专利名称：一种定量测定作物种子脂肪氧化酶活性的方法
技术领域：
本发明属于生物化学领域，涉及一种对作物种子中脂肪氧化酶活性进行 单粒、定量测定的方法。
背景技术：
小麦是人类最主要的食物来源之一，它可以被多年贮藏并利用。但一直 以来，对小麦的研究主要集中在提高产量、蛋白质品质和抗性方面，而没有 关注其贮藏品质，小麦作为我国重要的粮食战略储备物质，其贮藏品质与产 出同样重要。小麦在一般贮藏条件下第二年开始陈化变质，在高温高湿地区 贮藏发生陈化劣变的时间则更短，小麦陈化变质将导致品质降低，商品性下 降，加上霉变，仓储害虫危害等影响，严重威胁着粮食的贮藏安全。
脂肪氧化酶(Lipoxygenase, EC 1.13.11.12)是一种含铁的氧化还原酶， 它催化含有顺-顺-l,4-戊二烯的多不饱和脂肪酸及其酯形成氢过氧化物。脂肪 氧化酶广泛存在于自然界，已经在植物、动物及真菌中发现，在植物中已发 现多种脂肪氧化酶的同工酶，如在大豆种子中已发现至少有三种由不同基 因编码的同工酶。脂肪氧化酶的底物为亚油酸和花生四烯酸，亚油酸是许多 植物种子中含量最高的脂肪酸。亚油酸经脂肪氧化酶催化形成C6醛类、醇类 化合物，这些挥发性物质会产生陈味，导致加工食品的品质降低。研究表明 种子保存过程中脂肪酸的降解是导致品质劣变，产生陈味及劣变的根源，脂 肪氧化酶缺失或其活性降低能减少氧化变质，延长种子C藏期。
小麦脂肪氧化酶活性的测定方法已经报道的大约有以下3种。最常应用 的是测定234nm处脂肪氧化酶反应直接产物-氢过氧化物的含量，这种方法对 己经提纯的酶很适用，但不适合测定粗酶活性，因为粗酶中含有其它吸收紫 外光的物质会干扰测定；同时，此方法操作繁琐，因此限制了它的应用。另 一种方法是氧-电极法，这种方法测定很准确，但由于氧电极价格昂贵，同时 需要专业人员，测定繁琐，推广很难。第三种方法是单克隆抗体法，这种方
法需要制备专一的抗体，测定准确，但周期长，对实验设备要求很高，普通 实验室很难进行。以上3种方法均需要数克以上分析样品，不能实现单粒定
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种快速、准确、简便的作 物单粒种子脂肪氧化酶活性定量测定方法。
本发明所述的作物包括小麦、玉米、大豆、水稻、花生、荞麦、大麦等 农作物。
本发明的单粒小麦种子中脂肪氧化酶活性定量测定方法的主要原理在 一定时间内，脂肪氧化酶的活性大小与其催化反应生成的氢过氧化物的量呈 正比例，氢过氧化物在酸性条件下，能使碘化钾氧化为碘，碘与淀粉反应生
成蓝色物质，该颜色物质在470nm处有特征吸收峰。因此，测定蓝色物质的 量就可以相应计算出脂肪氧化酶的活性。本实验的反应原理如下-
脂肪氧化酶 亚油酸+02- 氢过氧化物
氢过氧化物+r+H+4 12+亚油酸醇 12+淀粉~>蓝色物质
本发明测定作物种子脂肪氧化酶活性的方法，包括以下步骤
(1) 、提取粗酶
取单粒作物种子，磨粉后加入0.6 3.0mlPH6.0 7.0磷酸缓冲液(小麦、 水稻、大麦、荞麦加入0.6ml，玉米加入l.Oml，大豆加入2.0ml，花生加入 3.0ml)，于0。C静置1小时，其间振荡2次，每次30秒；离心，12,000转/分 钟，10分钟，4°C,上清液过三层粗棉布即得粗酶液，立即放入-20。C保存； 采用考马斯亮蓝法测定提取液中可溶性蛋白的含量，标准曲线由牛血清蛋白 (浓度10-60ng/ml)建立。
(2) 、配制亚油酸底物溶液
于800^1蒸馏水中加入15.6|xl吐温20、 15.6nl亚油酸，摇匀后加入100^1、 lM的NaOH,加蒸馏水定容至5ml。
(3) 、配制淀粉液
于1.0克可溶性淀粉中加入100ml蒸馏水，沸水浴中加热直到溶液透明，
冷却后使用。
(4) 、配制碘化钾溶液 称取1.5克KI加入1.0ml蒸馏水，缓慢加热溶解，冷却后有KI沉淀。
(5) 、配制柠檬酸溶液
称取52.5克柠檬酸，加入蒸馏水定容至250ml。
(6) 、粗酶活性的测定
取O.lml粗酶提取液，加入0.2ml亚油酸底物溶液，摇匀后再加入0.1ml 淀粉液，0.2ml碘化钾液和2.4ml柠檬酸液，30'C静置5分钟后测定470nm处 的吸光值；另取0.1ml粗酶提取液作为空白对照，在沸水浴中煮10分钟后， 加入0.2mi亚油酸底物溶液，摇匀后再加入0.1ml淀粉液，0.2ml碘化钾液和 2.4ml柠檬酸液，3(TC静置5分钟后测定470nm处的吸光值。在上述反应条件 下，将每分钟催化每毫克总蛋白所需的酶量定义为1个活力单位(U)，由此 得出酶活力计算公式为U二(吸光值X1000)/(蛋白质含量mgX时间min)。
本发明方法的用途如下
① 、用于开展控制脂肪氧化酶活性相关基因的遗传学研究。
② 、用于耐储藏作物育种的辅助选择指标。
③ 、供育种学家筛选脂肪氧化酶缺失或高活性的材料，于耐储藏作物育 种的亲本资源。
④ 、作为粮食贮藏部门中长期种子库，及农民储粮大户检测其耐贮藏性、 食品加工品质的依据。
⑤ 、作为种子部门鉴定品种耐贮藏性的指标之一。 本发明具有如下优点
① 、直接利用小麦等作物种子做材料，仅需单粒种子即可，解决了不能 对作物单个籽粒进行脂肪氧化酶活性的测定的问题；
② 、利用分光光度计对淀粉-碘化钾的颜色变化进行测定，这样做不仅具
有简便、快速的优点，而且能对脂肪氧化酶活性进行定量测定；
③ 、不需要复杂的实验条件和高精密的实验仪器。本方法只需可见分光 光度计和离心机即可，仪器设备费用低，能满足国内的绝大多数实验室条件,
易于推广； ④ 、本方法具有时间短，通量高的特点。完成单个样品的测定只需2-3 小时，完成上百个样品的测定需要l-2天即可，可满足耐储藏小麦等作物育种 过程中对大量分离后代的筛选；⑤ 、本发明提出测定脂肪氧化酶活性的方法，操作简便、迅速。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步说明。 实施例l:小麦品种脂肪氧化酶活性的单粒测定粗酶的提取取小麦品种日喀则23号种子一粒，磨粉后加入0.6ml PH7.0 磷酸缓冲液，于(TC静置1小时，其间振荡2次，每次30秒；l小时后离心， 12,000转/分钟，IO分钟，4°C，上清液过三层粗棉布后即为粗酶液，立即放 入-2(TC保存。提取液中可溶性蛋白含量的测定应用考马斯亮蓝方法，标准曲 线由牛血清蛋白(浓度10-60pg/ml)建立。亚油酸底物溶液的配制于80(^1蒸馏水中加入15.6^1吐温20， 15.6^1 亚油酸，摇匀后加入10(^1， 1M的NaOH，加蒸馏水定容至5ml。淀粉液的配制于1.0克可溶性淀粉中加入100ml蒸馏水，沸水浴中加热 直到溶液透明，冷却后使用。碘化钾溶液的配制称取1.5克KI加入1.0ml蒸馏水，缓慢加热溶解。 柠檬酸溶液的配制称取52.5克柠檬酸，加入蒸馏水溶解，定容至250ml。 粗酶活性的测定30'C时，在0.11111粗酶提取液中加入0.21111亚油酸底物 溶液，摇匀后再加入O.lml淀粉液,0.2ml碘化钾液和2.4ml柠檬黢液(另取O.lml 粗酶提取液在沸水浴中煮10分钟作为空白对照，其它的操作同上)，静置5 分钟后测定470nm处的吸光值，由此测出日喀则23号脂肪氧化酶的活性为 179.9U。实施例2:小麦品种脂肪氧化酶活性的单粒测定取小麦品种日喀则54号种子一粒，其它方法同实施例l，测出日咯则54 号脂肪氧化酶的活性为177.3U。实旌例3:玉米品种脂肪氧化酶活性的单粒测定取玉米品种S37种子一粒，磨粉后加入1.0mlPH7.0磷酸缓冲液，其它方 法同实施例1，测出玉米品种S37脂肪氧化酶的活性为149.8U。
实施例4:荞麦品种脂肪氧化酶活性的单粒测定-取黑水甜荞地方品种种子一粒，其它方法同实施例1，测出黑水甜荞地方 品种脂肪氧化酶的活性为83.8U。实施例5:水稻品种脂肪氧化酶活性的单粒测定取水稻品种明恢63种子一粒，其它方法同实施例l，测出明恢63脂肪氧 化酶的活性为126.6U。实施例6:花生品种脂肪氧化酶活性的单粒测定取花生品种天府10号种子一粒，磨粉后加入3.0ml PH7.D磷酸缓冲液， 其它方法同实施例1，测出天府10号花生的脂肪氧化酶的活性为188.6U。 实施例7:大豆品种脂肪氧化酶活性的单粒测定取大豆品种成豆1号种子一粒，磨粉后加入2.0mlPH6.0磷酸缓冲液，其 它方法同实施例1，测出成豆1号脂肪氧化酶的活性为583.6U。 实施例8:大麦品种脂肪氧化酶活性的单粒测定取大麦品种藏青311种子一粒，磨粉后加入0.6mlPH7.0磷酸缓冲液，其 它方法同实施例1,测出大麦藏青311脂肪氧化酶的活性为174.1U。
权利要求
1. 一种定量测定作物种子脂肪氧化酶活性的方法，其特征是包括以下步骤(1)、提取粗酶取单粒作物种子，磨粉后加入0.6～3.0ml PH6.0～7.0磷酸缓冲液，于0℃静置1小时，其间振荡2次，每次30秒，12000转/分钟离心10分钟，4℃，上清液过三层粗棉布即得粗酶液，立即放入-20℃保存，采用考马斯亮蓝法测定提取液中可溶性蛋白的含量，标准曲线由浓度为10-60μg/ml的牛血清蛋白；(2)、配制亚油酸底物溶液于800μl蒸馏水中加入15.6μl吐温20，15.6μl亚油酸，摇匀后加入100μl、1M的NaOH，加蒸馏水定容至5ml；(3)、配制淀粉溶液于1.0克可溶性淀粉中加入100ml蒸馏水，沸水浴中加热直到溶液透明，冷却后使用；(4)、配制碘化钾溶液称取1.5克KI，加入1.0ml蒸馏水，缓慢加热，冷却后有KI沉淀；(5)、配制柠檬酸溶液称取52.5克柠檬酸，加入蒸馏水定容至250ml；(6)、粗酶活性的测定取0.1ml粗酶提取液，加入0.2ml亚油酸底物溶液，摇匀后再加入0.1ml淀粉液、0.2ml碘化钾液和2.4ml柠檬酸液，30℃静置5分钟后测定470nm处的吸光值；另取0.1ml粗酶提取液作为空白对照，在沸水浴中煮10分钟后，加入0.2ml亚油酸底物溶液，摇匀后再加入0.1ml淀粉液，0.2ml碘化钾液和2.4ml柠檬酸液，30℃静置5分钟后测定470nm处的吸光值；在上述反应条件下，将每分钟催化每毫克总蛋白所需的酶量定义为1个活力单位(U)，由此得出酶活力计算公式为U＝(吸光值×1000)/(蛋白质含量mg×时间min)。
2. 根据权利要求1所述的定量测定作物种子脂肪氧化酶活性的方法，其特征 是磷酸缓冲液的加入量因作物种类的不同而不同，其中小麦、水稻、大 麦、荞麦的加入量为0.6ml，玉米的加入量为l.Oml，大豆的加入量为2.0ml， 花生的加入量为3.0ml。
全文摘要
本发明属于生物化学领域，涉及一种对作物种子中脂肪氧化酶活性进行单粒、定量测定的方法。包括提取粗酶、亚油酸底物溶液的配制、淀粉液的配制、碘化钾溶液的配制、柠檬酸溶液配制、粗酶活性的测定六个步骤。本发明具有可用单粒种子测定、使用设备简单、操作简便、测量迅速、通量高、测定结果准确等优点。
文档编号G01N21/31GK101210877SQ200610022638
公开日2008年7月2日 申请日期2006年12月25日 优先权日2006年12月25日
发明者波 冯, 徐智斌, 涛 王 申请人:中国科学院成都生物研究所