一种温控型相变材料微胶囊载体固定化酶及其制备方法
【专利摘要】一种温控型相变材料微胶囊载体固定化酶及其制备方法，涉及生物技术领域。按照以下方法制备：首先制备由结晶态二氧化钛/磁性粒子复合材料包覆有机相变材料的微胶囊载体，然后对该微胶囊载体进行羧基化改性，再采用化学偶联法实现对酶的固定化，最终得到温控型相变材料微胶囊载体固定化酶。由于该固定化酶的微胶囊载体可通过其相变材料胶囊芯储存和释放热能，从而调节载体周边的微环境温度，由此可拓宽酶促反应的温度适用范围，增强固定化酶的热稳定性、储存稳定性和循环稳定性。此外，温控型相变材料微胶囊载体可用于不同种类酶的固定，其适用性非常广泛。
【专利说明】
一种温控型相变材料微胶囊载体固定化酶及其制备方法
技术领域
[0001]本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种具有自动调节微环境温度的相变材料微胶囊载体固定化酶及其制备方法。【背景技术】
[0002]酶是具有催化功能的大分子，是生物体内一切代谢反应的催化剂，具有催化反应条件温和、催化效率高、底物专一性强副产物少、催化活性调节方便等优点，是一种理想的催化剂。然而游离酶存在以下缺点，本身结构易受外界环境影响，出现失活现象;使用后分离回收困难，难以实现连续利用。随着固定化酶技术的出现，克服了游离酶的上述缺点，极大地促进了酶工程的应用和发展。传统的固定化酶方法包括:包埋法、吸附法、共价键和交联法。载体的选择对于固定酶过程是否成功起着关键性的作用，一般对载体的要求有以下几点:(1)载体机械性能好、比表面积大。(2)载体廉价易得。(3)载体对微生物的抵抗性好。 传统的载体材料包括:无机载体材料、有机载体材料、复合材料。如中国发明专利CN 105505914 A公开了一种磁性海藻酸钠制备方法并用来固定漆酶。如中国发明专利CN 10587542 A公开了一种环境压力敏感性固定化酶固定化酶多孔微球载体材料的制备方法， 可以通过吸附固定酶。然而，载体材料只对酶起到承载和固定作用，通过载体作用可提高酶的储存稳定性、热稳定性和循环稳定性。但目前所公开的酶载体仍无法克服酶促反应适用温度范围窄的缺点。因此，为了拓展固定化酶在工业化生产领域的应用，急需开发一种具有自动调节微环境温度的新型载体材料对酶进行固定，从而能解决上述缺陷。
[0003]近年来，可持续发展以及可再生能源的利用问题成为人们关注的焦点。相变材料作为一种潜热储存材料，可通过相态变化来储存和释放能量，具有温度调节功能，然而由于其在相变过程中存在体积变化的问题，大大限制了其应用范围。相变材料微胶囊是利用微胶囊化技术，在相变材料表面包覆一层具有一定力学强度且性能稳定的有机或无机壁材， 从而构建成具有“核一壳”结构的复合相变材料。相变材料微胶囊既具有相变材料的温度调节功能，又可以有效地将相变材料与外部隔绝，杜绝了相变材料相变时渗漏、流失等问题。 用于相变材料微胶囊的壁材包括有机材料和无机材料，有机壁材具有易燃、强度差、热响应慢等缺点，然而无机壁材可以有效地克服上述问题，并已成为相变材料微胶囊领域的研究热点。如中国发明专利CN 105238361 A公开了一种以银/二氧化硅双层复合材料为壁材的多功能相变材料微胶囊的制备方法。如中国发明专利CN 105542724 A公开了一种通过悬浮聚合合成壁材为掺杂纳米金属离子的高分子材料的相变材料微胶囊颗粒的制备方法。该相变材料微胶囊可以通过储存和释放能量可以将微胶囊周边的环境温度控制在一定的范围之内，从而对微环境起到一定的控温效果。因此，如果将相变材料微胶囊作为载体来固定酶，则能有效解决酶适用温度范围窄的缺点。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是:解决传统载体固定化酶适用工作温度范围窄及储存稳定性、热稳定性和循环稳定性差的问题，提供一种以温控型相变材料微胶囊为载体材料的固定化酶及其制备方法，利用本载体材料所具有的可调节微环境温度功能的特征，可使所固定酶的稳定性和活性得到显著提高，在固定化酶开发及应用领域具有较大的应用潜力。
[0005]本发明一种温控型相变材料微胶囊载体固定化酶，其特征在于，该相变材料微胶囊载体具有“核一壳”结构，载体芯材为相变材料，优选高级脂肪醇、高级脂肪酸、高级脂肪醇酯或石蜡有机相变材料，通过其“固一液”相态变化来储存和释放能量，使载体具备了调节微环境温度的功能，从而拓宽了固定酶的适用温度范围。该载体壳层为结晶态二氧化钛/ 磁性纳米粒子复合材料，这使得该载体具有磁响应性、可再生利用、生物相容性及与酶共价连接、对酶荷载能力强等优点。该载体芯材的质量百分比为55?75wt.%，载体壁材的质量百分比为25?45wt.%，载体的平均粒径为3?6_，载体的胶囊壁厚为0.2?0.6mi;酶通过共价键连接在载体壁材上。
[0006]酶为脂肪酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶和溶菌酶、肠肽酶、胆碱酯酶、葡萄糖氧化酶、黄嘌呤氧化酶、多酚氧化酶、过氧化氢酶、乳酸氧化酶、尿酸酶、乙酰胆碱酯酶、络氨酸酶、乙醇脱氢酶、谷氨酸氧化酶、半乳糖氧化酶、丙酮酸氧化酶、乳酸脱氢酶、抗坏血酸氧化酶、胆固醇氧化酶、漆酶、异柠檬酸脱氧酶、亚硫酸盐氧化酶、乙醇氧化酶、超氧化物歧化酶、脲酶、赖氨酸氧化酶、脲酸酶、酰基辅酶A氧化酶、肌酸酶、肌酸氨基水解酶、半乳糖苷酶、磷酸葡萄糖变位酶、甘油激酶、己糖激酶、￠-羟丁酸脱氢酶、3a_羟基类固醇脱氢酶、脂蛋白脂酶、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、硫代辅酶1、嘧啶核苷磷酸化酶、丙酮酸激酶、嘌呤核苷磷酸化酶、辣根过氧化物酶和苹果酸脱氢酶中的任意一种。
[0007]—种温控型相变材料微胶囊载体固定化酶及其制备方法，其特征在于，制备工艺包括如下步骤:
[0008]步骤(1):温控型相变材料微胶囊载体的制备
[0009]①以三价铁盐、二价铁盐、氨水和表面活性剂为原料，在氮气氛保护下反应制备疏水的磁性纳米粒子；
[0010]②将质量百分比为0.3?1.0wt.%的疏水磁性纳米粒子、4.0?10.0wt.%的相变材料、4.0?10.0wt.%的钛源，加入到反应容器中加热超声，使磁性纳米粒子和钛源分散在有机相变材料表面；
[0011]③分别将质量百分比为50.0?60.0wt.%的有机溶剂和0.5?2.4wt.%的表面活性剂加入上述反应容器，搅拌2?3h，形成稳定的乳液体系；
[0012]④配制1 ? 〇?2 ? 5wt ? %去离子水与28 ? 6?40wt ? %有机溶剂的混合液，将其缓慢滴加到上述乳液体系中，继续搅拌反应6?10h;[〇〇13]⑤加入质量百分比为0.2?2.0wt.%的结晶诱导剂，升温到80°C继续在搅拌下反应24h后，用去离子水洗涤、过滤，真空干燥箱中干燥(如30°C下干燥12h)，得到温控型相变材料微胶囊载体。
[0014]步骤(2):酶的固定化
[0015]①将质量百分比为0.6?0.9wt.%的上述相变材料微胶囊载体和质量百分比为 19.0?24.8wt.%且pH=2的盐酸溶液混合均匀超声10?15min后，再加入质量百分比为 74.4?80.4wt.%且浓度为4?5mmol/L的3，4-二羟基苯基丙酸溶液，继续反应3?4h，用去离子水洗涤干净，得到羧基化的相变材料微胶囊。
[0016]②分别将质量百分比为0.6?3.2wt.%的羧基化相变材料微胶囊载体、质量百分比为88.6?95.7wt.%且浓度为lmmol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液、质量百分比为2.8 ?6.2wt.%的碳二亚胺和质量百分比为0.5?2.0wt.%的N-羟基琥珀酰亚胺混合均匀，并反应15?30min，得到羧基被活化的相变材料微胶囊载体，然后，再用浓度为lmmol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液洗涤，以除去多余的反应物。
[0017]③取质量百分比为0.6?1.5wt.%上述②所得到的产物中分别加入质量百分比为 1.3?3.0wt.%的酶和质量百分比为95.5?98.lwt.%且浓度为2?30mmol/L的缓冲溶液， 均匀混合后继续反应2?4h，然后洗涤除去未反应的酶，冷冻干燥后得到温控型相变材料微胶囊载体固定化酶。
[0018]所述步骤(1)中表面活性剂优选为十二烷基苯磺酸钠、十二烷基硫酸钠、二辛基琥珀酸磺酸钠、甘胆酸钠、十二烷基磺酸钠、0P-10、Span80、Span20、Teen20、Teen60、月桂醇、 TX-10中的任意一种或几种。[〇〇19]所述步骤(1)中的有机溶剂优选为甲醇、甲酰胺、乙腈和乙醇溶剂中的任意一种或几种。
[0020]所述步骤(1)中的钛源优选为钛酸正丁酯、钛酸四异丙酯、硫酸氧钛、氟化钛、硫酸钛中的任意一种。
[0021]所述步骤(1)中的结晶诱导剂优选为NH4C1、Na2S〇4、NH4F、NaF或H2S〇4。
[0022]所述步骤(1)中的温控型固定化酶相变材料微胶囊载体的制备方法包括溶胶凝胶法、界面聚合法、原位聚合法等常用方法。[〇〇23] 所述步骤(2)中的缓冲液优选为pH= 1.0?2.2的氯化钾一盐酸缓冲液、pH= 2.2? 3.8领苯二甲酸一盐酸缓冲液、pH=3.0?6.6的柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液、pH=5.8?8.0的磷酸氢二钠一磷酸二氢钠缓冲液、pH=7.1?9.0的三羟甲基氨基甲烷一盐酸缓冲液、pH = 6.8?9.6的巴比妥钠一盐酸缓冲液和pH=8.6?10.6的甘氨酸一氢氧化钠缓冲液中的任意一种。[〇〇24]本发明具有以下优点:
[0025]1、本发明制备的的温控型相变材料微胶囊载体固定化酶，其胶囊芯为高级脂肪醇、高级脂肪酸、高级脂肪醇酯和石蜡有机相变储能材料，通过固一液相态转变储存和释放能量，具有可调节微环境温度功能，拓宽了酶的适用温度范围，提高了酶的热稳定性、储存稳定性和循环稳定性。
[0026]2、本发明制备的的温控型相变材料微胶囊载体固定化酶，胶囊壳体为结晶二氧化钛的相变材料为载体，具有抗菌功效、生物相容性及与酶共价连接、对酶荷载能力强等优点，提尚了酶的稳定性。
[0027]3、本发明制备的温控型相变材料微胶囊载体固定化酶，胶囊壳体含有磁性纳米粒子，具有磁性特征，易于分离，使其活性回收率提高。
[0028]4、本发明制备的温控型相变材料微胶囊载体固定化酶，具有工艺简单对设备要求低的优点，可广泛运用于生产。【附图说明】[〇〇29]图1:温控型相变材料微胶囊载体固定化酶的扫描电子显微镜照片
[0030]图2:温控型相变材料微胶囊载体固定化酶的扫描电子显微镜局部放大照片
[0031]图3:温控型相变材料微胶囊载体固定化酶的透射电子显微镜照片 [〇〇32]图4:温控型相变材料微胶囊载体的差示扫描量热谱图[0033 ]图5:反应pH值对游离酶和固定化相对酶活性的影响规律
[0034]图6:反应温度对游离酶和固定化相对酶活性的影响规律 [〇〇35]图7:游离酶和固定化酶40°C下的储存稳定性测试结果
[0036]图8:温控型相变材料微胶囊载体固定化酶的循环稳定性测试结果【具体实施方式】
[0037]以下结合实施例和附图进一步说明本发明。下述实施例是基于本发明技术方案前提下进行实施的，提供了详细的合成方法和实施过程;但本发明的保护范围不限于下述实施例。
[0038]实施例1
[0039]步骤(1):温控型相变材料微胶囊载体的制备
[0040]首先，1.0g三氯化铁六水化物和0.4g氯化亚铁四水化物溶于100mL去离子水中，升温到60°C保温5h，然后用氨水调节到pH= 10，加入0.lg十二烧基硫酸钠，继续搅拌20min在 N2气氛保护下反应制备疏水的磁性纳米粒子;将0.4g磁性纳米粒子、5.0g正二十烷和5.0g 钛酸正丁酯加入到三口瓶中，在40°C下超声30min，使磁性纳米粒子和钛源分散在有机相变材料表面，然后加入60mL甲酰胺溶液和0.5g十二烧基硫酸钠继续搅拌2h，形成稳定的乳液体系;配制lmL去离子水与40mL甲酰胺的混合液，并缓慢滴加到上述乳液体系中，继续搅拌反应8h;加入0.9g氟化钠结晶诱导剂，升温到80°C继续在搅拌下反应24h后，用去离子水洗涤、过滤，真空干燥箱中30°C下干燥12h，得到温控型相变材料微胶囊载体。
[0041]步骤(2):酶的固定化[〇〇42] 将0.5g相变材料微胶囊加入15mL的pH=2.5的盐酸溶液中超声15min后，然后加入 50mL浓度为5mg/mL的3,4-二羟基苯基丙酸溶液中反应311，用去离子水洗涤干净，得到羧基化的相变材料微胶囊;将〇.5g羧基化相变材料微胶囊、2.0g碳二亚胺、0.5g N-羟基琥珀酰亚胺和50mL浓度为的lmmol/L的2- (N-吗啡啉)乙磺酸缓冲溶液混合并反应30min，得到羧基被活化相变材料微胶囊，用浓度为lmmol/L，pH为6.0的2- (N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液洗涤除去多余的反应物;将4脂肪酶和5〇1^浓度为1〇111111〇1/1且?11为7.4磷酸缓冲溶液混合均匀并加入〇.5g上述产物中继续反应4h，洗涤除去未反应的酶，冷冻干燥后得到温控型相变材料微胶囊载体固定化酶。[〇〇43] 实施案例2
[0044]步骤(1):温控型相变材料微胶囊载体的制备[〇〇45]首先，1.0g三氯化铁六水化物和0.4g氯化亚铁四水化物溶于100mL去离子水中，升温到60°C保温5h，然后用氨水调节到pH= 10，加入0.lg十二烧基硫酸钠，继续搅拌20min在 N2气氛保护下反应制备疏水的磁性纳米粒子;将0.4g磁性纳米粒子、5.0g正二十烷和5.0g 钛酸正丁酯加入到三口瓶中，在40°C下超声30min，使磁性纳米粒子和钛源分散在有机相变材料表面，然后加入60mL甲酰胺溶液和0.5g十二烧基硫酸钠继续搅拌2h，形成稳定的乳液体系;配制lmL去离子水与40mL甲酰胺的混合液，并缓慢滴加到上述乳液体系中，继续搅拌反应8h;加入0.9g(NH4)2S〇4结晶诱导剂，升温到80°C继续在搅拌下反应24h后，用去离子水洗涤、过滤，真空干燥箱中30°C下干燥12h，得到温控型相变材料微胶囊载体。
[0046]步骤(2):酶的固定化[〇〇47] 将0.5g相变材料微胶囊加入15mL的pH=2.5的盐酸溶液中超声15min后，然后加入 50mL浓度为5mg/mL的3,4-二羟基苯基丙酸溶液中反应311，用去离子水洗涤干净，得到羧基化的相变材料微胶囊;将〇.5g羧基化相变材料微胶囊、2.0g碳二亚胺、0.5g N-羟基琥珀酰亚胺和50mL浓度为的lmmol/L的2- (N-吗啡啉)乙磺酸缓冲溶液混合并反应30min，得到羧基被活化相变材料微胶囊，用浓度为lmmol/L，pH为6.0的2- (N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液洗涤除去多余的反应物;将4脂肪酶和5〇1^浓度为1〇111111〇1/1且?11为7.4磷酸缓冲溶液混合均匀并加入〇.5g上述产物中继续反应4h，洗涤除去未反应的酶，冷冻干燥后得到温控型相变材料微胶囊载体固定化酶。[〇〇48] 实施案例3
[0049]步骤(1):温控型相变材料微胶囊载体的制备
[0050]首先，1.0g三氯化铁六水化物和0.4g氯化亚铁四水化物溶于100mL去离子水中，升温到60°C保温5h，然后用氨水调节到pH= 10，加入0.lg十二烧基硫酸钠，继续搅拌20min在 N2气氛保护下反应制备疏水的磁性纳米粒子;将0.4g磁性纳米粒子、5.0g正二十烷和5.0g 钛酸正丁酯加入到三口瓶中，在40°C下超声30min，使磁性纳米粒子和钛源分散在有机相变材料表面，然后加入60mL甲酰胺溶液和0.5g十二烧基硫酸钠继续搅拌2h，形成稳定的乳液体系;配制lmL去离子水与40mL甲酰胺的混合液，并缓慢滴加到上述乳液体系中，继续搅拌反应8h;加入0.9g氟化钠结晶诱导剂，升温到80°C继续在搅拌下反应24h后，用去离子水洗涤、过滤，真空干燥箱中30°C下干燥12h，得到温控型相变材料微胶囊载体。
[0051]步骤(2):酶的固定化[〇〇52] 将0.5g相变材料微胶囊加入15mL的pH=2.5的盐酸溶液中超声15min后，然后加入 50mL浓度为5mg/mL的3,4-二羟基苯基丙酸溶液中反应311，用去离子水洗涤干净，得到羧基化的相变材料微胶囊;将〇.5g羧基化相变材料微胶囊、2.0g碳二亚胺、0.5g N-羟基琥珀酰亚胺和50mL浓度为的lmmol/L的2- (N-吗啡啉)乙磺酸缓冲溶液混合并反应30min，得到羧基被活化相变材料微胶囊，用浓度为lmmol/L，pH为6.0的2- (N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液洗涤除去多余的反应物;将lg过氧化氢酶和50mL浓度为10mmol/L且pH为7.4磷酸缓冲溶液混合均匀并加入0.5g上述产物中继续反应4h，洗涤除去未反应的酶，冷冻干燥后得到温控型相变材料微胶囊载体固定化酶。[〇〇53] 实施案例4[〇〇54]步骤(1):温控型相变材料微胶囊载体的制备[〇〇55]首先，1.0g三氯化铁六水化物和0.4g氯化亚铁四水化物溶于100mL去离子水中，升温到60°C保温5h，然后用氨水调节到pH=10,加入0.lg十二烷基苯磺酸钠，继续搅拌20min 在％气氛保护下反应制备疏水的磁性纳米粒子；将0.4g磁性纳米粒子、5.0g正二十烷和 5.0g钛酸正丁酯加入到三口瓶中，在40°C下超声30min，使磁性纳米粒子和钛源分散在有机相变材料表面，然后加入60mL甲酰胺溶液和0.6g十二烧基苯磺酸钠继续搅拌2h，形成稳定的乳液体系;配制lmL去离子水与40mL甲酰胺的混合液，并缓慢滴加到上述乳液体系中，继续搅拌反应8h;加入0.9g氟化钠结晶诱导剂，升温到80°C继续在搅拌下反应24h后，用去离子水洗涤、过滤，真空干燥箱中30°C下干燥12h，得到温控型相变材料微胶囊载体。
[0056]步骤(2):酶的固定化[〇〇57] 将0.5g相变材料微胶囊加入15mL的pH=2.5的盐酸溶液中超声15min后，然后加入 50mL浓度为5mg/mL的3,4-二羟基苯基丙酸溶液中反应311，用去离子水洗涤干净，得到羧基化的相变材料微胶囊;将〇.5g羧基化相变材料微胶囊、2.0g碳二亚胺、0.5g N-羟基琥珀酰亚胺和50mL浓度为的lmmol/L的2- (N-吗啡啉)乙磺酸缓冲溶液混合并反应30min，得到羧基被活化相变材料微胶囊，用浓度为lmmol/L，pH为6.0的2- (N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液洗涤除去多余的反应物;将4脂肪酶和5〇1^浓度为1〇111111〇1/1且?11为7.4磷酸缓冲溶液混合均匀并加入〇.5g上述产物中继续反应4h，洗涤除去未反应的酶，冷冻干燥后得到温控型相变材料微胶囊载体固定化酶。[〇〇58] 实施案例5
[0059]步骤(1):温控型相变材料微胶囊载体的制备
[0060]首先，1.0g三氯化铁六水化物和0.4g氯化亚铁四水化物溶于100mL去离子水中，升温到60°C保温5h，然后用氨水调节到pH= 10，加入0.lg十二烧基硫酸钠，继续搅拌20min在 N2气氛保护下反应制备疏水的磁性纳米粒子;将0.4g磁性纳米粒子、4.0g正二十烷和6.0g 钛酸正丁酯加入到三口瓶中，在40°C下超声30min，使磁性纳米粒子和钛源分散在有机相变材料表面，然后加入60mL甲酰胺溶液和0.5g十二烧基硫酸钠继续搅拌2h，形成稳定的乳液体系;配制lmL去离子水与40mL甲酰胺的混合液，并缓慢滴加到上述乳液体系中，继续搅拌反应8h;加入0.9g氟化钠结晶诱导剂，升温到80°C继续在搅拌下反应24h后，用去离子水洗涤、过滤，真空干燥箱中30°C下干燥12h，得到温控型固定化酶相变材料载体。
[0061]步骤(2):酶的固定化[〇〇62] 将0.5g相变材料微胶囊加入15mL的pH=2.5的盐酸溶液中超声15min后，然后加入 50mL浓度为5mg/mL的3,4-二羟基苯基丙酸溶液中反应311，用去离子水洗涤干净，得到羧基化的相变材料微胶囊;将〇.5g羧基化相变材料微胶囊、2.0g碳二亚胺、0.5g N-羟基琥珀酰亚胺和50mL浓度为的lmmol/L的2- (N-吗啡啉)乙磺酸缓冲溶液混合并反应30min，得到羧基被活化相变材料微胶囊，用浓度为lmmol/L，pH为6.0的2- (N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液洗涤除去多余的反应物;将4脂肪酶和5〇1^浓度为1〇111111〇1/1且?11为7.4磷酸缓冲溶液混合均匀并加入〇.5g上述产物中继续反应4h，洗涤除去未反应的酶，冷冻干燥后得到温控型相变材料微胶囊载体固定化酶。[〇〇63] 实施案例6
[0064]步骤(1):温控型相变材料微胶囊载体的制备[〇〇65]首先，1.4g硫酸铁和0.4g氯化亚铁四水化物溶于100mL去离子水中，升温到60°C保温5h，然后用氨水调节到pH= 10，加入0.5g十二烷基硫酸钠，继续搅拌20min在犯气氛保护下反应制备疏水的磁性纳米粒子;将0.4g磁性纳米粒子、5.0g正二十烷和5.0g钛酸正丁酯加入到三口瓶中，在40°C下超声30min，使磁性纳米粒子和钛源分散在有机相变材料表面， 然后加入60mL甲酰胺溶液和0.6g十二烷基硫酸钠继续搅拌2h，形成稳定的乳液体系；配制 lmL去离子水与40mL甲酰胺的混合液，并缓慢滴加到上述乳液体系中，继续搅拌反应8h;加入〇.9g氟化钠结晶诱导剂，升温到80°C继续在搅拌下反应24h后，用去离子水洗涤、过滤，真空干燥箱中30°C下干燥12h，得到温控型相变材料微胶囊载体。[0〇66]步骤(2):酶的固定化[〇〇67] 将0.5g相变材料微胶囊加入15mL的pH=2.5的盐酸溶液中超声15min后，然后加入 50mL浓度为5mg/mL的3,4-二羟基苯基丙酸溶液中反应311，用去离子水洗涤干净，得到羧基化的相变材料微胶囊;将〇.5g羧基化相变材料微胶囊、2.0g碳二亚胺、0.5g N-羟基琥珀酰亚胺和50mL浓度为的lmmol/L的2- (N-吗啡啉)乙磺酸缓冲溶液混合并反应30min，得到羧基被活化相变材料微胶囊，用浓度为lmmol/L，pH为6.0的2- (N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液洗涤除去多余的反应物;将4脂肪酶和5〇1^浓度为1〇111111〇1/1且?11为7.4磷酸缓冲溶液混合均匀并加入〇.5g上述产物中继续反应4h，洗涤除去未反应的酶，冷冻干燥后得到温控型相变材料微胶囊载体固定化酶。
[0068]针对本发明实施例1所制备的温控型相变材料微胶囊载体固定化脂肪酶进行了详细的结构分析和性能考察。从图1所示的温控型相变材料微胶囊载体固定化脂肪酶的扫描电子显微镜照片可以发现，该所制备的温控型相变材料微胶囊载体固定化脂肪酶的粒径在 3?6wii之间，且分布均匀。从图2所示的单一固定化酶的扫描电子显微镜照片可以清晰地观察到载体表面的脂肪酶的存在。从图3所示的温控型相变材料微胶囊载体材料固定化酶透射电子显微镜照片可以考察到，该所制备的温控型相变材料微胶囊载体材料具有完美的 “核一壳”结构，壳厚度为〇.3wn，壳体表面絮状物为固定化的脂肪酶，表明脂肪酶成功的固定在载体材料上。如图4所示，对温控型相变材料微胶囊载体的差示扫描量热谱图进行积分可得到该温控型相变材料微胶囊载体的熔融焓和结晶焓分别为139.lj/g和136.7J/g，包覆率为63.8%，表明温控型相变材料微胶囊载体具有很好的潜热储存一释放性能。图5显示了反应pH值对游离酶、普通二氧化钛固定化脂肪酶和本实施方式制备的温控型相变材料微胶囊载体材料固定化脂肪相对酶活性影响，从图中曲线可观察到，在极端pH值下游离酶迅速失活；用普通二氧化钛固定化脂肪酶在pH= 3.0相对酶活性仅保持在17.5 %左右、在pH = 9.0时相对酶活性仅保持在58.1 %左右;而用温控型相变材料微胶囊载体材料固定化脂肪酶在pH=3.0时相对酶活性仍保持在30.3 %左右、在pH=9.0时相对酶活性仍保持在60.6 % 左右，且pH值在5?8之间相对酶活性基本不降低，表明温控型相变材料微胶囊固定化酶可以很好地拓宽了 pH值适用范围。图6显示了反应温度对游离酶、普通二氧化钛固定化脂肪酶和本实施方式制备的温控型相变材料微胶囊载体材料固定化脂肪相对酶活性影响，图中曲线表明温度在30?50°C之间时，游离相对酶活性迅速降低到50.0%左右，普通二氧化钛固定化脂肪酶在此范围内相对酶活性仅保持在70.1 %左右，而温控型相变材料微胶囊载体材料固定化脂肪酶相对酶活性仍保持在90.0%左右，表明温控型相变材料微胶囊载体可以很好地拓宽酶适用温度范围。图7显示了游离酶、普通二氧化钛固定化脂肪酶和本实施方式制备的温控型相变材料微胶囊载体材料固定化脂肪酶在40°C下酶的储存稳定性，对图中曲线分析可知游离酶在储存2h后相对酶活性迅速降低到60.5 %左右，普通二氧化钛固定化脂肪酶在储存l〇h后相对酶活性仅保持在39.5 %左右，而温控型相变材料微胶囊固定化酶在储存l〇h后相对酶活性仍保持在82.9%左右，表明温控型相变材料微胶囊载体固定化酶可以有效的提高酶的储存稳定性。图8显示了温控型相变材料微胶囊载体固定化酶的循环稳定性测试结果，可以发现，温控型相变材料微胶囊载体固定化酶在循环使用10次以后，仍保持 92.6 %左右的初始酶活力，表明温控型相变材料微胶囊载体固定化酶可有效提高酶的循环稳定性。
[0069]同样，针对实施例2 — 6的结构表征和性能测试发现，上述方法所制备的温控型相变材料微胶囊载体固定化酶粒径均在3?6wii之间，且酶可以很好地固定在载体表面。温控型相变材料微胶囊载体具有完美的“核-壳”结构，且其熔融焓值在130.1?148.0J/g之间， 结晶焓值在120.5?140.5J/g之间，显示该相变材料微胶囊载体具有很好的潜热储存一释放性能。pH值在5?8之间时，温控型相变材料微胶囊载体固定化酶的相对酶活性均能保持在95.5%左右，表明温控型相变材料微胶囊载体固定化酶可以明显的拓展酶的pH适用范围。温度在30?50°C之间，温控型相变材料微胶囊载体固定化酶的相对酶活性均能保持在 87.6%左右，证明了温控型相变材料可以拓宽酶促反应温度的适用范围。温控型相变材料微胶囊载体固定化酶在40°C条件下储存10h后，相对酶活性均保持在80.1%左右，表明温控型相变材料微胶囊载体固定化酶可以明显的提高的酶的储存稳定性。当温控型相变材料微胶囊载体固定化酶再循环使用10次后，均保持在85.9%左右初始酶活性，表明温控型相变材料微胶囊载体固定化酶可有效提高酶的循环稳定性。
[0070]上述发明实施例仅为结果较佳的实施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。 即凡依本发明申请专利范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明的技术范畴。
【主权项】
1.一种温控型相变材料微胶囊载体固定化酶，其特征在于，相变材料微胶囊载体具有 “核一壳”结构，载体芯材为相变材料，载体壳层为结晶态二氧化钛/磁性纳米粒子复合材 料，酶通过共价键连接在载体壁材上。2.按照权利要求1所述的一种温控型相变材料微胶囊载体固定化酶及其制备方法，其 特征在于，该载体芯材的质量百分比为55?75wt.%，载体壁材的质量百分比为25? 45wt.%，载体的平均粒径为3?6mi，载体的胶囊壁厚为0.2?0.6mi。3.按照权利要求1所述的一种温控型相变材料微胶囊载体固定化酶，其特征在于，相变 材料为尚级脂肪醇、尚级脂肪酸、尚级脂肪醇酯或石錯有机相变材料。4.按照权利要求1所述的一种温控型相变材料微胶囊载体固定化酶，其特征在于，酶为 脂肪酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶和溶菌酶、肠肽酶、胆碱酯酶、葡萄糖氧化酶、黄嘌呤 氧化酶、多酚氧化酶、过氧化氢酶、乳酸氧化酶、尿酸酶、乙酰胆碱酯酶、络氨酸酶、乙醇脱氢 酶、谷氨酸氧化酶、半乳糖氧化酶、丙酮酸氧化酶、乳酸脱氢酶、抗坏血酸氧化酶、胆固醇氧 化酶、漆酶、异柠檬酸脱氧酶、亚硫酸盐氧化酶、乙醇氧化酶、超氧化物歧化酶、脲酶、赖氨酸 氧化酶、脲酸酶、酰基辅酶A氧化酶、肌酸酶、肌酸氨基水解酶、半乳糖苷酶、磷酸葡萄糖变 位酶、甘油激酶、己糖激酶、￠-羟丁酸脱氢酶、3a_羟基类固醇脱氢酶、脂蛋白脂酶、半胱氨酸 蛋白酶抑制剂C、硫代辅酶1、嘧啶核苷磷酸化酶、丙酮酸激酶、嘌呤核苷磷酸化酶、辣根过氧 化物酶和苹果酸脱氢酶中的任意一种。5.按照权利要求1所述的一种温控型相变材料微胶囊载体固定化酶及其制备方法，其 特征在于，包括如下步骤:步骤(1):温控型相变材料微胶囊载体的制备①以三价铁盐、二价铁盐、氨水和表面活性剂为原料，在氮气氛保护下反应制备疏水的 磁性纳米粒子；②将质量百分比为〇.3?1.0wt.%的疏水磁性纳米粒子、4.0?10.0wt.%的相变材料、 4.0?10.0wt.%的钛源，加入到反应容器中加热超声，使磁性纳米粒子和钛源分散在有机 相变材料表面；③分别将质量百分比为50.0?60.0wt.%的有机溶剂和0.5?2.4wt.%的表面活性剂 加入上述反应容器，搅拌2?3h，形成稳定的乳液体系；④配制1.0?2.5wt.%去离子水与28.6?40wt.%有机溶剂的混合液，将其缓慢滴加到 上述乳液体系中，继续搅拌反应6?10h;⑤加入质量百分比为0.2?2.0wt.%的结晶诱导剂，升温到80°C继续在搅拌下反应24h 后，用去离子水洗涤、过滤，真空干燥箱中30°C下干燥12h，得到温控型相变材料微胶囊载 体；步骤(2):酶的固定化①将质量百分比为〇.6?0.9wt.%的上述相变材料微胶囊载体和质量百分比为19.0? 24.8?^%且?11 = 2的盐酸溶液混合均匀超声10?15111111后，再加入质量百分比为74.4? 80.4wt.%且浓度为4?5mmol/L的3，4-二羟基苯基丙酸溶液，继续反应3?4h，用去离子水 洗涤干净，得到羧基化的相变材料微胶囊。②分别将质量百分比为〇.6?3.2wt.%的羧基化相变材料微胶囊载体、质量百分比为 88.6?95.7的.％且浓度为1111111〇1/1的2-0-吗啡啉)乙磺酸缓冲液、质量百分比为2.8?6.2wt.%的碳二亚胺和质量百分比为0.5?2.0wt.%的N-轻基琥泊酰亚胺混合均勾，并反 应15?30min，得到羧基被活化的相变材料微胶囊载体，然后，再用浓度为lmmo 1/L的2 - (N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液洗涤，以除去多余的反应物；③取质量百分比为0.6?1.5wt.%上述②所得到的产物中分别加入质量百分比为1.3 ?3.0wt.%的酶和质量百分比为95.5?98.lwt.%且浓度为2?30mmol/L的缓冲溶液，均匀 混合后继续反应2?4h，然后洗涤除去未反应的酶，冷冻干燥后得到温控型相变材料微胶囊 载体固定化酶。6.按照权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中表面活性剂为十二烷基苯 磺酸钠、十二烷基硫酸钠、二辛基琥珀酸磺酸钠、甘胆酸钠、十二烷基磺酸钠、0P-10、 Span80、Span20、Teen20、Teen60、月桂醇、TX-10 中的任意一种或几种。7.按照权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的有机溶剂优选为甲醇、甲 酰胺、乙腈和乙醇溶剂中的任意一种或几种。8.按照权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的钛源优选为钛酸正丁酯、 钛酸四异丙酯、硫酸氧钛、氟化钛、硫酸钛中的任意一种。9.按照权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的结晶诱导剂优选为NH4C1、 Na2S〇4、NH4F、NaF 或 H2SO4 〇10.按照权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的缓冲液优选为pH=1.0 ?2.2的氯化钾一盐酸缓冲液、pH=2.2?3.8领苯二甲酸一盐酸缓冲液、pH= 3.0?6.6的柠 檬酸一柠檬酸钠缓冲液、pH = 5.8?8.0的磷酸氢二钠一磷酸二氢钠缓冲液、pH = 7.1?9.0 的三羟甲基氨基甲烷一盐酸缓冲液、pH = 6.8?9.6的巴比妥钠一盐酸缓冲液和pH= 8.6? 10.6的甘氨酸一氢氧化钠缓冲液中的任意一种。
【文档编号】C12N11/14GK105950606SQ201610552601
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年7月13日
【发明人】汪晓东, 蒋彬彬, 武德珍
【申请人】北京化工大学