别取出5罐中的2000ml腊状芽孢杆菌，2000ml份地衣芽孢杆菌，2000ml份短小芽孢杆菌，IOOOml份枯草芽孢杆菌和IOOOml纳豆芽孢杆菌扩大培养种子液进行混合，配制成芽孢杆菌混合液备用。取小麦和豌豆分别粉碎成粉，小麦粉要求过20目筛子的粗粉粒含有表皮65%，细粉35%，豌豆粉碎成细粉为佳。200kg小麦粉与40kg豌豆粉混合经过蒸汽杀菌、冷却后作为曲料粉备用。取备用的芽孢杆菌混合液5L，加入100L水进行稀释，以96kg芽孢杆菌稀释液与240kg曲料粉进行混合拌匀成带菌的曲料；将曲料装入曲模踩曲、出模曲块放置I. 5小时后搬入曲房，在曲房里进行第一次自然升温培菌发酵培养，曲块自然升温培菌发酵6天后，待中间曲块温度上升至58 °C后进行翻曲，翻曲后控制曲温不超过58 °C，经9天进行再次翻曲，再经过20天培菌，曲块通风晾干后粉碎为曲块粉，供下一步工序备用。将小麦和高粱进行粉碎成粉。小麦粉要求过20目筛子的粗粉粒含有表皮65%，细粉35%。高粱粉要求过40目筛子的碎粒30%，细粉70%。按重量份计将180kg曲块粉、60 kg高粱粉和360kg小麦粉进行混合拌匀成曲料干粉，按照曲料干粉的重量份加210kg水拌成湿曲料，用稀氨水调整PH为7. 3。将湿曲料装入曲模踩曲，出模曲块放置I. 5小时后搬入曲房。在曲房进行第二次自然升温培菌发酵培养。培养6天，待中间曲块温度上升至68°〇后进行翻曲，翻曲后控制曲温不得超过68°C，经10天左右进行再次翻曲，35天后将曲块搬入库房贮存。在库房贮存100天后出库即制成芽孢杆菌高温大曲的成品曲。成品曲外观黄褐色，表皮薄，断面黄褐色有少量灰白色，酱香浓郁的特点，理化指标检测糖化酶活力213 (mg葡萄糖 / h. g 曲)、水分 11. 6 %、酸度 2. 2 (NaOH mL/g)、酯化力 6. 8 (mg/g 100h)。上述的营养肉汁琼脂斜面培养基的配方为蛋白胨5g、牛肉膏30g、NaCl 5g、琼脂15g、IL蒸馏水，调自pH值7. O。上述的液体培养基组成为1L蒸馏水、20g葡萄糖、15g蛋白胨、5g氯化钠、0. 5g牛肉膏，pH值7. O。本实施例所用的芽孢杆菌菌种，购自中国微生物菌种网(http://www. mum800. com)。
权利要求
1.ー种芽孢杆菌高温大曲的制备方法，其特征是 1)取ACCC10608腊状芽孢杆菌、ACCCl1090地衣芽孢杆菌、ACCC10615短小芽孢杆菌、ACCC10618枯草芽孢杆菌和ACCC10152納豆芽孢杆菌各I株，分别接种于营养肉汁琼脂斜面培养基上，37°C培养18 24h，制成5种芽孢杆菌ー级种子； 2)将5种芽孢杆菌斜面培养基的一级种子用无菌水刮洗下来，分别放入内装无菌玻璃珠的灭菌三角瓶中，振荡，分别制成均匀的菌悬液； 3)菌悬液经80°C水浴加热IOmin后，以占液体培养基5%体积的接种量，分别接入液体培养基中，培养制成5种芽孢杆菌ニ级种子液； 4)将5种芽孢杆菌ニ级种子液分别经80°C水浴加热IOmin后，按占自动控温发酵罐中液体培养基10%体积的接种量，分别接入5个自动控温发酵罐，以150r/min，37°C培养20 25h，制成5罐芽孢杆菌扩大培养种子液； 5)分别取出5罐中的芽孢杆菌扩大培养种子液进行混合，按照体积量比例为腊状芽孢杆菌地衣芽孢杆菌短小芽孢杆菌枯草芽孢杆菌納豆芽孢杆菌=1 :1 :1 :0. 5 :0. 5配制成芽孢杆菌混合液备用； 6)以小麦和豌豆为原料，分别将小麦和豌豆进行粉碎成粉，按重量计，豌豆粉小麦粉=1 :4 5比例混合后经过蒸汽杀菌、冷却后作为曲料粉备用； 7)将备用的芽孢杆菌混合液加水稀释后加入到曲料粉中，混合拌匀成带菌的曲料，将带菌的曲料装入曲模踩曲、出模后的曲块放置阴干I. 5小时后搬入曲房； 8)在曲房里曲块进行第一次自然升温培菌发酵培养，发酵培养过程中位于曲房里中间位置的曲块温度控制在58°C之内，培养后曲块通风晾干、粉碎为曲块粉，备用； 9)将小麦和高粱分别进行粉碎成粉，与步骤8中备用的曲块粉，以重量计曲块粉高粱粉小麦粉=3 1 6进行混合拌匀成曲料干粉；按照曲料干粉的重量加35%水拌成湿曲料，用稀氨水调整PH为7. 2 7. 5，将湿曲料装入曲模踩曲，出模曲块放置I. 5小时后搬入曲房进行第二次自然升温培菌发酵培养，发酵培养过程中位于曲房里中间位置的曲块温度控制在温度68°C之内，经第二次自然升温培菌发酵培养后曲块在曲库房贮存3 4个月后出库即制成芽孢杆菌高温大曲的成品曲。
2.根据权利要求I所述的ー种芽孢杆菌高温大曲的制备方法，其特征是营养肉汁琼脂斜面培养基的配方为蛋白胨5g、牛肉膏30g、NaCl 5g、琼脂15g、IL蒸馏水，pH值7· O。
3.根据权利要求I所述的ー种芽孢杆菌高温大曲的制备方法，其特征是所述的液体培养基组成为1L蒸馏水、20g葡萄糖、15g蛋白胨、5g氯化钠、O. 5g牛肉膏，pH值7. O。
4.根据权利要求I所述的ー种芽孢杆菌高温大曲的制备方法，其特征是所述的菌悬液接种于液体培养基后，是在37°C、pH值7. O条件下，以200r/min，培养20 48h制成5种芽孢杆菌ニ级种子液。
5.根据权利要求I所述的ー种芽孢杆菌高温大曲的制备方法，其特征是所述的小麦粉要求能过20目筛子的粗麦粒含有小麦表皮65%，小麦细粉35% ;高粱粉要求能过40目筛子的碎粒30%，细粉70% ;豌豆粉以细粉为佳。
6.根据权利要求I所述的ー种芽孢杆菌高温大曲的制备方法，其特征是所述的芽孢杆菌混合液是按照I :15 20的体积比加水稀释；稀释后的芽孢杆菌混合液是按Ikg曲料粉加入O. 04kg芽孢杆菌稀释液的比例进行混合拌匀。
7.根据权利要求I所述的ー种芽孢杆菌高温大曲的制备方法，其特征是所述的第一次自然升温培菌发酵培养，是指曲块自然升温培菌发酵5 6天后，待中间曲块温度上升至.56 58°C时进行翻曲，翻曲后控制曲温不超过翻曲时最高曲温，经9 10天左右进行再次翻曲，再经过15 20天培菌，曲块通风晾干后粉碎为曲块粉，供下一歩エ序备用。
8.根据权利要求I所述的ー种芽孢杆菌高温大曲的制备方法，其特征是所述的第二次自然升温培菌发酵培养，是指先培养5 6天后待中间曲块温度上升至65 68°C时进行翻曲，翻曲后控制曲温不超过翻曲时最高曲温，经9 10天左右进行再次翻曲，30 40天后将曲块搬入库房贮存，在曲库房贮存3 4个月后出库即制成芽孢杆菌高温大曲的成品曲。
全文摘要
本发明涉及一种中国酱香型白酒的芽孢杆菌高温大曲制备方法。其技术方案是选用5株芽孢杆菌菌株分别经过一级种子培养、二级种子培养、扩大培养，5株芽孢杆菌扩大培养液以腊状芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌(1110.50.5)比例混合成芽孢杆菌混合液；5种芽孢杆菌混合液、水、和经蒸汽杀菌后曲料粉(由小麦粉和豌豆粉组成)按比率拌料、踩曲、曲块入曲房、第一次升温培菌发酵、翻曲、发酵成熟曲块经通风晾干粉碎成粉，与小麦粉和高粱粉按比例加水拌料、调pH值、踩曲、曲块入曲房、第二次升温培菌发酵、翻曲、经入曲库贮存后为新成的芽孢杆菌高温大曲，可作为酿造酱香型白酒增香作用的高温大曲。
文档编号C12R1/085GK102703358SQ201210191328
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月12日 优先权日2012年6月12日
发明者汤二将, 颜林春, 黄祖新, 黄镇 申请人:福建师范大学