一种固定化芽孢漆酶及其制备与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种固定化芽孢漆酶及其制备与应用，属于固定化技术领域和废水处 理领域。
【背景技术】
[0002] 漆酶（laccase)是一种含铜多酚氧化酶，广泛存在于真菌、细菌、植物和昆虫中。 漆酶可以氧化许多酚类和非酚类物质，包括单酚、二酚、多酚、氨基酚、甲氧基苯酚、芳香胺 和抗坏血酸盐等。漆酶在氧化底物的同时，将氧还原为水，本身不会产生有害物质，是一种 非常环保的生物催化剂。漆酶由于具有宽泛的底物谱和较强的氧化性，在造纸工业、废水处 理、纺织工业、食品加工、生物传感器以及生物诊断等方面都有良好的应用前景。
[0003] 近年来，学者发现，细菌漆酶在碱性条件中的稳定性极高，而且通常比真菌漆酶更 耐热。这说明细菌漆酶在纺织染料脱色应用中可能比真菌漆酶具有更大的潜力。芽孢杆菌 属所产的CotA蛋白是芽孢外衣蛋白的一种，是研宄得最深入的细菌漆酶。芽孢上还可能存 在其他漆酶。所有这些依赖于芽孢并且以芽孢整体作为催化剂的漆酶被称之为芽孢漆酶， 这些芽孢漆酶都具有极强的耐碱和耐热能力。游离的芽孢漆酶虽然比真菌漆酶更耐碱耐 热，但在含有机溶剂、金属离子或抑制剂的溶液中其酶活仍会受到不同程度的抑制，而且难 以重复利用，在工业化应用中受到限制。
[0004] 酶的固定化可以增加酶在各种环境中的稳定性，还可以提高酶的重复利用率，是 一种提高酶的使用价值的常见技术。然而，根据芽孢与固定化方法本身的特点及已有的芽 孢固定化报道可知，芽孢的固定化相比一般酶或菌体的固定化更具难度。芽孢的固定化不 同于一般酶的固定化，它体积大，重量大，不可伸展，难以利用多孔材料对其进行吸附，一般 多孔材料的孔径都小于芽孢，而且所形成的氢键不足以稳固大重量的芽孢，也难以通过包 埋对其进行固定，具非常严重的扩散限制现象，也难以通过共价结合和交联法来对其进行 固定，芽孢与载体间较少的接触面难以提供足够的作用力使其芽孢固定在载体上。芽孢的 固定化也不同于一般的细胞或菌体，因为芽孢的固定化不需要营养成份，不需过分注意剪 切力，尤其是不能像丝头真菌一样能够形成菌丝球或缠绕在多孔材料上生活。
[0005] 本发明旨在提供一种固定化芽孢漆酶，使芽孢漆酶耐碱、耐热，在含有机溶剂或金 属离子或抑制剂的溶液中仍保持较高活力，而且更有利于回收重复利用。
【发明内容】
[0006] 本发明首先提供了一种固定化芽孢漆酶，这种固定化芽孢漆酶耐碱、耐热、在含有 机溶剂或金属离子或抑制剂的溶液中仍保持较高活力，而且更有利于回收重复利用。
[0007] 所述固定化芽孢漆酶通过以下步骤来制备：
[0008] (1)制备芽孢；
[0009] (2)载体预处理：添加1 一 20倍柱体积的去离子水对DEAE-纤维素进行溶涨、搅 拌，并静置过夜；DEAE-纤维素溶涨过夜后沉降下来，倾去含悬浮微粒的上清液，过滤；过滤 所得的DEAE-纤维素，用酸处理0. 5 - 2h，水洗到中性，过滤，再用碱处理0. 5 - 2h，水洗到 中性，过滤并收集；
[0010] (3)将制备好的芽孢按0. 01 - 0. 5g湿重芽孢：lgDEAE-纤维素的比例混合在缓冲 液中，在 4 一 40°C，50 - 250r/min条件下吸附 1 一 48h;
[0011] (4)芽孢与DEAE-纤维素的混合物经混合吸附后，过滤，用缓冲液冲洗0 - 5次，过 滤，收集固定化芽孢漆酶，保藏于〇 - 40°C。
[0012] 其中，DEAE-纤维素为棉纤维，所述的芽孢漆酶的来源菌株包括但不限于 Baci1luspumilusW3〇
[0013] 在本发明的一种实施方式中，步骤（1)所述的芽孢制备包括以下步骤：
[0014] ①将产漆酶的芽孢杆菌属菌株在37°C条件下在生孢培养基上培养2-7d;
[0015] ②以离心转速为6000 - 12000r/min，离心时间为5 - 30min的条件对上述培养物 进行离心，收集芽孢；
[0016] ③水洗芽孢0-3次；
[0017] ④水洗所得的的芽孢加入溶菌酶使其终浓度为0.1 - 2mg/ml，在37°C条件下保温 0. 5 - 3h。
[0018] ⑤溶菌酶处理后，先后经0?lMNaCl和0?1MKC1洗，6000-12000r/min离心5 - 30min收集芽孢。
[0019] ⑥对芽孢进行湿重称量，用去离子水重悬芽孢，浓度为10mg/ml - 100mg/ml。
[0020] 在本发明的一种实施方式中，步骤（1)所述的芽孢制备方法，菌株培养时间为2d， 离心转速为8000r/min，离心时间为lOmin，水洗芽孢1次，所加溶菌酶终浓度为lmg/ml，在 37°C条件下保温的时间为2h。
[0021] 在本发明的一种实施方式中，步骤（2)所述的载体预处理方法，溶涨DEAE-纤维素 的水的体积为5倍柱体积。
[0022] 在本发明的一种实施方式中，步骤（2)所述酸为0. 5MHC1，处理时间为lh。
[0023] 在本发明的一种实施方式中，步骤（2)所述碱为0.5MNaOH，处理时间为lh。
[0024] 在本发明的一种实施方式中，步骤（2)收集载体的方式可以是布氏漏斗或其他抽 滤装置，如果没有抽滤装置，可以使其自然过滤，但需时间更长。收集的载体无需过干，不滴 水即可。
[0025] 在本发明的一种实施方式中，步骤（3)所述吸附过程的条件为：芽孢与DEAE-纤维 素的配比为50mg湿重芽孢：lg干重DEAE-纤维素。
[0026]在本发明的一种实施方式中，步骤（3)、（4)所用缓冲液的离子强度为0. 05M，pH值 范围为5. 0-10. 5的缓冲液。可以是pH5. 0-pH7. 0的柠檬酸一磷酸盐缓冲液，或pH7. 0- 9. 0的Tris-HCl缓冲液，或pH9. 0-10. 5的碳酸钠一碳酸氢钠缓冲液。
[0027] 在本发明的一种实施方式中，步骤（3)所用缓冲液的pH范围为pH8. 0 - 10. 5,最 适pH值为10.0。
[0028] 在本发明的一种实施方式中，步骤（3)吸附过程的温度为37°C，转速180r/min，吸 附时间为l〇h，最适pH范围为8.0 - 10. 5。
[0029]在本发明的一种实施方式中，步骤（4)芽孢与DEAE-纤维素的混合物经混合吸附 后，过滤，用缓冲液冲洗1次，过滤，收集固定化芽孢漆酶，保藏于4°C。
[0030] 本发明还提供应用上述固定化芽孢漆酶对纺织染料废水进行脱色处理的方法，是 向染料废水中添加适量固定化芽孢漆酶，在适当温度、pH条件下，对纺织染料废水进行脱色 处理。
[0031] 所述染料废水中的染料包括但不限于甲基绿、甲基红、酸性红1和结晶紫。
[0032] 所述脱色处理的pH条件为3.0-10.0。不同染料的最适脱色pH值可能会有不 同。
[0033] 所述脱色处理的的温度范围为30 - 70°C。
[0034] 所述脱色处理过程中，可以添加1 一羟基苯并三唑（HBT)、2, 2'-联氮基-双（3-乙 基苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS)、丁香醛、香草醛和4 一羟基苯甲酸中的任一种化合物 作为介体。其中以ABTS的效果最佳，但也可以选用此五种以外的化合物作为介体，或者不 用介体。介体添加浓度可以为0.ImM。
[0035] 针对不同染料脱色时，可先利用游离芽孢漆酶作为催化剂确定漆酶对各种染料脱 色时偏好的反应条件。
[0036] 本发明的优点和有益效果在于：（1)本发明提供的固定化芽孢漆酶仍然保留了芽 孢漆酶广泛的pH适应能力和耐热性；在含有机溶剂、金属离子或抑制剂的溶液中，固定化 芽孢漆酶具有比游离芽孢漆酶更强的稳定性。本发明得到的固定化芽孢漆酶的所有酶学特 性都要优于一般的真菌漆酶。本发明提供的固定化芽孢漆酶可以重复利用8次以上。（2) 本发明所述的固定化芽孢漆酶的制备方法成本低，操作简便，固定化率平均高达90%以上。 (3)本发明所提供的固定化芽孢漆酶应用于纺织染料脱色中，在芽孢量相同的情况下，具有 比游离芽孢漆酶的更强的脱色能力。本发明所提供的固定化芽孢漆酶中的载体-DEAE-纤 维素也能选择性地吸附染料，与漆酶起到互补作用。相对于游离芽孢漆酶而言，本发明所提 供的固定化芽孢漆酶可以使更高浓度的染料脱色。
【附图说明】
[0037] 图1为芽孢量对芽孢漆酶固定化的影响。
[0038] 图2为吸附时间对芽孢漆酶固定化的影响。
[0039]图3为固定化芽孢漆酶在电镜扫描下的状态。
[0040] 图4为固定化芽孢漆酶的pH稳定性。
[0041] 图5为固定化芽孢漆酶的温度稳定性。
[0042] 图6为固定化芽孢漆酶用于染料脱色。
【具体实施方式】
[0043] 漆酶酶活测定方法：将50mg干重DEAE-纤维素所获得的固定化芽孢漆酶置于 3. 5ml缓冲液中，在37°C保温15min，添加底物反应5min，然后冰水浴lOmin以终止反应， 以10000r/min离心反应样品，取上清液检测吸光值。底物为ABTS(0. 5mM)或丁香醛连氮 (0.05禮）或2,6-甲氧基苯酚（21111)，检测波长为42〇11111妳15)、52511111(丁香醛连氮）和 469nm(2, 6 -甲氧基苯酷）。
[0044] 初始酶活是指：