一种ι-卡拉胶酶的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种ι?卡拉胶酶的制备方法，将一株产卡拉胶酶的菌株Pseudoalteromonas carrageenovora ASY5接种于种子培养基中，活化培养后转接于发酵培养基中诱导产酶，分离含ι?卡拉胶酶发酵液获得ι?卡拉胶酶。本发明以ι?卡拉胶作为诱导剂发酵生产ι?卡拉胶酶，建立了ι?卡拉胶酶的发酵生产工艺，对于卡拉胶降解酶及卡拉胶寡糖工业化生产具有良好的应用价值。
【专利说明】
_种1 -卡拉胶酶的制备方法
技术领域
[0001]本发明涉及生物酶的技术领域，特别涉及一种^-卡拉胶酶的制备方法。
【背景技术】
[0002]卡拉胶又称角叉菜胶、鹿角藻胶，是从某些红藻(如麒麟菜属、杉藻属、角叉菜属等)提取的极有经济价值的多糖，是由l，3-13_D-吡喃半乳糖和l，4-a-D-吡喃半乳糖交替连接而成的线性硫酸多糖。具有广泛经济价值的仅有三种:主要为K-型、t-型和λ-型三种，其二糖单元分别含有I个、2个和3个硫酸基。t-型卡拉胶形成的凝胶富于弹性，柔软、触变性，无脱水收缩性，又具有耐高盐等性质，这些与K-型和λ-型胶体有明显的不同，使得其在食品、化妆品、医药等行业中有着广泛的应用价值和潜力。卡拉胶的降解产物卡拉胶寡糖，具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等多种药理活性，有望成为新一代的海洋药物。
[0003]卡拉胶酶(Carrageenase)是一种糖水解酶，它降解卡拉胶的β-l，4糖苷键产生卡拉胶低聚糖。卡拉胶酶不但能作为工具酶用于卡拉胶寡糖的制备，还能用于藻类原生质体的制备和卡拉胶结构的研究，在医药、食品、农业等多个领域具有广泛的应用价值。
[0004]卡拉胶酶主要来源于海洋微生物及海洋软体动物，已在噬纤维菌属、别单胞菌属、假单胞菌属、弧菌属、芽抱杆菌属等属的微生物中发现了卡拉胶酶。目前国内外对K-卡拉胶酶的研究较多，而对1-卡拉胶酶和λ_卡拉胶酶的报道很少。已经报道的K-卡拉胶酶有十几种，且都属于糖苷水解酶16家族，但1-卡拉胶酶研究较少，目前只有来源于W teromonasfort is ^Oellulophaga ^Zobellia galactano voran s Microbuibifer thermo tol erans^ ι -卡拉胶酶，进行了酶学性质等方面的研究及酶的重组表达。因此，寻找高活力的新型1-卡拉胶酶具有重要的理论意义和明确的应用前景。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种卜卡拉胶酶的制备方法，通过发酵生产工艺的优化，以实现生产ι -卡拉胶酶的最佳制备方法。
[0006]为了达到上述目的，本发明解决的技术方案为:
一种ι -卡拉胶酶的制备方法，将产ι -卡拉胶酶的菌种JpSeuc/oa 2 i ero?o/3ascarrageenovora ASY5接种于种子培养基中，23°C活化培养24 h，活化培养后转接于发酵培养基中20°C发酵培养40 h，然后发酵液在4°C、10000 r/min条件下离心20 min，收集上清，即得ι-卡拉胶酶粗酶液。
[0007]作为实施例的优选方式，所述种子培养基为:牛肉膏10g，胰蛋白胨10 g，加入蒸馏水250 mL，调节pH 7.8，水浴10 min，调节pH 7.3，再加入人工海水750 mL，充分混匀后，121°C灭菌15 min，冷却后在4°C下保存备用;所述人工海水中包括氯化钠、氯化钾、二水合氯化钙、六水合氯化镁、碳酸氢钠、七水合硫酸镁的质量分数(g/100 mL)依次为2.8、0.08、0.16、0.48、0.01、0.35。
[0008]作为实施例的优选方式，所述发酵培养基中的氯化钠、酵母粉、二水合氯化钙、十二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠、1-卡拉胶的质量分数(g/100 mL)依次为1.5、1.5、
0.02、0.38、0.13、0.9，充分混匀后，121°(:灭菌15 min，在4°C下保存备用。
[0009]本发明米用的产ι-卡拉胶酶的菌种carrageenovoraASY5，购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号:CICC 23819，前期研究发现，该菌种能够产生降解1-卡拉胶的1-卡拉胶酶。本发明以1-卡拉胶作为诱导剂发酵生产1-卡拉胶酶，建立了 1-卡拉胶酶的发酵生产工艺，通过优化菌株的产酶培养条件和培养基，酶活达到1.24 U/mL，是优化前的2.21倍，这对于卡拉胶降解酶和卡拉胶寡糖的工业化生产具有良好的应用价值。
【附图说明】
[0010]图1为波长520nm处半乳糖标准曲线图；横坐标为相当半乳糖量(yg)，纵坐标为吸光度，直线回归方程为y=0.0034x-0.0333，相关系数:R2=0.9983;
图2为培养时间对菌株生长和产酶的影响图；横坐标为发酵时间(h)，纵坐标为ι-卡拉胶酶相对酶活力(％)，次纵坐标为ι-卡拉胶酶菌体密度Qftoo ；
图3为培养温度对菌株生长和产酶的影响图；横坐标为培养温度(°C)，纵坐标为t-卡拉胶酶相对活力(％)，次纵坐标为1-卡拉胶酶菌体密度Qftoo ；
图4为接种量对菌株生长和产酶的影响图；横坐标为接种量(mL)，纵坐标为1-卡拉胶酶相对活力(％)，次纵坐标为ι -卡拉胶酶菌体密度Qftoo ；
图5为装液量对菌株生长和产酶的影响图；横坐标为装液量(mL)，纵坐标为ι-卡拉胶酶相对活力(％)，次纵坐标为ι -卡拉胶酶菌体密度Qftoo ；
图6为初始pH值对菌株生长和产酶的影响图；横坐标为初始pH值，纵坐标为ι-卡拉胶酶相对活力(％)，次纵坐标为ι -卡拉胶酶菌体密度Qftoo ；
图7为不同碳源对菌株生长和产酶的影响图；横坐标为不同碳源，纵坐标为卜卡拉胶酶相对活力(％)，次纵坐标为ι -卡拉胶酶菌体密度Qftoo ；
图8为碳源添加量对菌株生长和产酶的影响图；横坐标为碳源添加量(％)，纵坐标为卜卡拉胶酶相对活力(％)，次纵坐标为ι-卡拉胶酶菌体密度Qftoo ；
图9为不同氮源对菌株生长和产酶的影响图；横坐标为不同氮源，纵坐标为卜卡拉胶酶相对活力(％)，次纵坐标为ι -卡拉胶酶菌体密度Qftoo ；
图10为氮源添加量对菌株生长和产酶的影响图；横坐标为氮源添加量(％)，纵坐标为卜卡拉胶酶相对活力(％)，次纵坐标为ι-卡拉胶酶菌体密度Qftoo ；
图11为NaCl添加量对菌株生长和产酶的影响图；横坐标为NaCl添加量(g/L)，纵坐标为ι-卡拉胶酶相对活力(％)，次纵坐标为ι-卡拉胶酶菌体密度Qftoo ；
图12为优化前后酶活变化图。
【具体实施方式】
[0011]为使本领域的技术人员能进一步了解本发明，下面列举本发明的具体实施例，并配合说明书附图，详细说明本发明的技术方案。需强调的:实施例并非本发明技术方案所有可能实施方式的穷举，故不用于限制本发明的保护范围。
[0012]实验方法 1、初始培养基的配制
(I)人工海水:氯化钠、氯化钾、二水合氯化钙、六水合氯化镁、碳酸氢钠、七水合硫酸镁的质量分数(g/100 11^)依次为2.8、0.08、0.16、0.48、0.01、0.35。
[0013](2)种子培养基:牛肉膏10 g，胰蛋白胨10 g，加入蒸馏水250 mL，调节pH 7.8，水浴10 min，调节pH 7.3，再加入人工海水750 mL，充分混匀后，121°C灭菌15 min，冷却后在4
°C下保存备用。
[0014](3)发酵培养基:氯化钠、胰蛋白胨、二水合氯化钙、十二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠、ι-卡拉胶的质量分数(g/100 mL)依次为2、0.5、0.02、0.38、0.13、0.5，充分混匀后，121°C灭菌15 min，在4°C下保存备用。
[0015]2 t-卡拉胶酶的制备
(I)菌种的活化:将产卡拉胶酶的菌种Pseudoalteromonas carrageenovora ASY5接种于种子培养基中，23°C活化培养24 ho
[0016](2)发酵培养:菌种活化培养后转接于发酵培养基中，20°C发酵培养40 ho
[0017](3)将上述发酵液在4°C、10000 r/min条件下离心20 min，收集上清，即得ι-卡拉胶酶粗酶液。
[0018]3、卜卡拉胶酶发酵工艺的单因素优化
通过单因素法对产卡拉胶酶菌株进行培养基成分及培养条件进行优化，分析不同因素对菌株ASY5的菌体密度及酶产量的影响，在摇瓶发酵基础上，分别考察了培养时间、培养温度、接种量、装液量、初始PH、碳源、最佳碳源、氮源、最佳氮源对菌株生长和产酶的影响，从而筛选出最佳成分及培养条件。
[0019]4、卜卡拉胶酶活力的测定
发酵液离心后，分别取400 UL新鲜的发酵酶液和经煮沸灭活发酵酶液加入到盛有600t>L浓度为0.5 g/L卜卡拉胶底物的试管中，分别记为实验组和对照组，将二者置于40°C水浴锅中水浴反应40 min，以反应液中还原糖的增加量作为检测酶活力的指标。
[0020]采用DNS(3，5-二硝基水杨酸)法来测定还原糖，先取I mL的反应液于管中再加ImL DNS溶液，在沸水浴反应5 min，冰上冷却10 min左右，用蒸馏水定容至5 mL，以蒸馏水作为空白，于520 nm下测定吸光度值。酶活力单位(U)定义为:在40° C条件下，每分钟产生Imo I还原糖(以半乳糖计)所需要的酶量。
[0021]以半乳糖为标准品，绘制出标准曲线，如图1，横坐标为半乳糖的相当量(yg)，纵坐标为其在520 nm处的光吸收值，由此得到的线性回归方程是:y=0.0034χ_0.0333，R2 =
0.9983)ο
[0022]实施例1:
ι-卡拉胶酶发酵工艺的单因素优化
(I)培养时间对菌株生长和产酶的影响
将活化后的产卡拉胶酶菌种Pseudoalteromonas carrageenovora ASY5接于发酵培养基中，在18°C，选择培养O h、8 h、16 h、24 h、32 h、40 h、48 h、56 h、64 h后，分别测其菌体密度，利用冷冻离心收集酶液，并用DNS法测定酶活，确定培养基的最佳培养时间。
[0023]由图2可知，随着培养时间增加酶活呈上升趋势，在32h-40 h之间，ι-卡拉胶酶活趋于平稳，在40 h酶活达到最高值，在40 h以后酶活开始下降。由此确定菌株ASY5发酵产酶最佳培养时间为40 ho
[0024](2)培养温度对菌株生长和产酶的影响
设置培养温度为16 °C、18 °C、20 °C、22 °C、24 °C、26 °C、28 °C，在最适培养时间下培养，分别测其菌体密度，利用冷冻离心收集酶液，并用DNS法测定酶活，确定培养基的最佳培养温度。
[0025]温度通过影响微生物体内各种生理代谢所需的酶而影响微生物的新陈代谢活动，菌株Pseudoalteromonas carrageenovora ASY5来源于海洋，属于海洋细菌，所以在较低温度时能够生长良好。由图3可知，菌体在20°C时生长得最好。
[0026](3)接种量对菌株生长和产酶的影响
设置接种量为I %、2%、3%、4%、5%、6%、7%，在最适培养时间和培养温度下培养，分别测其菌体密度，利用冷冻离心收集酶液，并用DNS法测定酶活，确定培养基的最佳接种量。
[0027]由图4可知，当接种量由1%增加到4%时，酶活迅速上升，当接种量为4%时卜卡拉胶酶活达到最高，菌体生长最好，所以菌株的最适接种量为4%。
[0028](4)装液量对菌株生长和产酶的影响
将产卡拉胶酶菌株按照25 mL、50 mL、75 mL、100 mL、125 mL的装液量在发酵培养基中进行培养，分别测其菌体密度，然后冷冻离心收集酶液，并用DNS法测定酶活，确定培养基的最佳装液量。
[0029]由图5可知，当250mL三角瓶中装液量为25 mL-125 mL时，酶活呈现先上升后下降的趋势，装液量为50 mL时，产酶量最高，说明发酵液中的溶氧量比较适宜，所以选择最适装液量为50 mL/250 mL。
[0030](5)初始pH值对菌株生长和产酶的影响
设置初始pH值为pH 6、pH 6.5,pH 7、pH 7.5,pH 8、pH 8.5,pH 9、pH 9.5，在上述最适培养条件下培养，分别测其菌体密度，利用冷冻离心收集酶液，并用DNS法测定酶活，确定培养基的最适初始pH值。
[0031 ]由图6可知，当pH为6.0-9.5时，卡拉胶酶活力随着pH值的增加，呈现先增加后降低的趋势，PH为7.0时获得最高ι-卡拉胶酶活力。菌株在6.0-9.0环境中均能生长，在pH为7.0-9.0时，菌体密度趋于稳定，但大于9.5时生长较弱，综合考虑选择其最适生长pH为pH 7.0。
[0032](6)碳源对菌株生长和产酶的影响
分别加入0.25%的蔗糖、麦芽糖、t -卡拉胶、K-卡拉胶、a-乳糖、葡萄糖、海藻酸钠作为培养基的唯一碳源，在最适培养条件下培养，分别测其菌体密度，冷冻离心收集酶液，并用DNS法测定酶活，确定培养基的最佳碳源。
[0033]微生物的碳源谱很广，但对于异养微生物来说，糖类是最广泛利用的碳源，其次是醇类，有机酸类和脂类等。如图7可知，菌株在不同碳源存在的情况下，菌株均能生长，其中K-卡拉胶和卜卡拉胶均能获得较高的卜卡拉胶酶活力。通过图8发现，t-卡拉胶在一定浓度范围内可促进产酶，随着ι-卡拉胶浓度的增加，菌体生长越来越好，菌株产ι-卡拉胶酶的能力越来越强，由此确定ι-卡拉胶最佳浓度为0.9%。
[0034](7)氮源对菌株生长和产酶的影响
分别加入0.5%的细菌学蛋白胨、酵母粉、胰蛋白胨，硝酸钠、硝酸钱、磷酸氢二铵、氯化铵作为培养基的唯一氮源，在最适培养条件下培养，分别测其菌体密度，利用冷冻离心收集酶液，并用DNS法测定酶活，确定培养基的最佳氮源。
[0035]氮源是可以被微生物利用，构成细胞的蛋白质、核酸及其他氮素化合物的物质的总称由图9可知，添加不同的氮源对菌株产酶的影响不同，添加浓度为0.5%的有机氮源(酵母粉、细菌学蛋白胨、胰蛋白胨)时，菌体生长较好，菌株能够利用有机氮源产ι-卡拉胶酶，而在0.5%的无机氮源(0.5%的硝酸钠、硝酸铵、磷酸氢二铵)存在条件下，ι-卡拉胶酶酶活很低，所以选择酵母粉为最佳氮源。图10显示，一定浓度的酵母粉对菌体的生长合成具有明显的抑制作用，当添加量为1.5%时获得最大菌体密度，随后菌体密度急剧下降，最终确定酵母粉的最佳添加量为1.5%。
[0036](8)NaCl浓度对菌株生长和产酶的影响
分别向培养基中添加 10 g/L、15 g/L,20 g/L,25 g/L,30 g/L,35 g/L的NaCl，以改变培养基的盐度，在最适培养条件下培养，分别测其菌体密度，利用冷冻离心收集酶液，并用DNS法测定酶活，
菌株Pseudoal teromonas car rage en o vora ASY5来源于海洋，故菌株生长及产酶会受NaCl浓度的影响，如图11所示，随着NaCl浓度的增加，卡拉胶酶活力都呈现先增加后减少的趋势，菌体密度一直呈现下降趋势，虽然环境中的高盐浓度是菌生长必须的，但过高的盐浓度对酶的活力却有一定的抑制作用，也不利于菌株生长，NaCl浓度为15 g/L时，ι-卡拉胶酶活力达到最高值，所以选择最适NaCl浓度为15 g/L。
[0037]
实施例2:
ι-卡拉胶酶发酵优化工艺与初始发酵工艺对照，按照实施例1的优化参数，进行如下实验:
1、优化后培养基的配制
人工海水:包括氯化钠、氯化钾、二水合氯化钙、六水合氯化镁、碳酸氢钠、七水合硫酸镁，其质量分数(g/100 1^)依次为2.8、0.08、0.16、0.48、0.01、0.35。
[0038]种子培养基:牛肉膏10 g，胰蛋白胨10 g，加入蒸馏水250 mL，调节pH 7.8，水浴10min，调节pH 7.3，再加入人工海水750 mL，充分混匀后，121°C灭菌15 min，冷却后在4°C下保存备用。
[0039]发酵培养基:氯化钠15g，酵母粉15 g，二水合氯化钙0.2 g，十二水合磷酸氢二钠3.82 g，二水合磷酸二氢钠1.3 g，ι-卡拉胶9 g，依次溶于1000 mL的蒸馈水中，充分混勾后，121°C灭菌15 min，在4 oC下保存备用。
[0040]2、优化后ι-卡拉胶酶活力的测定
(I)菌种的活化:将产卡拉胶酶的菌种Pseudoalteromonas carrageenovora ASY5接种于种子培养基中，23°C活化培养24 ho
[0041](2)发酵培养:菌种活化培养后转接于发酵培养基中，发酵培养的条件为:1-卡拉胶0.9%，酵母粉1.5%，NaCl 15 g/L，培养温度20°C，接种量4%，装液量50 mL，培养时间40 h，培养基的初始pH为pH 7.0。
[0042](3)将上述发酵液在4°C、10000 r/min条件下离心20 min，收集上清，即得ι-卡拉胶酶粗酶液。
[0043](4)以1-卡拉胶作为诱导剂发酵生产1-卡拉胶酶，建立了 1-卡拉胶酶的发酵生产工艺，通过优化菌株的产酶培养条件和培养基，如图12所示，优化后酶活达到1.24 U/mL，是优化前的2.21倍，这对于卡拉胶降解酶和卡拉胶寡糖的工业化生产具有良好的应用价值。
[0044]以上实施例是对本发明的具体描述，仅用于说明本发明的技术方案，并非本发明技术方案的穷举，故不用于限制本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种1-卡拉胶酶的制备方法，其特征在于:将产1-卡拉胶酶的菌种Pseudoalteromonas carrageenovora ASY5接种于种子培养基中，23°C活化培养24 h，活化培养后转接于发酵培养基中20°C发酵培养40 h，然后发酵液在4°C、10000 r/min条件下离心20 min，收集上清，即得t -卡拉胶酶粗酶液。2.如权利要求1所述的一种卜卡拉胶酶的制备方法，其特征在于:所述种子培养基为:牛肉膏10 g，胰蛋白胨10 g，加入蒸馈水250 mL，调节pH 7.8，水浴10 min，调节pH 7.3，再加入人工海水750 mL，充分混匀后，121°C灭菌15 min，冷却后在4°C下保存备用;所述人工海水中包括氯化钠、氯化钾、二水合氯化钙、六水合氯化镁、碳酸氢钠、七水合硫酸镁的质量分数(g/100 11^)依次为2.8、0.08、0.16、0.48、0.01、0.35。3.如权利要求1所述的一种卜卡拉胶酶的制备方法，其特征在于:所述发酵培养基中的氯化钠、酵母粉、二水合氯化钙、十二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠、1-卡拉胶的质量分数(g/100 1^)依次为1.5、1.5、0.02、0.38、0.13、0.9，充分混匀后，121°(:灭菌15 min，在4° C下保存备用。
【文档编号】C12N9/38GK105950590SQ201610592652
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年7月26日
【发明人】肖安风, 李佳佳, 肖琼, 倪辉, 蔡慧农, 吴昌正, 朱艳冰
【申请人】集美大学