专利名称：一种测定玉米种胚脂肪氧化酶活性的方法
技术领域：
本发明涉及一种测定玉米种胚脂肪氧化酶活性的方法。
背景技术：
酶是一种有生物催化活性的蛋白质。其活性受到温度，反应缓冲液PH值，缓冲液种类、浓度和底物浓度等条件影响，因此测量酶的活性，就需要知道酶反应的条件。脂肪氧化氧化酶(lipoxygenase，LOX，ECl. 13. 11. 12)，是脂类降解的关键酶之一， 以不饱和脂肪酸为底物，可以产生醛、酮等有毒害的物质。在大豆种子(David J. Parrish和 A. Carl Leopold, 1978 ；Robert L. Tilden 和 Sherlie H. West，1985 ；)，水稻种子(吴跃进， 吴敬德，张瑛，2001)中均证明脂肪氧化酶与种子的耐贮藏性质相关。王镜岩，朱圣康，徐长法(2002)指出，脂肪氧化酶催化的反应需要活性氧参加，作用机理是将不饱和脂肪酸中的双键氧化断裂为小分子的醛、酮等物质，如丙二醛等，进而引起细胞膜通透性的变化或者蛋白质的变性。测量脂肪氧化酶活性的方法有很多种，其中紫外分光光度计法是最普遍的一种方法。其原理是通过反应底物亚油酸在234nm处与脂肪氧化酶反应发生散射而产生分光光度值的变化。利用紫外分光光度计法来测量脂肪氧化酶活性，通常有两个问题需要解决。一是亚油酸在不同的PH值条件下会产生溶解度的变化，通常反应环境的pH值越低，亚油酸的溶解度越小，在未加入酶液时就会产生浑浊，从而干扰测量的灵敏性。如果采用降低亚油酸底物的方法，则会影响其测量范围。二是亚油酸在不同浓度的反应缓冲液条件下溶解度也会发生变化。其实质是反应液中离子浓度对亚油酸溶解度的影响。因此，不同的作物脂肪氧化酶测量的条件不同。大豆种子、花生种子脂肪氧化酶的紫外分光光度计法均有报道，但是玉米种子脂肪氧化酶的紫外分光光度计法未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种测定玉米种胚脂肪氧化酶活性的方法。本发明所提供的测定玉米种胚脂肪氧化酶活性的方法，包括如下步骤使酶活检测体系在温度为2416°C的条件下反应，分别在反应的tl时刻和t2时刻测定酶活检测体系在234nm处的OD值，分别记作OD (tl)和OD (t2)；根据下述公式1 :A = 60sX
/0.01/(t2-tl)计算出玉米种胚脂肪氧化酶活性；所述酶活检测体系由吐温20、亚油酸、pH值为8. 0浓度为0. 02mol/ml的1Tris-Hcl 缓冲液和待测玉米种胚脂肪氧化酶组成；所述酶活检测体系中亚油酸浓度为0. 3mmol/L, 吐温20浓度为0. 25mmol/L，待测玉米种胚脂肪氧化酶的浓度不大于0. 0167mg/3mL ；玉米种胚脂肪氧化酶活性的定义为所述酶活检测体系每分钟增加0. 01个吸光度所需要的酶量为一个酶活力单位。其中，所述tl可为反应开始时计起的第15s ；所述t2可为所述反应开始时计起的第 30s。具体测定方法包括下述步骤1)从玉米种胚中提取脂肪氧化酶，得到玉米种胚脂肪氧化酶粗酶液；2)配制含吐温20的亚油酸溶液，其中，所述吐温20的质量浓度为8. 3mmol/L，亚油酸的浓度为lOmmol/L ；3)取适当体积的粗酶液和100 μ 1步骤2)配制的含吐温20的亚油酸溶液，并加入 0. 02mol/L、pH值8. 0的Tris-Hcl缓冲液将体积补至:3ml，得到反应体系，所述反应体系中酶蛋白含量不大于0. 0167mg ；将所述反应体系在温度为M_26°C的条件下进行反应，用紫外分光光度计分别测定反应15秒、30秒时反应体系在234nm处的OD值，代入公式1，计算出玉米种胚脂肪氧化酶活性。其中，步骤1)中从玉米种胚中提取脂肪氧化酶可按照下述方法进行取萌发24h 的玉米种胚，加入pH值为7. 0、浓度为0. 05mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液进行冰上研磨，磨碎后离心、收集上清液，即为玉米种胚脂肪氧化酶粗酶液，其中，玉米种胚与缓冲液的质量比可为Ig IOml0本发明通过设计梯度实验，确定了采用紫外分光光度计法测量玉米种胚脂肪氧化酶活性适宜的反应缓冲液PH值和浓度。相对于现有的种子脂肪氧化酶的测量方法，本发明方法有四个优点，一是可以定量的测量出脂肪氧化酶活性，二是对玉米种胚脂肪氧化酶活性的测量提供了适宜的条件。三是反应步骤简单，易于操作，四是酶液和底物亚油酸用量少，节约成本。采用本发明的方法测量玉米种胚脂肪氧化酶活性，对筛选耐贮藏玉米品种和公司调控种子贮藏条件都具有重要意义。
图1为0. 02mol/L反应缓冲液PH值对脂肪氧化酶活性影响。图2为pH8. 0条件下不同反应缓冲液浓度对脂肪氧化酶活性的影响。
具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。下述实施例中所用的玉米自交系178在文献“许启凤，优质高产玉米新品种农大 108的选育与推广[J].中国农业大学学报，2003，8(1) :25力6”中公开过，公众可从中国农业大学获得。实施例1、考察玉米种胚脂肪氧化酶酶活紫外线测定方法最适的反应缓冲液pH值和浓度1)提取玉米种胚脂肪氧化酶液取玉米种胚0. 3g，加入3. Oml pH值为7. 0，浓度为0. 05mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液进行冰上研磨，磨碎后离心、收集上清液， 即为玉米种胚脂肪氧化酶粗酶液，放入4°C储存，尽快进行测量。采用考马斯亮蓝法测定粗酶液中的可溶性蛋白的含量，标准曲线由浓度为0-0. 2mg的牛血清白蛋白建立，标准曲线方程为 Y = 4. 964X+0. 0422。
2)配制反应底物(含吐温20的亚油酸溶液)配制lOmmol/L的亚油酸溶液，内含 8. 3mmol/L 的吐温 20。3)配制不同pH值的反应缓冲液0. 02mol/l、pH值3. 0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，0. 02mol/l, pH值4. 0醋酸-醋酸钠缓冲液，0. 02mol/l, pH值5. 0醋酸-醋酸钠缓冲液，0. 02mol/l、pH值6. 0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，0. 02mol/l、pH值7. 0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，0. 02mol/L、pH值8. 0的Tris-Hcl缓冲液。从下述三方面考察最适的反应缓冲液pH值和浓度一、考察反应缓冲液pH值对底物亚油酸吸光度的影响将上述2)配制的底物用3)中不同pH值的缓冲液进行不同倍数的稀释，用紫外分光光度计测定混合1 和30s时在234nm处的OD值，确定/NOD值变化范围在0到0. 002 之间时所需要的亚油酸浓度的范围，结果见表1。表 权利要求
1.一种测定玉米种胚脂肪氧化酶活性的方法，包括如下步骤使酶活检测体系在温度为2446°C的条件下反应，分别在反应的tl时刻和t2时刻测定酶活检测体系在234nm处的 OD 值，分别记作 OD (tl)和 0D(t2)；根据下述公式 1 :A = 60sX
/0. 01/ (t2-tl)计算出玉米种胚脂肪氧化酶活性；所述酶活检测体系由吐温20、亚油酸、pH值为8. 0浓度为0. 02mol/ml的Tris-Hcl缓冲液和待测玉米种胚脂肪氧化酶组成；所述酶活检测体系中亚油酸浓度为0. 3mmol/L,吐温20浓度为0. 25mmol/L，待测玉米种胚脂肪氧化酶的浓度不大于0. 0167mg/3mL ；玉米种胚脂肪氧化酶活性的定义为所述酶活检测体系每分钟增加0. 01个吸光度所需要的酶量为一个酶活力单位。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述tl为反应开始时计起的第15s；所述 t2为所述反应开始时计起的第30s。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述方法具体包括下述步骤1)从玉米种胚中提取脂肪氧化酶，得到玉米种胚脂肪氧化酶粗酶液；2)配制含吐温20的亚油酸溶液，其中，所述吐温20的质量浓度为8.3mmol/L，亚油酸的浓度为lOmmol/L ；3)取适量粗酶液和100μ 1步骤2~)所述含吐温20的亚油酸溶液，并加入0. 02mol/L、 PH值8. 0的Tris-Hcl缓冲液将体积补至:3ml，得到酶活检测体系，所述酶活检测体系中玉米种胚脂肪氧化酶含量不大于0. 0167mg ；使所述酶活检测体系在温度为M_26°C的条件下反应，用紫外分光光度计分别测定反应15秒、30秒时体系在234nm处的OD值，代入公式1， 计算出玉米种胚脂肪氧化酶活性。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤1)中从玉米种胚中提取脂肪氧化酶的方法如下取萌发Mh的玉米种胚，加入pH值为7. 0、浓度为0. 05mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液进行冰上研磨，磨碎后离心、收集上清液，即为玉米种胚脂肪氧化酶粗酶液，其中，玉米种胚与缓冲液的质量比为Ig 10ml。
全文摘要
本发明公开了一种测定玉米种胚脂肪氧化酶活性的方法。该方法包括如下步骤使酶活检测体系在24-26℃下反应，分别在反应t1和t2时刻测定体系在234nm处的OD值，分别记作OD(t1)和OD(t2)；根据下述公式1A＝60s×[OD(t2)-OD(t1)]/0.01/(t2-t1)计算出玉米种胚脂肪氧化酶活性；所述酶活检测体系由吐温20、亚油酸、pH值为8.0浓度为0.02mol/ml的Tris-Hcl缓冲液和待测玉米种胚脂肪氧化酶组成；其中亚油酸浓度为0.3mmol/L，吐温20浓度为0.25mmol/L，待测玉米种胚脂肪氧化酶的浓度不大于0.0167mg/3mL；酶活定义为所述酶活检测体系每分钟增加0.01个吸光度所需要的酶量为一个酶活力单位。
文档编号G01N21/78GK102279181SQ201110096159
公开日2011年12月14日 申请日期2011年4月18日 优先权日2011年4月18日
发明者王国英, 王建华, 胡新民, 赵正楠 申请人:中国农业大学