间日疟原虫烯醇化酶的制备及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种间日追原虫締醇化酶(enolase)的制备及其应用。
【背景技术】
[0002] 追疾是由追原虫引起的一种流行广泛，危害严重的虫媒传染病，与艾滋病和结核 病一起被列为世界上最具威胁的Ξ大传染病，在全球100多个国家和地区流行，30多亿人受 追疾感染危险，每年约有2亿多病例，近60万人死亡。寻找和研发安全有效的追疾疫苗或治 疗新药物，将成为全球和我国消除追疾的急迫需求。
[0003] 締醇化酶(enolase)最初发现是细胞糖酵解中的关键酶之一，后来发现它能够表 达在追原虫表面并不依赖于其酶活性通过与宿主蛋白结合介导追原虫侵入。上世纪60年代 和70年代，我国曾两次发生大范围的追疾暴发流行，年发病人数最多时超过3000万，给当时 的人民群众，特别是工农业生产造成了严重影响。经过几十年的努力，我国追疾防治取得了 显著的成绩，追疾发病率已大幅度下降。但2000年W来，由于全球气候变暖等多种自然和社 会因素的影响，我国中、南部地区出现了追疾疫情回升和局部暴发流行，特别是间日追。既 然締醇化酶(enolase)能够介导追原虫侵入宿主，发挥重要作用，所W我们建立了一种简便 的能够大量制备间日追原虫締醇化酶(enolase)方法及W鼠追模型发现其能够抑制追原虫 生长并保护宿主。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是克服现有技术中存在的不足，提供一种间日追原虫締醇化酶的制 备及其应用，能够简便的大量制备间日追原虫締醇化酶，并实现抑制追原虫生长的应用。 [000引按照本发明提供的技术方案，所述一种间日追原虫締醇化酶的制备，特征是，包括 W下步骤：
[0006] (1)扩增间日追原虫締醇化酶(enolase)基因：提取间日追原虫基因组，采用引物 P2和引物P3扩增第一段enolase基因，然后再W第一段enolase基因为模版，W引物P1和引 物P3扩增出enolase基因；
[0007] (2)构建祀 T28a/enolase 表达载体：
[000引 a、纯化步骤（1)得到的enolase基因；
[0009] b、将祀Τ28α质粒酶切、提纯得到线性化的祀Τ28α质粒载体；
[0010] C、将线性化的祀Τ28α质粒载体和enolase基因连接，得到祀T28a/enolase表达载 体；
[0011] (3)重组enolase蛋白表达和纯化:将祀T28a/eno lase表达载体转化到化-21 (D册） pLys感受态细菌上，培养后的细菌进行诱导、纯化。
[0012] 进一步的，所述引物P1 为5'-cggccatatggcccacg1:aat1:actcg1:atttctgcccgtgaaat ttt邑邑一3 ' ；戶弓|f勿P2^5 ' 一邑tatttct邑CCC邑t邑aaatttt邑邑actccc邑a邑邑aaacccaacc邑一3 ' ；戶 引 ^P3^5 ' 一a邑ca邑C邑邑CC邑ctcaacttaatt邑邑t邑cctaaatttctc-3 '。
[0013] 进一步的，所述步骤（1)扩增过程为:94°C、4min; 94°C、30sec; 50°C、30sec; 72°C、 1.5min，共 30 个循环；72°C、7min; 4°C、12min。
[0014] 进一步的，所述纯化enolase基因具体为:使用PCR产物纯化试剂盒提纯步骤（1)得 到的enolase基因后，W限制性内切酶Nde I和Notl进行酶切提纯，经1%琼脂糖凝胶电泳 后，用Agaose Gel Extraction Kit提纯。
[0015] 所述间日追原虫締醇化酶体内抑制追原虫生长并保护宿主的应用。
[0016] 本发明所述间日追原虫締醇化酶的制备及其应用，能够简便的大量制备间日追原 虫締醇化酶，并实现抑制追原虫生长的应用。
【附图说明】
[0017] 图1A为间日追原虫締醇化酶(enolase)基因的扩增过程示意图。
[0018] 图1B为祀T28a/enolase表达载体图谱。
[0019] 图2为间日追原虫締醇化酶(enolase)鉴定示意图。
[0020] 图3为抗间日追原虫締醇化酶(enolase)抗体体外抑制恶性追原虫结果。
[0021] 图4A、图4B为间日追原虫締醇化酶(enolase)体内抑制追原虫生长结果，图4A为原 虫感染率示意图，图4B为小鼠存活率示意图。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合具体附图对本发明作进一步说明。
[0023] 实施例1:间日追原虫締醇化酶的制备，包括W下步骤：
[0024] (1)扩增间日追原虫締醇化酶(enolase)基因：
[002引如图1A所示，按照试剂盒说明书，使用德国QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit试剂盒 提取间日追原虫基因组，并W其为模板，用引物P 2 ( 5 ' - 邑tatttct邑CCC邑t邑aaatttt邑邑actccc邑a邑邑aaacccaacc邑一3 '）和引 物P3(5 '一 agcagcggccgctcaacttaattggtgcctaaatttctc-3'）扩增第一段enolase基因，然后再W第一 段enolase基因为模版，W 引物Pl(5'-cggcca1:atggcccacgtaat1:actcg1:atttctgcccgtgaaat tttgg-3 '）和引物P3巧' -agcagcggccgctcaacttaattggtgcctaaatttctc-3 '）扩增全长PCR扩 增出 enolase 基因；扩增过程为：94°C、4min; 94°C、30sec; 50°C、30sec; 72°C、1.5min，共 30 个 循环;72°(3、7111111;4°0、12111111。反应结束后?0?扩增产物送南京金斯瑞公司进行测序，测序鉴 定正确扩增出enolase基因。
[0026] (2)构建祀 T28a/enolase 表达载体：
[0027] a、使用TaKaRa公司的PCR产物纯化试剂盒提纯PCR扩增产物后，W肥W ENGLAND BioLabs公司的限制性内切酶Nde I和Notl酶切提纯PCR扩增产物，经1%琼脂糖凝胶电泳 后，用TaKaRa公司的Agaose Gel Extraction Kit提纯得到enolase基因 DNA;
[002引 b、将美国Malvern公司的ρΕΤ28α质粒采用Nde I和Notl酶切、提纯得到线性化的 祀Τ28α质粒载体；
[0029] c、WTaKaRa公司的连接试剂盒将线性化的祀Τ28α质粒载体和enolase基因 DNA，在 16°C连接过夜，得到连接产物。将连接产物利用热激法(42°C、90sec)转化到DH5a感受态细 菌上，连接产物与D册α感受态细菌上的体积比为1:1〇〇，然后涂布于固体1^8(含有5〇111旨/1111卡 那霉素)培养基上，37°C培养箱过夜培养，挑取生长出的细菌菌落，送南京金斯瑞公司进行 测序鉴定，测序证实目的基因插入位点插入大小正确。所构建得到的祀T28a/enolase表达 载体示意图如图1B所示。图1B中，Π origin指基因复制子，kanr指卡那霉素抗性基因 ，Lacl 指乳糖基因 ，Not I和Nde I均指限制性内切酶，PV enoase指间日追原虫締醇化酶，His化g 指组氨酸标签，671化P指载体核糖核酸数目。
[0030] (3)重组enolase蛋白表达和纯化：
[0031 ] 将祀T28a/enolase表达载体（即连接产物)利用热激法(42°C、90sec)转化到化-21 (DH3)i)Lys感受态细菌上，pET28a/enolase表达载体与化-21 (D册）pLys感受态细菌的体积 比为1:1〇〇，然后涂布于固体18培养基(含有5〇111旨/1111卡那霉素)上，37°0培养箱过夜培养，挑 取单一菌落入液体LB培养基(含有50mg/ml卡那霉素）中，于37°C、220rpm摇床中培养，然后 按1:1000比例转接入新的液体LB培养基(含有50mg/ml卡那霉素）中，于37°C、220巧m摇床中 培养，培养至0D600值约为0.4时，加入0.5mM异丙基硫代-β-D-半乳糖巧（IPTG)，于28°C、摇 床诱导化，然后于4°C、10000巧m，离屯、lOmin，弃上清，收集细菌沉淀。然后将部分细菌沉淀 进行超声破碎(功率为400W，每次超声10秒，间隙10秒，超声99次），最后于1200化pm、4°C离 屯、lOmin，分别将超声前的细菌沉淀、超声后的细菌上清及超声后的细菌沉淀保存于负20°C 备用或者立即纯化。
[0032] 纯化方法如下：首先将NTA树脂装入合适的层析柱，用10倍NTA体积的NTA-OBuff er (20mM Tris-HCl pH7.9,0.5M 化Cl，10%Glycerol(甘油））洗;将超声后上清样品加到ΝΤΑ 层析柱中，流速控制在15ml/小时左右，收集穿透部分;再用5倍NTA体积的NTA-OBuffer洗， 流速控制在30ml/小时左右;然后分别用5倍NTA体积的NTA-20(20mM化is-HCl pH7.9，0.5M NaCl，10%Glycerol，20mM Imidazole(咪挫））、NTA-40(20mM Tris-肥 1 p