一种制备固定化碱性脂肪酶的方法
【专利摘要】本发明涉及一种制备固定化碱性脂肪酶的方法，属于生物化工技术领域。本发明针对目前国内碱性脂肪酶菌株的种类较少，产率低，同时在固定化过程中，工艺步骤复杂，固定化过程中酶活损失严重的问题，本发明首先利用芦花内部纤维素和木质素膨松，可做天然载体的特点，对其进行碱化处理，去除其中部分杂质，随后通过提取含油污泥内的微生物进行培养，再通过紫外和红外进行改性，筛选出高产率产碱性脂肪酶菌株，随后将其与处理后的芦花及其他营养物进行混合发酵，通过微生物分解芦花内的糖类物质，最后将酶固定于固化内的纤维素及木质素内，从而得到固定化碱性脂肪酶。
【专利说明】
一种制备固定化碱性脂肪酶的方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种制备固定化碱性脂肪酶的方法，属于生物化工技术领域。
【背景技术】
[0002]脂肪酶是一类特殊的酯键水解酶，可催化油脂的选择性水解及其它酯类的转酯、氨解反应等，是一种高效的生物催化剂，广泛应用于生物能源、食品、制革、洗涤、医药和有机合成等诸多工业领域。在众多脂肪酶中南极假丝酵母固定化脂肪酶B(以下简称固定化脂肪酶)的用途最为广泛，它对非水溶性和水溶性物质都有很强的催化活性。
[0003]我国于20世纪60年代才开始微生物脂肪酶的研究，起步较晚，与国外脂肪酶的研究存在一定的差距。研究主要集中在脂肪酶的结构鉴定、菌种筛选、酶工程及基因克隆等方面。由于碱性脂肪酶结构及性质的多样性、酶的不稳定性、底物的水不溶性、提纯困难等因素导致碱性脂肪酶的研究进展比较慢，而且国内研究的产碱性脂肪酶菌株的种类较少，主要有醋酸钙不动杆菌、类产碱假单胞菌、白地霉、青霉等，产率低。
[0004]目前市场上已经有多种商品化的固定化脂肪酶，其中应用较广的固定化脂肪酶是以颗粒状合成树脂为载体，采用共价结合的方法进行固定化的一类酶。这类固定化脂肪酶具有活力较高、酶载量大、使用寿命长的优点，其缺点是工艺复杂，酶分子经过多个步骤、以共价方式结合在预先制备好的载体上，固定化过程酶活损失严重，工艺对酶自身纯度要求也很高。另外此类固定化酶价格很高，一般在每公斤几千元以上，有的甚至超过万元。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题:针对目前国内碱性脂肪酶菌株的种类较少，产率低，同时在固定化过程中，工艺步骤复杂，固定化过程中酶活损失严重的问题，本发明首先利用芦花内部纤维素和木质素膨松，可做天然载体的特点，对其进行碱化处理，去除其中部分杂质，随后通过提取含油污泥内的微生物进行培养，再通过紫外和红外进行改性，筛选出高产率产碱性脂肪酶菌株，随后将其与处理后的芦花及其他营养物进行混合发酵，通过微生物分解芦花内的糖类物质，最后将酶固定于固化内的纤维素及木质素内，从而得到固定化碱性脂肪酶。本发明操作简单，酶活损失低，成本低。
[0006]为解决上述技术问题，本发明采用如下所述的技术方案是:
(1)按料液比1:2，取芦花和质量分数为30 %的氢氧化钠溶液放入容器中，对容器进行加热至50?60°C，以150r/min搅拌30?40min，再趁热过滤，使用蒸馈水冲洗过滤物直至过滤物pH至中性，将冲洗后的过滤物放入50 0C烘箱中干燥1?15min，得活化处理芦花；
(2)将上述所得的活化处理芦花浸泡于大豆油中，使用质量分数为40%氢氧化钠溶液调节pH至8.5?9.5，随后将混合物移至超声振荡器中，在22?24KHz下振荡30?40min，再进行过滤，收集过滤物，得固定化载体基体，备用；
(3)将含油污泥与无菌水按质量比1:2放入混合机中，以300r/min搅拌10?15min，再进行过滤，收集过滤液，将过滤液接种于固体培养基中，接种量为15?20%，随后将固体培养基移至恒温培养箱中，设定温度为28?32 °C，培养4?6天后，将培养基移至波长为320?345nm的紫外灯下进行照射5?6h，再将培养基移至波长为770?790nm的红外灯下照射40?50s ；
(4)在上述红外灯照射结束后，向固体培养基中加入固体培养基质量4?6%的大豆油和固体培养基质量10?15%的蔗糖搅拌均匀，再将固体培养基移至恒温培养箱中培养直至固体培养基表面菌丝长度达0.5?1.0cm，使用流速为10mL/min的无菌水淋洗固体培养基表面，直至固体培养基表面的菌丝完全洗脱，收集淋洗液，得改性菌丝悬浮液；
(5 )按重量份数计，取70?80份备用的固定化载体基体、12?15份葡萄糖、8?10份琼脂及15?18份淀粉，搅拌均匀后放入灭菌锅，杀菌消毒，得载体基料，按固液比1:2?4，取载体基料和上述所得的改性菌丝悬浮液，将载体基料放入发酵罐中，再向其中加入改性菌丝悬浮液，设定发酵罐温度为28?32°C，转速为180?200rpm，发酵4?7天后对发酵罐中的发酵混合物进行过滤，使用无菌水冲洗过滤物6?9次；
(6)将上述冲洗后的过滤物放入蒸馈水中浸泡，以120r/min搅拌20?30min，再将其放入喷雾干燥器中进行喷雾干燥，即可得到固定化碱性脂肪酶。
[0007]所述的步骤(3)中固体培养基为按重量份数计，取40?50份蛋白胨、20?25份琼月旨、10?15份酵母浸膏及4?8份大豆油，搅拌均匀，使用质量分数为40%的氢氧化钠溶液调节pH至8.5?9.0，即可得到固体培养基。
[0008]经检测本发明所得的固定化碱性脂肪酶得:固定化碱性脂肪酶活力为12300?139001]/^，固定化酶活力850?9631]/^载体，固定化碱性脂肪酶的酯化率达到91.5?96.2%,酶活回收率效率达到96?99 %。
[0009]本发明与其他方法相比，有益技术效果:
(1)本发明操作简单，酶活损失低，成本低；
(2)本发明利用含油污泥内的丰富菌种，简单易得，且所得菌种碱性脂肪酶高。
【具体实施方式】
[0010]按料液比1:2，取芦花和质量分数为30%的氢氧化钠溶液放入容器中，对容器进行加热至50?60°C，以150r/min搅拌30?40min，再趁热过滤，使用蒸馈水冲洗过滤物直至过滤物pH至中性，将冲洗后的过滤物放入50 0C烘箱中干燥10?15min，得活化处理芦花;将上述所得的活化处理芦花浸泡于大豆油中，使用质量分数为40%氢氧化钠溶液调节pH至8.5?9.5，随后将混合物移至超声振荡器中，在22?24KHz下振荡30?40min，再进行过滤，收集过滤物，得固定化载体基体，备用；将含油污泥与无菌水按质量比1: 2放入混合机中，以300r/min搅拌10?15min，再进行过滤，收集过滤液，将过滤液接种于固体培养基中，接种量为15?20%，随后将固体培养基移至恒温培养箱中，设定温度为28?32°C，培养4?6天后，将培养基移至波长为320?345nm的紫外灯下进行照射5?6h，再将培养基移至波长为770?790nm的红外灯下照射40?50s;在上述红外灯照射结束后，向固体培养基中加入固体培养基质量4?6%的大豆油和固体培养基质量10?15%的蔗糖搅拌均匀，再将固体培养基移至恒温培养箱中培养直至固体培养基表面菌丝长度达0.5?1.0cm，使用流速为lOmL/min的无菌水淋洗固体培养基表面，直至固体培养基表面的菌丝完全洗脱，收集淋洗液，得改性菌丝悬浮液;按重量份数计，取70?80份备用的固定化载体基体、12?15份葡萄糖、8?10份琼脂及15?18份淀粉，搅拌均匀后放入灭菌锅，杀菌消毒，得载体基料，按固液比1:2?4，取载体基料和上述所得的改性菌丝悬浮液，将载体基料放入发酵罐中，再向其中加入改性菌丝悬浮液，设定发酵罐温度为28?32°C，转速为180?200rpm，发酵4?7天后对发酵罐中的发酵混合物进行过滤，使用无菌水冲洗过滤物6?9次;将上述冲洗后的过滤物放入蒸馏水中浸泡，以120r/min搅拌20?30min，再将其放入喷雾干燥器中进行喷雾干燥，即可得到固定化碱性脂肪酶。所述的固体培养基为按重量份数计，取40?50份蛋白胨、20?25份琼脂、10?15份酵母浸膏及4?8份大豆油，搅拌均匀，使用质量分数为40%的氢氧化钠溶液调节pH至8.5?9.0，即可得到固体培养基。
[0011]实例I
按料液比1: 2，取芦花和质量分数为30%的氢氧化钠溶液放入容器中，对容器进行加热至50°C，以150r/min搅拌30min，再趁热过滤，使用蒸馈水冲洗过滤物直至过滤物pH至中性，将冲洗后的过滤物放入50°C烘箱中干燥lOmin，得活化处理芦花;将上述所得的活化处理芦花浸泡于大豆油中，使用质量分数为40%氢氧化钠溶液调节pH至8.5，随后将混合物移至超声振荡器中，在22KHz下振荡30min，再进行过滤，收集过滤物，得固定化载体基体，备用;将含油污泥与无菌水按质量比1: 2放入混合机中，以300r/min搅拌1min，再进行过滤，收集过滤液，将过滤液接种于固体培养基中，接种量为15%，随后将固体培养基移至恒温培养箱中，设定温度为28°C，培养4天后，将培养基移至波长为320nm的紫外灯下进行照射5h，再将培养基移至波长为770nm的红外灯下照射40s;在上述红外灯照射结束后，向固体培养基中加入固体培养基质量4%的大豆油和固体培养基质量10%的蔗糖搅拌均匀，再将固体培养基移至恒温培养箱中培养直至固体培养基表面菌丝长度达0.5cm，使用流速为10mL/min的无菌水淋洗固体培养基表面，直至固体培养基表面的菌丝完全洗脱，收集淋洗液，得改性菌丝悬浮液;按重量份数计，取70份备用的固定化载体基体、15份葡萄糖、10份琼脂及18份淀粉，搅拌均匀后放入灭菌锅，杀菌消毒，得载体基料，按固液比1:2，取载体基料和上述所得的改性菌丝悬浮液，将载体基料放入发酵罐中，再向其中加入改性菌丝悬浮液，设定发酵罐温度为28°C，转速为180rpm，发酵4天后对发酵罐中的发酵混合物进行过滤，使用无菌水冲洗过滤物6次;将上述冲洗后的过滤物放入蒸馏水中浸泡，以120r/min搅拌20min，再将其放入喷雾干燥器中进行喷雾干燥，即可得到固定化碱性脂肪酶。所述的固体培养基为按重量份数计，取40份蛋白胨、25份琼脂、15份酵母浸膏及8份大豆油，搅拌均匀，使用质量分数为40 %的氢氧化钠溶液调节pH至8.5，即可得到固体培养基。
[0012]经检测本发明所得的固定化碱性脂肪酶得:固定化碱性脂肪酶活力为12300U/g，固定化酶活力850U/g载体，固定化碱性脂肪酶的酯化率达到91.5%，酶活回收率效率达到96%。
[0013]实例2
按料液比1: 2，取芦花和质量分数为30%的氢氧化钠溶液放入容器中，对容器进行加热至60°C，以150r/min搅拌40min，再趁热过滤，使用蒸馈水冲洗过滤物直至过滤物pH至中性，将冲洗后的过滤物放入50°C烘箱中干燥15min，得活化处理芦花;将上述所得的活化处理芦花浸泡于大豆油中，使用质量分数为40%氢氧化钠溶液调节pH至9.5，随后将混合物移至超声振荡器中，在24KHz下振荡40min，再进行过滤，收集过滤物，得固定化载体基体，备用；将含油污泥与无菌水按质量比1:2放入混合机中，以30(^/11^11搅拌1511^11，再进行过滤，收集过滤液，将过滤液接种于固体培养基中，接种量为20%，随后将固体培养基移至恒温培养箱中，设定温度为32°C，培养6天后，将培养基移至波长为345nm的紫外灯下进行照射6h，再将培养基移至波长为790nm的红外灯下照射50s;在上述红外灯照射结束后，向固体培养基中加入固体培养基质量6%的大豆油和固体培养基质量15%的蔗糖搅拌均匀，再将固体培养基移至恒温培养箱中培养直至固体培养基表面菌丝长度达1.0cm，使用流速为10mL/min的无菌水淋洗固体培养基表面，直至固体培养基表面的菌丝完全洗脱，收集淋洗液，得改性菌丝悬浮液；按重量份数计，取80份备用的固定化载体基体、12份葡萄糖、8份琼脂及15份淀粉，搅拌均匀后放入灭菌锅，杀菌消毒，得载体基料，按固液比1:4，取载体基料和上述所得的改性菌丝悬浮液，将载体基料放入发酵罐中，再向其中加入改性菌丝悬浮液，设定发酵罐温度为32°C，转速为200rpm，发酵7天后对发酵罐中的发酵混合物进行过滤，使用无菌水冲洗过滤物9次;将上述冲洗后的过滤物放入蒸馏水中浸泡，以120r/min搅拌30min，再将其放入喷雾干燥器中进行喷雾干燥，即可得到固定化碱性脂肪酶。所述的固体培养基为按重量份数计，取50份蛋白胨、20份琼脂、10份酵母浸膏及4份大豆油，搅拌均匀，使用质量分数为40 %的氢氧化钠溶液调节pH至9.0，即可得到固体培养基。
[0014]经检测本发明所得的固定化碱性脂肪酶得:固定化碱性脂肪酶活力为13900U/g，固定化酶活力963U/g载体，固定化碱性脂肪酶的酯化率达到96.2%，酶活回收率效率达到99%。
[0015]实例3
按料液比1: 2，取芦花和质量分数为30%的氢氧化钠溶液放入容器中，对容器进行加热至55°C，以150r/min搅拌35min，再趁热过滤，使用蒸馈水冲洗过滤物直至过滤物pH至中性，将冲洗后的过滤物放入50°C烘箱中干燥12min，得活化处理芦花;将上述所得的活化处理芦花浸泡于大豆油中，使用质量分数为40%氢氧化钠溶液调节pH至9.3，随后将混合物移至超声振荡器中，在23KHz下振荡35min，再进行过滤，收集过滤物，得固定化载体基体，备用;将含油污泥与无菌水按质量比I: 2放入混合机中，以300r/min搅拌12min，再进行过滤，收集过滤液，将过滤液接种于固体培养基中，接种量为18%，随后将固体培养基移至恒温培养箱中，设定温度为30°C，培养5天后，将培养基移至波长为340nm的紫外灯下进行照射5h，再将培养基移至波长为780nm的红外灯下照射45s;在上述红外灯照射结束后，向固体培养基中加入固体培养基质量5%的大豆油和固体培养基质量12%的蔗糖搅拌均匀，再将固体培养基移至恒温培养箱中培养直至固体培养基表面菌丝长度达0.8cm，使用流速为10mL/min的无菌水淋洗固体培养基表面，直至固体培养基表面的菌丝完全洗脱，收集淋洗液，得改性菌丝悬浮液;按重量份数计，取78份备用的固定化载体基体、14份葡萄糖、9份琼脂及17份淀粉，搅拌均匀后放入灭菌锅，杀菌消毒，得载体基料，按固液比1:3，取载体基料和上述所得的改性菌丝悬浮液，将载体基料放入发酵罐中，再向其中加入改性菌丝悬浮液，设定发酵罐温度为30°C，转速为190rpm，发酵5天后对发酵罐中的发酵混合物进行过滤，使用无菌水冲洗过滤物8次;将上述冲洗后的过滤物放入蒸馏水中浸泡，以120r/min搅拌25min，再将其放入喷雾干燥器中进行喷雾干燥，即可得到固定化碱性脂肪酶。所述的固体培养基为按重量份数计，取45份蛋白胨、24份琼脂、14份酵母浸膏及7份大豆油，搅拌均匀，使用质量分数为40 %的氢氧化钠溶液调节pH至9.0，即可得到固体培养基。
[0016]经检测本发明所得的固定化碱性脂肪酶得:固定化碱性脂肪酶活力为13862U/g，固定化酶活力933U/g载体，固定化碱性脂肪酶的酯化率达到95.8% ,酶活回收率效率达到98%。
【主权项】
1.一种制备固定化碱性脂肪酶的方法，其特征在于具体制备步骤为: (1)按料液比1:2，取芦花和质量分数为30%的氢氧化钠溶液放入容器中，对容器进行加热至50?60°C，以150r/min搅拌30?40min，再趁热过滤，使用蒸馈水冲洗过滤物直至过滤物pH至中性，将冲洗后的过滤物放入50 0C烘箱中干燥1?15min，得活化处理芦花； (2)将上述所得的活化处理芦花浸泡于大豆油中，使用质量分数为40%氢氧化钠溶液调节pH至8.5?9.5，随后将混合物移至超声振荡器中，在22?24KHz下振荡30?40min，再进行过滤，收集过滤物，得固定化载体基体，备用； (3)将含油污泥与无菌水按质量比1:2放入混合机中，以300r/min搅拌10?15min，再进行过滤，收集过滤液，将过滤液接种于固体培养基中，接种量为15?20%，随后将固体培养基移至恒温培养箱中，设定温度为28?32 °C，培养4?6天后，将培养基移至波长为320?345nm的紫外灯下进行照射5?6h，再将培养基移至波长为770?790nm的红外灯下照射40?50s ； (4)在上述红外灯照射结束后，向固体培养基中加入固体培养基质量4?6%的大豆油和固体培养基质量10?15%的蔗糖搅拌均匀，再将固体培养基移至恒温培养箱中培养直至固体培养基表面菌丝长度达0.5?1.0cm，使用流速为10mL/min的无菌水淋洗固体培养基表面，直至固体培养基表面的菌丝完全洗脱，收集淋洗液，得改性菌丝悬浮液； (5)按重量份数计，取70?80份备用的固定化载体基体、12?15份葡萄糖、8?1份琼脂及15?18份淀粉，搅拌均匀后放入灭菌锅，杀菌消毒，得载体基料，按固液比1:2?4，取载体基料和上述所得的改性菌丝悬浮液，将载体基料放入发酵罐中，再向其中加入改性菌丝悬浮液，设定发酵罐温度为28?32°C，转速为180?200rpm，发酵4?7天后对发酵罐中的发酵混合物进行过滤，使用无菌水冲洗过滤物6?9次； (6)将上述冲洗后的过滤物放入蒸馈水中浸泡，以120r/min搅拌20?30min，再将其放入喷雾干燥器中进行喷雾干燥，即可得到固定化碱性脂肪酶。2.根据权利要求1所述的一种制备固定化碱性脂肪酶的方法，其特征在于:所述的步骤(3)中固体培养基为按重量份数计，取40?50份蛋白胨、20?25份琼脂、10?15份酵母浸膏及4?8份大豆油，搅拌均匀，使用质量分数为40%的氢氧化钠溶液调节pH至8.5?9.0，即可得到固体培养基。
【文档编号】C12N11/12GK105907740SQ201610477129
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年6月27日
【发明人】董晓, 宋奇
【申请人】董晓