具有脂肪酶活性的多肽及编码它的多核苷酸的制作方法

具有脂肪酶活性的多肽及编码它的多核苷酸的制作方法
【专利摘要】本发明涉及具有脂肪酶活性的分离的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。本发明还涉及核酸构建体、载体以及包括这些多核苷酸的宿主细胞连同产生和使用这些多肽的方法。
【专利说明】具有脂肪酶活性的多肽及编码它的多核苷酸
[0001] 序列表的引用
[0002] 本申请包括一个计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。
[0003] 发明背景 发明领域
[0004] 本发明涉及具有脂肪酶活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。本发明还涉及核 酸构建体、载体以及包括这些多核苷酸的宿主细胞连同产生和使用这些多肽的方法。
[0005] 相关技术说明
[0006] 本发明提供具有脂肪酶活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。披露于 Glogauer (葛罗高尔）等人 Microbial Cell Factories(微生物细胞工厂）2011, 10:54 中 的脂肪酶示出与SEQ ID NO:2具有91. 8%的氨基酸序列一致性。
[0007] 发明概述
[0008] 本发明涉及选自下组的具有脂肪酶活性的分离的多肽，该组由以下各项组成：
[0009] (a)具有与SEQ ID NO:2的成熟多肽至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、 至少96 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %、或100 %序列一致性的一种多肽；
[0010] (b) -种多肽，该多肽是由一种多核苷酸编码的，该多核苷酸在低严谨度条件下、 中严谨度条件下、中-高严谨度条件下、高严谨度格条件下或非常高严谨度条件下与（i) SEQ ID NO: 1的成熟多肽编码序列、或（ii)⑴的全长补体杂交；
[0011] (C) -种多肽，该多肽是由一种多核苷酸编码的，该多核苷酸具有与SEQ ID NO: 1 的成熟多肽编码序列至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性；
[0012] (d) (a)、（b)或（C)的多肽的一种变体，该变体在一个或多个位置处包括取代、缺 失、和/或插入；以及
[0013] (e) (a)、（b)、（c)或（d)的多肽的一个片段，该片段具有脂肪酶活性。
[0014] 本发明还涉及编码本发明的多肽的分离的多核苷酸；核酸构建体；重组表达载 体；包括这些多核苷酸的重组宿主细胞；以及产生这些多肽的方法。
[0015] 本发明还涉及多种组合物、生产一种组合物的方法、清洁一个表面的方法、以及水 解一种脂质的方法。
[0016] 定义
[0017] 在详细描述本发明的组合物和方法之前，为了清楚，定义了以下术语。未定义的术 语和缩写应与如在本领域中使用的它们普通含义一致。
[0018] 脂肪酶：术语"脂肪酶（lipase、lipase enzyme) "，"脂肪分解酶"，"脂质酯酶"， "脂肪分解多肽"，和"脂肪分解蛋白"是指如由酶命名法定义的类别EC3. 1，1中的一种酶。 它可以具有脂肪酶活性，该脂肪酶活性包括但不局限于甘油三酯脂肪酶活性（EC3. 1. 1.3)、 甘油单酯脂肪酶活性（EC3. I. 1. 23)、磷脂酶活性（若干个EC)、溶血磷脂酶活性、阿魏酸酯 酶活性、角质酶活性（EC3. I. 1. 74)、留醇酯酶活性（EC3. I. 1. 13)和/或蜡-酯水解酶活性 (EC3. 1.1.50)。出于本发明的目的，根据实例中所述的程序确定脂肪酶活性。在一个方面， 本发明的变体具有SEQ ID N0:2的成熟多肽的脂肪酶活性的至少20%、例如至少25%、至 少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少 70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少100%。
[0019] 等位基因变体：术语"等位基因变体"是指占用同一染色体位点的一种基因的两个 或更多个替代形式中的任一者。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多 态性。基因突变可以是沉默的（在所编码的多肽中没有改变）或可编码具有改变的氨基酸 序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
[0020] 催化结构域：术语"催化结构域"是指一种酶的含有该酶的催化机构的区域。
[0021] CDNA :术语"CDNA"是指可以通过得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子 的反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。早先 的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤 进行加工，包括剪接。
[0022] 编码序列：术语"编码序列"是指直接指定一个多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编 码序列的边界一般由一个开放阅读框架决定，该开放阅读框架从一个起始密码子（如ATG、 GTG或TTG)开始并且以一个终止密码子（如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是一种 基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
[0023] 控制序列：术语"控制序列"是指表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的 核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是原生的（即，来自相同基 因）或外源的（即，来自不同基因），或相对于彼此是原生的或外源的。此类控制序列包括 但不局限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至 少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编 码一种多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提 供有多个接头。
[0024] 表达：术语"表达"包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不局限于，转录、转录后 修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
[0025] 表达载体：术语"表达载体"是指一种直链或环状DNA分子，该分子包括编码一种 多肽的一种多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。
[0026] 片段：术语"片段"是指在一种成熟多肽的氨基和/或羧基末端不存在一个或多 个（例如若干个）氨基酸的一种多肽；其中该片段具有脂肪酶活性。在一个方面，一个片段 含有成熟多肽的氨基酸数目的至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少 75%、至少80%、至少85%、至少90%、或至少95%。
[0027] 高严谨度条件：术语"高严谨度条件"是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而 言，遵循标准 DNA 印迹（Southern blotting)程序，在 42°C下在 5X SSPE、0.3% SDS、200 微 克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料 最终使用2X SSC、0. 2% SDS，在65°C下洗涤三次，每次15分钟。
[0028] 宿主细胞：术语"宿主细胞"是指易于用包括本发明的一种多核苷酸的一种核酸构 建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语"宿主细胞"涵盖由于复制 期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。
[0029] 分离的：术语"分离的"是指处于非天然存在的形式或环境中的物质。分离的物质 的非限制性实例包括（1)任何非天然存在的物质；(2)至少部分地从与其在自然界中相关 联的一种或多种或全部天然存在的组分中除去的任何物质，包括但不局限于任何酶、变体、 核酸、蛋白质、肽或辅因子；（3)相对于自然界中发现的那种物质通过人工手动修饰的任何 物质；或者（4)通过相对于与其天然相关联的其他组分增加该物质的量而修饰的任何物质 (例如，编码该物质的基因的多个拷贝；比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强 的启动子的使用）。一种分离的物质可以存在于发酵液样品中。
[0030] 低严谨度条件：术语"低严谨度条件"是指对于长度为至少100个核苷酸的探针 来说，遵循标准DNA印迹程序，在42°C下在5X SSPE、0. 3% SDS、200微克/毫升剪切并变性 的鲑鱼精子DNA和25%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、 0. 2% SDS，在50°C下洗涤三次，每次15分钟。
[0031] 成熟多肽：术语"成熟多肽"是指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末 端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一个方面，成熟多肽是 SEQ ID NO:2的氨基酸1至292。
[0032] 成熟多肽编码序列：术语"成熟多肽编码序列"是指编码具有脂肪酶活性的一种 成熟多肽的一种多核苷酸。在一个方面，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO: 1的核苷酸30至 905。
[0033] 中严谨度条件：术语"中严谨度条件"是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而 言，遵循标准DNA印迹程序，在42°C在5X SSPE、0. 3% SDS、200微克/ml剪切和变性的鲑精 DNA和35%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0. 2% SDS， 在55 °C下洗涤三次，每次15分钟。
[0034] 中-高严谨度条件：术语"中-高严谨度条件"是指对于长度为至少100个核苷酸 的探针来说，遵循标准DNA印迹程序，在42°C下在5X SSPE、0. 3% SDS、200微克/毫升剪切 并变性的鲑鱼精子DNA以及或者35%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终 使用2X SSC、0. 2% SDS，在60°C下洗涤三次，每次15分钟。
[0035] 核酸构建体：术语"核酸构建体"意指单链-或双链核酸分子，其分离自天然存在 的基因，或其被修饰成以本来在自然界中不存在的方式含有核酸的区段，或其为合成的，其 包含一个或多个控制序列。
[0036] 可操作地连接：术语"可操作地连接"是指一种配置，其中一个控制序列相对于一 种多核苷酸的编码序列放置在一个适当位置处，以使得控制序列指引编码序列的表达。
[0037] 序列一致性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数"序列 一致性"描述。
[0038] 出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包（EMBOSS :欧洲分子生物学开放软件套 件，Rice (赖斯）等人，2000, Trends Genet.(遗传学趋势）16:276-277)(优选 5.0.0 版 或更新版本）的Needle(尼德尔）程序中所实施的Needleman(尼德尔曼）_Wunsch(翁 施）算法（Needleman (尼德尔曼）和Wunsch (翁施），1970, J. Mol. Biol.(分子生物学 杂志）48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性。使用的这些参数是空位 开放罚分10、空位延伸罚分0. 5,以及EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版本）取代矩阵。 Needle (尼德尔）标注的"最长的一致性"的输出（使用-非简化选项获得）被用作百分比 一致性，并且如下计算：
[0039](一致的残基X IOOV (比对长度-比对中的空位总数）
[0040] 出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包（EMBOSS :欧洲分子生物学开放软件套件， Rice (赖斯）等人，2000,同上）（优选5. 0· 0版或更新版本）的Needle (尼德尔）程序中所 实施的Needleman (尼德尔曼）-Wunsch (翁施）算法（Needleman (尼德尔曼）和Wunsch (翁 施），1970,同上）来确定两个脱氧核苷酸序列之间的序列一致性。使用的这些参数是空位 开放罚分10、空位延伸罚分0. 5以及EDNAFULL(NCBI NUC4. 4的EMBOSS版本）取代矩阵。 Needle (尼德尔）标注的"最长的一致性"的输出（使用-非简化选项获得）被用作百分比 一致性，并且如下计算：
[0041] (一致的脱氧核糖核苷酸X 100V (比对长度-比对中的空位总数）
[0042] 子序列：术语"子序列"意指使一个或多个（例如，若干个）核苷酸从成熟多肽编 码序列的5'端和/或3'端缺少的多核苷酸，其中该子序列编码具有脂肪酶活性的一个片 段。在一个方面，一个片段含有编码该成熟多肽的核苷酸的数目的至少50%、至少55%、至 少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、或至少95%。 [0043] 变体：术语"变体"是指具有脂肪酶活性的、在一个或多个（例如，若干个）位置处 包含改变（即取代、插入和/或缺失）的一个多肽。取代意指占据一个位置的氨基酸替换 不同的氨基酸；缺失意指去除占据一个位置的氨基酸；并且插入意指在邻接并且紧随占据 一个位置的氨基酸之后添加一个氨基酸。
[0044] 非常高严谨度条件：术语"非常高严谨度条件"是指对于长度为至少100个核苷酸 的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42 °C下在5X SSPE、0. 3 % SDS、200微克/ml剪切并 变性的鲑鱼精子DNA和50%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0. 2% SDS，在70°C下洗涤三次，每次15分钟。
[0045] 非常低严谨度条件：术语"非常低严谨度条件"是指对于长度为至少100个核苷酸 的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42 °C下在5X SSPE、0. 3 % SDS、200微克/ml剪切并 变性的鲑鱼精子DNA和25%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0. 2% SDS，在45°C下洗涤三次，每次15分钟。
[0046] 发明详细说明
[0047] 具有脂肪酶活性的多肽
[0048] 在一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID N0:2的成熟多肽具有至少92%，例如至 少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序 列一致性的分离的多肽，这些分离的多肽具有脂肪酶活性。在一个方面，该多肽与SEQ ID N0:2 的成熟多肽相差不超过 24 个，例如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、21、22、23、或24个氨基酸。
[0049] 本发明的多肽优选地包括SEQ ID NO: 2的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组 成；或是其具有脂肪酶活性的片段。在另一个方面，该多肽包括SEQ ID N0:2的成熟多肽或 由其组成。在另一个方面中，该多肽包括SEQ ID N0:2的氨基酸1至292或由其组成。
[0050] 在另一个实施例中，本发明涉及具有脂肪酶活性的一种分离的多肽，该多肽是由 一种多核苷酸编码的，该多核苷酸在非常低严谨度条件下、低严谨度条件下、中严谨度条 件下、中-高严谨度条件下、高严谨度条件下或非常高严谨度条件下与（i)SEQ ID N0:1 的成熟多肽编码序列、或（ii) (i)的全长补体杂交（Sambrook(萨拉布鲁克）等人，1989， Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册），第二版，Cold Spring Harbor (冷泉港），纽约）。
[0051] SEQ ID NO: 1的多核苷酸或其子序列，连同SEQ ID NO:2的多肽或其片段可根据 本领域熟知的方法用于设计核酸探针以鉴定和克隆来自不同属或种的株系的、编码具有脂 肪酶活性的多肽的DNA。具体而言，可以根据标准DNA印迹程序，使用这类探针与感兴趣的 细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴别和分离其中的对应基因。这类探针可以明显短于 完整序列，但是长度应为至少15,例如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，该核 酸探针的长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至 少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核 苷酸、或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针都可使用。典型地将探针进行标记（例如，用 3午、3!1、355、生物素、或抗生物素蛋白），以检测相应的基因。本发明涵盖此类探针。
[0052] 可以针对与以上描述的探针杂交并且编码出具有脂肪酶活性的多肽的DNA对从 这类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA库进行筛选。来自这类其他菌株的基因组DNA或 其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其他分离技术来分离。来自文库的DNA 或分离的DNA可转移到并固定在硝酸纤维素或其他适合的载体材料上。为了鉴别与SEQ ID NO: 1或其子序列杂交的克隆或DNA，将载体材料用于DNA印迹中。
[0053] 出于本发明的目的，杂交表明多核苷酸在非常低到非常高严谨度条件下与一种被 标记的核酸探针杂交，该探针对应于（i) SEQ ID NO: l;(ii) SEQ ID NO: 1的成熟多肽编码序 列；（iii)其全长互补体；或（V)其子序列。可以使用例如X-射线胶片或本领域已知的任 何其他检测手段来检测在这些条件下该核酸探针所杂交的分子。
[0054] 在另一个实施例中，本发明还涉及具有脂肪酶活性的分离的多肽，该多肽是由一 种多核苷酸编码的，该多核苷酸具有与SEQ ID NO: 1的成熟多肽编码序列至少96%、至少 97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性。
[0055] 在另一个实施例中，本发明涉及在一个或多个（例如，若干个）位置处包括取代、 缺失、和/或插入的SEQ ID N0:2的成熟多肽的变体。在另一个实施例中，本发明涉及在一 个或多个（例如，若干个）位置处包括取代、缺失、和/或插入的本发明的多肽的变体。在 一个实施例中，引入SEQ ID N0:2的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目不超 过 24,例如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、或24个。 这些氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守 氨基酸取代或插入；典型地1-30个氨基酸的较小缺失；较小的氨基-或羧基-末端延伸，如 氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的较小接头肽；或便于通过改变净电荷或另 一种功能来纯化的较小延伸，如聚组氨酸段（tract)、抗原表位或结合结构域。
[0056] 保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸及组氨酸）、酸 性氨基酸（谷氨酸和天冬氨酸）、极性氨基酸（谷氨酰胺和天冬酰胺）、疏水性氨基酸（亮 氨酸、异亮氨酸及缬氨酸）、芳香族氨基酸（苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸）及小氨基酸（甘氨 酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸）。一般不会改变特异性活性的氨基酸取代是本领域 已知的并且例如由H. Neurath (诺伊拉特）和R. L. Hill (希尔），1979在The Proteins (蛋 白质），Academic Press (学术出版社），纽约中描述。常见取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/ Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、 Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和 Asp/Gly〇
[0057] 可替代地，氨基酸改变具有这样一种性质：改变多肽的物理化学特性。例如，氨基 酸改变可以提高多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH，等等。
[0058] 可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变（Cunningham(坎 宁汉）和Wells (威尔斯），1989, Science (科学）244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨 基酸。在后一种技术中，在分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且测试所得突变分 子的脂肪酶活性以鉴别对分子的活性关键的氨基酸残基。还参见，Hilton(希尔顿）等人， 1996, J. Biol. Chem.(生物化学杂志）271:4699-4708。也可结合假定接触位点氨基酸的突 变，如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记进行确定的对结构进 行物理学分析，从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。参见，例如，de Vos(德弗 斯）等人，1992, Science(科学）255:306-312 ;Smith(史密斯）等人，1992, J. Mol. Biol. (分子生物学杂志）224:899-904 ;Wlodaver (乌乐达维尔）等人，1992, FEBS Lett.(欧洲生 化学会联合会快报）309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断鉴别必需氨基酸。可以 做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用诱变、重组和/或改组的已知方法进 行测试，随后进行相关筛选程序，如由Reidhaar (里德哈尔）-Olson (奥尔森）和Sauer (萨 奥尔），1988，Science (科学）241:53-57 ;Bowie (博维）和 Sauer (萨奥尔），1989，Proc. NatLAcad Sci. USA (美国国家科学院院刊）86:2152-2156 ;W0 95/17413 ;或 WO 95/22625 披露的那些。其他可以使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示（例如Lowman(洛曼）等人， 1991，Biochemistry (生物化学）30:10832-10837 ;US 5223409 ;W0 92/06204)以及区域定 向诱变（Derbyshire (德比什尔）等人，1986, Gene (基因）46:145 ;Ner (内尔）等人，1988， DNA 7:127)。
[0059] 可以结合诱变/改组方法与高通量自动化筛选方法来检测由宿主细胞表达的克 隆的、诱变的多肽的活性（Ness(内斯）等人，1999, Nature Biotechnology(自然生物技 术）17:893-896)。编码活性多肽的诱变的DNA分子可以回收自宿主细胞，并且使用本领域 的标准方法对其进行迅速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。
[0060] 该多肽可以是一种杂合多肽，其中一种多肽的一个区域在另一种多肽的一个区域 的N-末端或C-末端处融合。
[0061] 该多肽可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽 的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一多肽的多核苷酸融合到本发明的多核苷 酸而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，并包括连接编码多肽 的编码序列，这样使得它们在框内并且使得融合多肽的表达处于相同的一个或多个启动 子和终止子的控制下。融合多肽还可以使用内蛋白技术来构建，其中融合多肽在翻译后 产生（Cooper(库珀）等人，1993, EMBO J.(欧洲分子生物学学会杂志）12:2575-2583 ; Dawson (道森）等人，1994, Science (科学）266:776-779)。
[0062] 融合多肽可以在两个多肽之间进一步包括一个切割位点。在融合蛋白分泌之 时，该位点被切割，从而释放出这两个多肽。裂解位点的实例包括但不局限于在以下各 项中披露的位点：Martin (马丁）等人，2003，J. Ind. Microbiol. Biotechnol.(工业微 生物与生物技术杂志）3:568-576 ;Svetina(斯韦蒂纳）等人，2000, J. Biotechnol.(生 物技术杂志）76:245-251 ;Rasmussen(拉斯马森）_Wilson(威尔逊）等人，1997, Appl. Environ. Microbiol.(应用与环境微生物学）63:3488-3493 ;Ward (沃德）等人，1995， Biotechnology (生物技术）13:498-503 ;以及 Contreras (孔特雷拉斯）等人，1991， Biotechnology (生物技术）9:378-381 ;Eaton(伊顿）等人，1986，Biochemistry (生物 化学）25:505-512 ;ColIins (柯林斯）-Racie (瑞思）等人，1995，Biotechnology (生 物技术）13:982-987 ;Carter(卡特）等人，1989，Proteins: Structure，Function，and Genetics(蛋白质：结构、功能与遗传）6:240-248 ;以及Stevens(史蒂文斯），2003, Drug Discovery World(药物发现的世界）4:35-48。
[0063] 具有脂肪酶活性多肽的来源
[0064] 本发明的具有脂肪酶活性的多肽可以从任何属的微生物获得。出于本发明的目 的，如在此结合一种给定的来源使用的术语"从...中获得"应是指由多核苷酸编码的多肽 是由该来源或者由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的一种菌株产生的。在一个方面， 获得自给定来源的多肽被分泌到细胞外。
[0065] 该多肽可以是细菌多肽。例如，该多肽可以是一种革兰氏阳性细菌多肽， 如具有脂肪酶活性的芽孢杆菌属（Bacillus)、梭菌属（Clostridium)、肠球菌属 (Enterococcus)、土芽抱杆菌属（Geobacillus)、乳酸杆菌属属（Lactobacillus)、乳球菌 属（Lactococcus)、海洋芽抱杆菌属（Oceanobacillus)、葡萄球菌属（Staphylococcus)、 链球菌属（Streptococcus)、或链霉菌属（Streptomyces)多肽；或一种革兰氏阴性细 菌多肽，如弯曲杆菌属（Campylobacter)、西地西菌属（Cedecea)、大肠杆菌（E. coli)、 黄杆菌属（Flavobacterium)(例如约氏黄杆菌（Flavobacterium johnsoniae))、梭杆 菌属（Fusobacterium)、螺旋杆菌属（Helicobacter)、泥杆菌属（Ilyobacter)、奈瑟氏 菌属（Neisseria)、假单胞菌属（Pseudomonas)、沙门氏菌属（Salmonella)、沙雷氏菌属 (Serratia)或脲原体属（Ureaplasma)多肽。
[0066] 在一个方面，该多肽是嗜碱芽孢杆菌（Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢 杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)、短芽抱杆菌（Bacillus brevis)、环状芽抱杆菌 (Bacillus circulans)、克劳氏芽抱杆菌（Bacillus clausii)、凝结芽抱杆菌（Bacillus coagulans)、坚强芽抱杆菌（Bacillus firmus)、灿烂芽抱杆菌（Bacillus lautus)、迟 缓芽抱杆菌（Bacillus lentus)、地衣芽抱杆菌（Bacillus licheniformis)、巨大芽抱 杆菌（Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌 (Bacillus stearothermophilus)、枯草芽抱杆菌（Bacillus subtilis)、或苏云金芽抱杆 菌（Bacillus thuringiensis)多月太。
[0067] 在另一个方面，该多肽是似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌、或马链球菌兽瘟 亚种多肽。
[0068] 在另一个方面，该多肽是不产色链霉菌、阿维链霉菌、天蓝色链霉菌、灰色链丝菌、 或变铅青链霉菌多肽。
[0069] 在另一个方面，该多肽是一种戴氏西地西菌、拉氏西地西菌、西地西菌sp 001 (也 称为西地西菌物种3)、奈氏西地西菌（以前称为西地西菌物种4或西地西菌物种002)、西 地西菌sp 012 (也称为西地西菌物种5)、或西地西菌sp-16640多肽。
[0070] 在另一个方面，该多肽是一种嗜虫沙雷氏菌（Serratia entomophila)、无花 果沙雷氏菌（Serratia ficaria)、居泉沙雷氏菌（Serratia fonticola)、格氏沙雷氏 菌（Serratia grimesii)、液化沙雷氏菌（Serratia liquefaciens)、粘质沙雷氏菌 (Serratia marcescens)、气味沙雷氏菌（Serratia odorifera)、普城沙雷氏菌（Serratia plymuthica)、变形班沙雷氏菌（Serratia proteamaculans)、食奎尼酸沙雷氏菌 (Serratia quinivorans)、深红沙雷氏菌（Serratia rubidaea)、共生沙雷氏菌（Serratia symbiotica)多肤。
[0071] 该多肽可以是一种真菌多肽。例如，该多肽可以是酵母多肽，例如假丝酵 母属（Candida)、克鲁维酵母属（Kluyveromyces)、毕赤酵母属（Pichia)、酵母菌属 (Saccharomyces)、裂殖酵母属（Schizosaccharomyces)、或耶氏酵母属（Yarrowia) 多肽；或丝状真菌多肽，例如枝顶孢霉属（Acremonium)、伞菌属（Agaricus)、链格孢 属（Alternaria)、曲霉属（Aspergillus)、短梗霉属（Aureobasidium)、葡萄座腔菌 属（Botryospaeria)、拟錯菌属（〇61'1。〇1'；!_〇^818)、毛_壳属（Chaetomidium)、金抱子 菌属（Chrysosporium)、麦角菌属（Claviceps)、旋抱腔菌属（Cochliobolus)、鬼伞 属（Coprinopsis)、乳白蚁属（Coptotermes)、棒囊壳属（Corynascus)、隐丛赤壳菌属 (Cryphonectria)、隐球菌属（Cryptococcus)、色二抱属（Diplodia)、黑耳属（Exidia)、 线黑粉酵母属（Filibasidium)、镰刀菌属（Fusarium)、赤霉属（Gibberella)、全鞭毛虫 属（Holomastigotoides)、腐质霉属（Humicola)、耙齿菌属（Irpex)、蘑燕属（Lentinula)、 小腔球菌属（Leptospaeria)、梨抱菌属（Magnaporthe)、黑果菌属（Melanocarpus)、 多孔菌属（Meripilus)、毛霉属（Mucor)、毁丝霉属（Myceliophthora)、新美鞭菌 属（Neocallimastix)、脉抱菌属（Neurospora)、拟青霉属（Paecilomyces)、青霉菌 属（Penicillium)、平革菌属（Phanerochaete)、瘤胃壶菌属（Piromyces)、某真菌属 (Poitrasia)、假黑盘菌属（Pseudoplectania)、假披发虫属（Pseudotrichonympha)、 根毛霉菌属（Rhizomucor)、裂糟菌属（SchizophylIum)、柱顶孢属（Scytalidium)^I 节菌属（Talaromyces)、嗜热子囊菌属（Thermoascus)、梭孢壳霉属（Thielavia)、弯颈 霉属（Tolypocladium)、木霉属（Trichoderma)、长毛盘菌属（Trichophaea)、轮枝孢属 (Verticillium)、小包脚燕属（Volvariella)或炭角菌属（Xylaria)多肽。
[0072] 在另一个方面，该多肽是卡氏酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉斯酵母、克鲁维酵 母、诺地酶母、或卵形酵母多肽。
[0073] 在另一个方面，该多肽是解纤维枝顶孢霉（Acremonium cellulolyticus)、棘孢曲 霉（Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉（Aspergillus awamori)、臭曲霉（Aspergillus foetidus)、烟曲霉（Aspergillus fumigatus)、日本曲霉（Aspergillus japonicus)、构 巢曲霉（Aspergillus nidulans)、黑曲霉（Aspergillus niger)、米曲霉（Aspergillus oryzae)、狭边金孢子菌（Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌（Chrysosporium keratinophilum)、卢克诺文思金孢子菌（Chrysosporium Iucknowense)、莫达瑞姆金孢 子菌（Chrysosporium merdarium)、租金抱子菌（Chrysosporium pannicola)、昆士兰金 抱子菌（Chrysosporium queenslandicum)、热带金抱子菌（Chrysosporium tropicum)、 带纹金抱子菌（Chrysosporium zonatum)、杆抱状嫌抱（Fusarium bactridioides)、 谷类嫌抱（Fusarium cerealis)、库威嫌抱（Fusarium crookwellense)、大刀嫌 抱（Fusarium culmorum)、禾谷嫌抱(Fusarium graminearum)、禾赤嫌抱（Fusarium graminum)、异抱嫌抱（Fusarium heterosporum)、合欢木嫌抱（Fusarium negundi)、尖 嫌抱（Fusarium oxysporum)、多枝嫌抱（Fusarium reticulatum)、粉红嫌抱（Fusarium roseum)、接骨木嫌抱（Fusarium sambucinum)、肤色嫌抱（Fusarium sarcochroum)、拟 分枝抱嫌抱（Fusarium sporotrichioides)、硫色嫌抱（Fusarium sulphureum)、圆嫌抱 (Fusarium torulosum)、拟丝抱嫌抱（Fusarium trichothecioides)、壤片嫌抱（Fusarium venenatum)、灰腐质霉（Humicola grisea)、特异腐质霉（Humicola insolens)、柔毛腐质 霉（Humicola lanuginosa)、白奉巴齿菌（Irpex Iacteus)、米黑毛霉（Mucor miehei)、嗜 热毁丝霉（Myceliophthora thermophila)、粗糖链抱菌（Neurospora crassa)、绳状青 霉菌（Penicillium funiculosum)、产紫青霉菌（Penicillium purpurogenum)、黄抱原 毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium)、无色梭抱壳霉（Thielavia achromatica)、 阿波梭抱壳菌（Thielavia albomyces)、白毛梭抱壳霉（Thielavia albopilosa)、澳洲 梭抱壳霉（Thielavia australeinsis)、菲美蒂梭抱壳菌（Thielavia fimeti)、小抱梭 孢壳霉（Thielavia microspora)、卵孢梭孢壳霉（Thielavia ovispora)、秘鲁梭孢壳霉 (Thielavia peruviana)、毛梭抱壳霉（Thielavia setosa)、瘤抱梭抱壳霉（Thielavia spededonium)、耐热梭抱壳（Thielavia subthermophila)、土生梭抱壳霉（Thielavia terrestris)、哈茨木霉（Trichoderma harzianum)、康宁木霉（Trichoderma koningii)、长 枝木霉（Trichoderma Iongibrachiatum)、里氏木霉（Trichoderma reesei)、或绿色木霉 (Trichoderma viride)多月太。
[0074] 将理解的是，对于以上提到的物种而言，本发明涵盖完全状态和不完全状态 (perfect and imperfect states)二者、以及其他分类学等效物，例如无性型，而不管它们 已知的物种名称是什么。本领域的普通技术人员将容易地识别适当等效物的身份。
[0075] 这些物种的株系可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如ATCC(美 国典型培养物保藏中心）、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen 611113!1，03]\12(德国微生物菌种保藏中心）、〇6111:四31131^6311￥〇〇13(311；[111111610_111：1^68,033(荷 兰菌种保藏中心）、以及NRRL (美国农业研究菌种保藏中心北方地区研究中心）。
[0076] 可以使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界（例如，土壤、堆肥、水等等） 分离的微生物或直接从自然材料（例如，土壤、堆肥、水等等）获得的DNA样品鉴定和获得 该多肽。用于从自然生活环境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可以 通过类似地筛选另一微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码该多 肽的多核苷酸。一旦用一种或多种探针检测到编码多肽的多核苷酸，就可以通过使用本领 域普通技术人员已知的技术分离或克隆该多核苷酸（参见例如，Sambrook (萨姆布鲁克）等 人，1989,同上）。
[0077] 多核苷酸
[0078] 本发明还涉及编码本发明的多肽的分离的多核苷酸，如在此所述。
[0079] 用于分离或克隆多核苷酸的技术是本领域中已知的并且包括从基因组DNA或 cDNA，或其组合进行分离。来自基因组DNA的多核苷酸的克隆可以例如通过使用众所周知 的聚合酶链反应（PCR)或用以对具有共有的结构特征的克隆的DNA片段进行检测的表达库 抗体筛选来实现。参见例如，Innis (伊尼斯）等人，1990，PCR:A Guide to Methods and Application (PCR :方法和应用指南），学术出版社，纽约。可以使用其他核酸扩增程序例如 连接酶链式反应（LCR)、连接激活转录（LAT)和基于多核苷酸的扩增（NASBA)。这些多核苷 酸可以由西地西菌属菌株或相关有机体克隆，并且因此，例如可以是该多核苷酸的多肽编 码区的等位基因或种类变体。
[0080] 编码本发明多肽的多核苷酸的修饰对于合成实质上类似于该多肽的多肽可以是 必需的。术语"基本上类似于"该多肽是指该多肽的非天然发生的形式。这些多肽可能以 某种工程化方式而不同于从其天然来源分离的多肽，例如在比活性、热稳定性、PH最佳值等 方面不同的变体。这些变体可以基于以SEQ ID N0:1的成熟多肽编码序列（例如其子序 列）形式呈现的多核苷酸，和/或通过引入不会改变该多肽的氨基酸序列，但对应于预定用 于产生该酶的宿主有机体的密码子使用的核苷酸取代，或通过引入可能产生不同氨基酸序 列的核苷酸取代来构建。对于核苷酸取代的一般描述，参见例如Ford(福德）等人，1991， Protein Expression and Purification(蛋白表达与纯化）2:95_107。
[0081] 核酸构建体
[0082] 本发明还涉及核酸构建体，这些核酸构建体包括可操作地连接至一个或多个控制 序列的本发明的多核苷酸，在与控制序列相容的条件下，这些控制序列指导编码序列在合 适的宿主细胞中的表达。
[0083] 可以按多种方式操纵多核苷酸，以提供多肽的表达。取决于表达载体，在其插入载 体以前操纵多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术 是本领域熟知的。
[0084] 该控制序列可以是一个启动子，即，被宿主细胞识别以对编码本发明多肽的多核 苷酸进行表达的一种多核苷酸。该启动子包含转录控制序列，这些序列介导了该多肽的表 达。该启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型及 杂合型启动子，并且可以是由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因 获得。
[0085] 用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的实例 是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因（amyQ)、地衣芽孢杆 菌α-淀粉酶基因（amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因（penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽 糖淀粉酶基因（amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因（sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和 xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryllIA基因 （Agaisse (阿盖塞）和Lereclus (勒尔克吕）， 1994，Molecular Microbiology (分子微生物学）13:97-107)、大肠杆菌 Iac 操纵子、大 肠杆菌trc启动子（Egon(埃贡）等人，1988, Gene(基因）69:301-315)、天蓝色链霉菌 琼脂水解酶基因（dagA)、以及原核β-内酰胺酶基因（Villa(维拉）_Kamaroff (卡马 洛夫）等人，1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (美国国家科学院院刊）75:3727-3731)、以 及tac启动子（DeBoer (德波尔）等人，1983，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(美国国家科学 院院刊）80:21-25)。其他启动子描述在Gilbert (吉尔伯特）等人，1980, Scientific American (科学美国人）242:74-94 的"Useful proteins from recombinant bacteria (来 自重组细菌的有用蛋白质以及在Sambrook(萨姆布鲁克）等人，1989,同上中。串联启 动子的实例披露于WO 99/43835中。
[0086] 用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的合适启动子的实 例是从以下各项的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲 霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶（glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲 霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶（WO 96/00787)、镶片 镰孢淀粉葡糖苷酶（W0 00/56900)、镶片镰孢Daria(W0 00/56900)、镶片镰孢Quinn(W) 00/56900)、米黑根毛霉（Rhizomucor miehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏 木霉β -葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内 切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚 糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉 木糖苷酶，以及NA2_tpi启动子（一种修饰的启动子，其来自曲霉属中性α-淀粉酶基 因，其中未翻译的前导序列由曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代；非限 制性实例包括修饰的启动子，其来自黑曲霉中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序 列由构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代）；以及其突变型启 动子、截短型启动子、以及杂合型启动子。
[0087] 在酵母宿主中，有用的启动子从以下的基因获得：酿酒酵母烯醇酶（ΕΝ0-1)、酿酒 酵母半乳糖激酶（GALl)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶（ADHUADH2/GAP)、酿 酒酵母丙糖磷酸异构酶（TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白（CUPl)、以及和酿酒酵母3-磷酸甘油 酸激酶。Romanos (罗马诺斯）等人，1992, Yeast (酵母）8:423-488描述了酵母宿主细胞的 其他有用的启动子。
[0088] 控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的一种转录终止子。该终止子可操 作地连接到编码该多肽的多核苷酸的3' -末端。在该宿主细胞中起作用的任何终止子都可 以用于本发明中。
[0089] 用于细菌宿主细胞的优选终止子是从克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶（aprH)、地衣芽 孢杆菌α-淀粉酶（amyL)、以及大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)的基因获得。
[0090] 丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基 苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α -葡萄糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖孢镰刀 菌胰蛋白酶样蛋白酶。
[0091] 用于酵母宿主细胞的优选终止子从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶、酿酒 酵母细胞色素 C (CYCl)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。用于酵母宿主细胞的其他有 用的终止子由罗马努斯等人，1992,见上文描述。
[0092] 控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区，其增加 该基因的表达。
[0093] 适用的mRNA稳定子区的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因（W0 94/25612)和枯草芽抱杆菌SP82 基因 （Hue (化）等人，1995，Journal of Bacteriology (细 菌学杂志）177:3465-3471)。
[0094] 该控制序列还可以是一个前导子，一种对宿主细胞翻译很重要的非翻译mRNA区 域。该前导序列可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的5'-末端。可以使用在宿主细胞 中具有功能的任何前导子。
[0095] 用于丝状真菌宿主细胞的优选前导子是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷 酸异构酶的基因获得。
[0096] 适用于酵母宿主细胞的前导子从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶 (EN0-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、以及酿酒酵母醇脱氢酶/甘油 醛-3-磷酸脱氢酶（ADH2/GAP)。
[0097] 控制序列还可以是一种聚腺苷酸化序列，可操作地连接至该多核苷酸的3' -末端 并且当转录时由宿主细胞识别为将聚腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。在 宿主细胞中起作用的任何聚腺苷酸化序列都可以使用。
[0098] 用于丝状真菌宿主细胞的优选聚腺苷酸化序列是从以下各项的基因获得：构巢曲 霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α -葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、以及 尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
[0099] 针对酵母宿主细胞的有用多腺苷酸化序列在Guo(郭）和Sherman(谢尔曼）， 1995, Mol. Cellular Biol.(分子和细胞生物学）15:5983-5990中有过描述。
[0100] 控制序列也可以是编码与多肽的N-端连接并指导多肽进入细胞的分泌通路的信 号肽的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5' -末端可以固有地包括在翻译阅读框架 中与编码多肽的编码序列的区段天然地连接的一个信号肽编码序列。可替代地，编码序列 5末端可以包括对于该编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信 号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可 简单地替换天然的信号肽编码序列以便增强该多肽的分泌。然而，指导所表达的多肽进入 宿主细胞的分泌路径中的任何信号肽编码序列都可以使用。
[0101] 用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因获得的信号肽编 码序列：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣 芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶 (nprT、nprS、nprM)、以及枯草芽孢杆菌prsA。Simonen (西蒙纳）和Palva (帕尔瓦），1993, Microbiological Reviews (微生物学评论）57:109-137描述了另外的信号肽。
[0102] 用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是获得自以下项的基因的信 号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质 霉（Humicola insolens)纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉（Humicola lanuginosa)脂肪酶、以及米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
[0103] 对于酵母宿主细胞有用的信号肽获得自以下项的基因：酿酒酵母α-因子和酿酒 酵母转化酶。上文的罗马诺斯等人（1992)描述了其他有用的信号肽编码序列。
[0104] 该控制序列还可以是编码位于多肽的N-末端处的前肽的一个前肽编码序 列。生成的多肽被称为前体酶（proenzyme)或多肽原（或者在一些情况下被称为酶原 (zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过从该多肽原上催化切割或自动催化切割 前肽而被转化成一种活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因获得：枯草芽孢杆菌 碱性蛋白酶（aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶（nprT)、嗜热毁丝霉漆酶（W0 95/33836)、米 黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α因子。
[0105] 在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻多肽的 N-末端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N-末端。
[0106] 还可以希望添加调节序列，这些调节序列相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表 达。调节系统的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括 调节化合物的存在。原核系统中的调节序列包括lac、tac、以及trp操纵子系统。在酵母 中，可以使用ADH2系统或GALl系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、 米曲霉TAKA α -淀粉酶启动子、以及米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其他实例是允 许基因扩增的那些。在真核系统中，这些调节序列包括在氨甲蝶呤存在下被扩增的二氢叶 酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该多肽的多核苷 酸将与调节序列可操作地连接。
[0107] 表达载体
[0108] 本发明还涉及包括本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组 表达载体。不同的核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生一个重组表达载体，这一重组 表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处插入或取代编码 该变体的多核苷酸。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包括该多核苷酸的核 酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生该表达载体时，该编码序列是位于该 载体中，这样使得该编码序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。
[0109] 重组表达载体可以是任何载体（例如，质粒或病毒），其能够方便地进行重组DNA 程序，并且能够引起多核苷酸的表达。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载 体的宿主细胞的相容性。该载体可以是一种线性的或闭合的环状质粒。
[0110] 载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色 体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体、或人工染色体。该载体可以包含用于确保自 我复制的任何装置。可替代地，该载体可以是这样一种载体，当它被引入该宿主细胞中时， 被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用 单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒（这些载体或质粒共同包含有待引入到宿主 细胞的基因组中的总DNA)或转座子。
[0111] 该载体优选包含允许容易选择转化细胞、转染细胞、转导细胞或类似细胞的一个 或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗 性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型、等。
[0112] 细菌选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因、或赋予抗生素 抗性（例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素、或四环素抗性）的标记。用 于酵母宿主细胞的适合的标记包括但不局限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及 URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包含但不局限于amdS(乙酰胺酶）、 argB (鸟氨酸氨甲酰基转移酶）、bar (草胺膦乙酰转移酶）、hph (潮霉素磷酸转移酶）、 niaD(硝酸还原酶）、pyrG(乳清苷-5' -磷酸脱羧酶）、sC(硫酸腺苷基转移酶）、以及 trpC(邻氨基苯甲酸合酶）、连同其等效物。优选在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉或米曲 霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus) bar基因。
[0113] 载体优选含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因 组自主复制的一个或多个元件。
[0114] 对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或 者通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体 可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一 个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，这些整合 的元件应包含足够数量的核酸，例如100至10, 〇〇〇个碱基对、400至10, 000个碱基对、以 及800至10, 000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源 重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此 夕卜，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一个方面，该载体可以通过非 同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
[0115] 对于自主复制，载体可以进一步包含使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复 制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语 "复制起点"或"质粒复制子"意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
[0116] 细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、 以及PACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、以 及ρΑΜβ 1的复制起点。
[0117] 用于在酵母宿主细胞中使用的复制起点的实例是2微米复制起点ARS1、ARS4、 ARSl与CEN3的组合、以及ARS4与CEN6的组合。
[0118] 有用于丝状真菌细胞的复制起点的实例是AMAl和ANSI (Gems (格姆斯）等人， 1991，Gene (基因）98:61-67 ;CulIen (卡伦）等人，1987，Nucleic Acids Res.(核酸研 究）15:9163-9175 ;W0 00/24883)。根据WO 00/24883中披露的方法可以实现AMAl基因的 分离和包含该基因的质粒或载体的构建。
[0119] 可以将本发明的多核苷酸的多于一个的拷贝插入到宿主细胞中以增加多肽的产 生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包含一个与该多 核苷酸的可扩增的选择性标记基因可以获得增加的多核苷酸拷贝数目，其中通过在适当选 择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由 此该多核苷酸的另外的拷贝。
[0120] 用于连接以上所描述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普 通技术人员熟知的（参见，例如，萨姆布鲁克等人，1989,同上文）。
[0121] 宿主细胞
[0122] 本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包括本发明的多核苷酸，该多核 苷酸可操作地连接至一个或多个控制序列，该一个或多个控制序列指导本发明的多肽的产 生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入到宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持 作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所描述。术语"宿主细胞"涵盖 由于复制期间发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大 程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。
[0123] 该宿主细胞可以是有用于重组产生本发明的多肽的任何细胞，例如原核细胞或真 核细胞。
[0124] 原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但 不局限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆 菌属、葡萄球菌属、链球菌属、以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不局限于：弯曲杆菌 属、西地西菌属、大肠杆菌、黄杆菌菌、梭杆菌菌、螺旋杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单 胞菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、以及脲原体属。
[0125] 细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌细胞，包括但不局限于：嗜碱芽孢杆菌、解淀粉 芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿 烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆 菌、枯草芽孢杆菌、以及苏云金芽孢杆菌细胞。
[0126] 细菌宿主细胞还可以是任何链球菌细胞，包括但不局限于：似马链球菌、酿脓链球 菌、乳房链球菌、以及马链球菌兽瘟亚种细胞。
[0127] 细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不局限于：不产色链霉菌、阿维 链霉菌、天蓝色链霉菌、灰色链霉菌以及变铅青链霉菌细胞。
[0128] 细菌宿主细胞还可以是任何西地西菌属细胞，包括但不局限于戴氏西地西菌、拉 氏西地西菌、西地西菌sp 001 (也称为西地西菌物种3)、奈氏西地西菌（以前称为西地西 菌物种4或西地西菌物种002)、西地西菌sp 012 (也称为西地西菌物种5)、或西地西菌 sp-16640 多肤。
[0129] 细菌宿主细胞还可以是任何沙雷氏菌细胞，包括但不局限于嗜虫沙雷氏菌、无花 果沙雷氏菌、居泉沙雷氏菌、格氏沙雷氏菌、液化沙雷氏菌、粘质沙雷氏菌、气味沙雷氏菌、 普城沙雷氏菌、变形班沙雷氏菌、食奎尼酸沙雷氏菌、深红沙雷氏菌、共生沙雷氏菌多肽。
[0130] 将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化（参见 例如，Chang(张）和Cohen(科恩），1979，Mol. Gen. Genet.(分子遗传学与基因组 学）168:111-115)、感受态细胞转化（参见，例如，Young(杨格）和Spizizen(斯 皮宰曾），1961，J.Bacteriol.(细菌学杂志）81:823-829 ;或 Dubnau(杜拜努）以 及Davidoff-Abelson(大卫杜夫-阿贝尔森），1971，J. Mol. Biol.(分子生物学杂 志）56:209-221)、电穿孔（参见，例如，Shigekawa(茂川）和 Dower(道尔），1988， Biotechniques (生物技术）6:742-751)、或者接合（参见，例如Koehler (克勒）和 Thorne(Thorne)，1987, J.Bacteriol.(细菌学杂志）169:5271-5278)。将 DNA 引入大肠 杆菌细胞中可通过以下来实现：原生质体转化（参见例如，Hanahan(哈纳汗），1983, J. Mol. Biol.(分子生物学杂志）166:557-580)或电穿孔（参见例如，Dower (道尔）等人， 1988, Nucleic Acids Res.(核酸研究）16:6127-6145)。可以通过原生质体转化、电穿孔 (参见，例如，Gong (贡）等人，2004, Folia Microbiol.(叶线形微生物学（Praha (普拉 哈）））49:399-405)、共轭（例如，Mazodier (马佐迪耶）等人，1989，J. Bacteriol.(细菌 学杂志）171:3583-3585)、或者转导（参见，例如，Burke (伯克）等人，2001，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (美国国家科学院院刊）98:6289-6294)实现DNA到链霉菌细胞中的引入。可 以通过电穿孔（参见，例如，Choi(蔡）等人，2006, J.Microbiol.Methods(微生物学方法 杂志）64:391-397)、或者共轭（例如，Pinedo(皮内多）和Smets(斯梅茨），2005, Appl. Environ. Microbiol.(应用与环境微生物学）71:51-57)实现DNA到假单孢菌细胞中的引 入。可以通过如下方式实现将DNA引入链球菌细胞中：天然感受态（参见例如，Perry (佩 里）和Kuramitsu (藏满），1981, Infect. Immun.(传染与免疫）32:1295-1297)、原生质体 转化（例如，Catt (卡特）和 Jollick (约里克），1991，Microbios (微生物）68:189-207)、 电穿孔（参见，例如，Buckley (布克莱）等人，1999, Appl. Environ. Microbiol.(应用与环 境微生物学）65:3800-3804)、或接合（参见，例如，Clewell (克莱怀尔），1981，Microbiol. Rev.(微生物学综述）45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的用于将DNA引入宿主细 胞中的任何方法。
[0131] 宿主细胞还可以是真核细胞，如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。
[0132] 宿主细胞可以是真菌细胞。如在此所用的"真菌"包括子囊菌门（Ascomycota)、 担子菌门（Basidiomycota)、壶菌门（Chytridiomycota)、以及接合菌门（Zygomycota)、连 同卵菌门（Oomycota)和全部有丝分裂孢子真菌（如由Hawksworth(霍克斯沃思）等人在 Ainsworth and Bisby' s Dictionary of The Fungi (安斯沃思和拜斯比真菌词典），第 8版，1995，CAB International (国际应用生物科学中心），University Press (大学出版 社），Cambridge (剑桥），英国中进行定义的）。
[0133] 该真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如在此所用的"酵母"包括产子嚢酵母（内孢 霉目）、产担子酵母和属于半知菌类（芽孢纲）的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变， 因此出于本发明的目的，酵母应如Biology and Activities of Yeast (酵母的生物学和活 性）（Skinner (斯金纳）、Passmore (帕斯莫尔）、以及Davenport (达文波特）编辑，5〇〇· App. Bacteriol. Symposium Series No. 9 (应用细菌学学会讨论会系列号9)，1980)中所描 述来定义。
[0134] 酵母宿主细胞可以是假丝酵母（Candida)、汉逊酵母（Hansenula)、克 鲁维酵母（Kluyveromyces)、毕赤酵母（Pichia)、酵母属（Saccharomyces)、裂殖 酵母（Schizosaccharomyces)、或耶氏酵母（Yarrowia)细胞，如乳酸克鲁维酵母 (Kluyveromyces Iactis)、卡氏酵母（Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母、糖化 酵母（Saccharomyces diastaticus)、道格拉斯酵母（Saccharomyces douglasii)、克鲁 维酵母（Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母（Saccharomyces norbensis)、卵形酵母 (Saccharomyces oviformis)、或解脂耶氏酵母（Yarrowia Iipolytica)细胞。
[0135] 真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。"丝状真菌"包括真菌门（Eumycota)和卵菌 门的亚门（如由霍克斯沃思等人，1995,见上文所定义）的所有丝状形式。丝状真菌通常 的特征在于由壳多糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体 壁。营养生长是通过菌丝延长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母（如酿酒酵母）的 营养生长是通过单细胞菌体的出芽（budding)，而碳分解代谢可以是发酵的。
[0136] 丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管菌属、拟蜡菌属、金 孢子菌属、鬼伞菌属、革盖菌属、隐球菌属、线黑粉酵母属（FiIibasidium)、镰刀菌属、腐质 霉属、稻瘟菌属、毛霉菌属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌 属、白腐菌属、瘤胃壶菌属、侧耳属、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳菌属、弯颈 霉属、检囷属、或木霉属的细胞。
[0137] 例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢 曲霉、黑曲霉、米曲霉、烟管菌、干拟錯菌、卡内基拟錯菌（Ceriporiopsiscaregiea)、 浅黄拟錯孔菌、潘诺希塔拟錯菌（Ceriporiopsispannocinta)、环带拟錯 菌（Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟錯菌（Ceriporiopsissubrufa)、虫拟錯 菌、狭边金孢子菌（Chrysosporiuminops)、嗜角质金孢子菌、拉克悼金孢子菌 (Chrysosporiumlucknowense)、奠状金抱子菌（Chrysosporiummerdarium)、租金抱子菌、女 王杜香金孢子菌（Chrysosporiumqueenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌、灰盖鬼 伞、毛云芝菌、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、黄色镰刀菌、禾谷镰刀菌、禾赤镰孢、异孢 镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰刀菌、多枝镰孢、粉红镰孢菌、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰 刀菌、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰刀菌、镶片镰孢菌、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、 嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢原毛平革菌、射纹革菌、杏鲍菇、土生梭孢壳、长绒 毛栓菌、变色栓菌（Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿 色木霉的细胞。
[0138] 可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的方法 以本身已知的方式转化。在EP 238023和Yelton(意尔顿）等人，1984，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(美国国家科学院院刊）81:1470-1474,以及Christensen(克里斯滕森）等人， 1988, Bio/Technology (生物/技术）6:1419-1422中描述了对于曲霉属和木霉属宿主细胞 转化而言适合的程序。用于转化镰孢属物种的适合方法由Malardier (马拉迪尔）等人， 1989, Gene (基因）78:147-156、以及WO 96/00787描述。可以使用由如以下文献描述的程 序转化酵母：Becker (贝克尔）和Guarente (瓜伦特），在Abelson (阿贝尔森），J. N.和 Simon(西蒙），Μ·Ι·编，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology(酵母遗传学与 分子生物学指南），Methods in Enzymology (酶学方法），第194卷，第182-187页，Academic Press, Inc.(学术出版社有限公司），纽约；Ito (伊藤）等人，1983, J. Bacteriol.(细菌学 杂志）153:163 ;以及 Hinnen (伊嫩）等人，1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (美国科学院院 刊）75:1920。
[0139] 产生方法
[0140] 本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，包括（a)在有益于产生该多肽的条件下 培养细胞，该细胞以其野生型形式产生该多肽；并且（b)回收该多肽。在一个优选的方面， 该细胞是一种西地西菌属细胞。在一个更优选的方面，该细胞是一种西地西菌sp-16640细 胞。
[0141] 本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，包括（a)在有益于产生该多肽的条件下 培养一个本发明的重组宿主细胞；并且（b)回收该多肽。
[0142] 这些宿主细胞是在适合于使用本领域中已知的方法产生该多肽的一种营养培养 基中培养的。例如，可以通过在适合的培养基中和在允许表达和/或分离该多肽的条件下， 进行摇瓶培养，或者在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵（包括连续，分批， 分批补料，或固态发酵）来培养细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在一种适合营养 培养基中发生，该培养基包含碳和氮来源及无机盐。合适的培养基可从商业供应商获得或 可以根据公开的组成（例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中）制备。如果多肽分泌 到该营养培养基中，那么可直接从培养基中直接回收多肽。如果多肽不分泌，那么其可从细 胞裂解液中进行回收。
[0143] 可以使用特异性针对该多肽的本领域已知的方法来检测该多肽。这些检测方法包 括但不局限于，特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定 来确定该多肽的活性。
[0144] 可以使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，该多肽可以通过常规程序，包括但 不局限于，收集、离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从该营养培养基回收。
[0145] 可以通过本领域中已知的多种程序来纯化该多肽以获得基本上纯的多肽，这些程 序包括但不局限于：色谱法（例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以 及尺寸排阻色谱）、电泳程序（例如，制备型等电点聚焦）、差别溶解度（例如，硫酸铵沉 淀）、SDS_PAGE、或萃取（参见例如，Protein Purification (蛋白质纯化），Janson (詹森） 和 Ryden (赖登）编辑，VCH Publishers (VCH 出版社），纽约，1989)。
[0146] 在一个替代性方面中，没有回收该多肽，而是将表达该多肽的本发明的宿主细胞 用作该多肽的来源。
[0147] 植物
[0148] 本发明还涉及分离的植物，例如转基因植物、植物部分或植物细胞，这些植物包括 本发明的多肽，从而表达并且产生可回收的量的多肽或结构域。多肽或结构域可从植物或 植物部分回收。作为替代方案，包括该多肽或结构域的植物或植物部分可以按原样用于改 善食品或饲料的质量，例如改善营养价值、可口性及流变学特性，或破坏抗营养因素。
[0149] 转基因植物可以是双子叶的（双子叶植物）或单子叶的（单子叶植物）。单子叶 植物的实例是草，如草地早熟禾（meadow grass)(蓝草（blue grass),早熟禾属（Poa)); 饲用牧草（forage grass),如羊茅属（Festuca)、黑麦草属（Lolium);温带草（temperate grass),如翦股颖属（Agrostis);以及谷类，例如，小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、高粱、以及玉 蜀黍（玉米）。
[0150] 双子叶植物的实例是烟草、豆类（如羽扇豆（lupins)、马铃薯、糖甜菜（sugar beet)、豌豆、豆（bean)和大豆（soybean))、以及十字花科植物（十字花科（family Brassicaceae))(如花椰菜、油菜籽、以及紧密相关的模型生物拟南芥）。
[0151] 植物部分的实例是茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子、以及块茎、以及包括这些部分 的独立组织，例如，表皮、叶肉、薄壁组织（parenchyme)、维管组织、分生组织。特定植物细胞 区室，如叶绿体、质外体（apoplast)、线粒体、液泡、过氧化物酶体以及细胞质也被认为是植 物部分。此外，任何植物细胞，无论是何种组织来源，都被认为是植物部分。同样地，植物部 分，如分离以有助于本发明的利用的特定组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚、胚乳、 糊粉和种皮。
[0152] 同样包含于本发明范围内的是这类植物、植物部分以及植物细胞的子代。
[0153] 可以根据本领域已知方法构建表达该多肽或结构域的转基因植物或植物细胞。简 而言之，通过将编码该多肽或结构域的一个或多个表达构建体结合到植物宿主基因组或叶 绿体基因组中并且将所得改性植物或植物细胞繁殖成转基因的植物或植物细胞来构建植 物或植物细胞。
[0154] 表达构建体方便地是核酸构建体，它包括编码多肽或结构域的多核苷酸，该多核 苷酸可操作地与选择的植物或植物部分中表达该多核苷酸所需的适当调节序列连接。而 且，表达构建体可包含用于鉴别整合了此表达构建体的植物细胞的选择性标记，和将此构 建体引入所讨论的植物所必需的DNA序列（后者取决于所用的引入DNA的方法）。
[0155] 例如基于希望在何时、何处、和怎样表达该多肽或结构域来确定调节序列，例如启 动子和终止子序列以及任选的信号序列或转运序列的选择。例如编码多肽或结构域的基因 的表达可以是组成型的或诱导型的，或者可以是发育、阶段或组织特异性的，并且基因产物 可以被靶向至特定组织或植物部分，例如种子或叶。调控序列由例如Tague(塔格）等人， 1988, Plant Physiology (植物生理学）86:506 描述。
[0156] 对于组成型表达，可以使用35S_CaMV、玉米泛素1、或稻肌动蛋白1启动子 (Franck(弗兰克）等人，1980，Cell (细胞）21:285-294 ;Christensen(克里斯滕森）等 人，1992, Plant Mol. Biol.(植物分子生物学）18:675-689 ;Zhang(张）等人，1991，Plant Cell (植物细胞）3:1155-1165)。器官特异性启动子可以是例如：来自贮藏库组织（storage sink tissue)(如种子、马铃薯块莖、以及果实）（Edwards (爱德华兹）和Coruzzi (科鲁 兹），1990, Ann. Rev.Genet.(遗传学年度综述）24:275-303)、或代谢库组织（metabolic sink tissue)(如分生组织）的启动子（Ito (伊藤）等人，1994, Plant Mol. Biol.(植物 分子生物学）24:863-878);种子特异性启动子，如来自稻的谷蛋白、醇溶蛋白（prolamin)、 球蛋白（globulin)、或白蛋白启动子（Wu(吴）等人，1998, Plant Cell Physiol.(植物 细胞生理学）39:885-889);来自豆球蛋白M和来自蚕豆的未知种子蛋白基因的蚕豆启动 子（Conrad(康拉德）等人，1998，J. Plant Physiol.(植物生理学杂志）152:708-711); 来自种子油体蛋白的启动子（Chen(陈）等人，1998, Plant Cell Physiol.(植物细胞 生理学）39:935-941);来自欧洲油菜（Brassica napus)的藏蛋白napA启动子、或本

【技术领域】已知的任何其他种子特异性启动子，例如，如在WO 91/14772中所描述。此外， 启动子可以是叶特异性启动子，如来自稻或番爺的rbcs启动子（Kyozuka(京冢）等人， 1993, Plant Physiol.(植物生理学）102:991-1000)、小球藻病毒腺嘌呤甲基转移酶基 因启动子（Mitra(麦卓）和Higgins(希金斯），1994, Plant Mol. Biol.(植物分子生物 学）26:85-93)、来自稻的aldP基因启动子（Kagaya (加贺屋）等人，1995,Mol. Gen. Genet (. 分子遗传学与基因组学）248:668-674)、或伤口诱导型启动子（如马铃薯pin2启动子） (Xu(许）等人，1993, Plant Mol. Biol.(植物分子生物学）22:573-588)。同样地，该启动 子可以通过非生物处理来诱导，如温度、干旱、或盐度变化，或通过外源施加的激活该启动 子的物质来诱导，例如乙醇、雌激素、植物激素（如乙烯、脱落酸和赤霉酸）、以及重金属。
[0157] 还可使用启动子增强子元件，从而在植物中达到多肽或结构域的更高表达。例如， 启动子增强子元件可以是位于启动子和编码多肽或结构域的多核苷酸序列之间的内含子。 例如Xu(徐）等人，1993,同上披露了使用水稻肌动蛋白1基因的第一内含子来增强表达。
[0158] 该选择性标记基因及该表达构建体的任何其他部分可以选自本领域中可用的那 些。
[0159] 可以根据本领域中已知的常规技术将核酸构建体结合到植物基因组中，这些常规 技术包括农杆菌介导的转化、病毒介导的转化、微注射、粒子轰击、生物射弹转化、以及电 穿孔（Gasser (加塞尔）等人，1990, Science (科学）244:1293 ;Potrykus (波特里库斯）， 1990, Bio/Technology (生物 / 技术）8:535 ;Shimamoto (岛本）等人，1989, Nature (自 然）338:274)。
[0160] 目前根癌农杆菌介导的基因转移是一种用于产生转基因双子叶植物（关于综述， 请参见 Hooykas (霍伊卡）和 Schilperoort (施尔伯鲁特），1992，PlantMol. Biol.(植物 分子生物学）19:15-38)并且用于转化单子叶植物的方法，但对于这些植物还常常使用其 他的转化方法。用于产生转基因单子叶植物的方法是粒子（涂覆有转化DNA的微观金或 鹤粒子）轰击胚愈伤组织或发育中的胚（Christou(克里斯托），1992, Plant J.(植物 杂志）2:275^28I ;Shimamoto (岛本），1"4，Curr. Opin. Biotechnol.(生物技术当前述 评）5:158-162 ;Vasil (瓦西尔）等人，1992, Bio/Technology (生物 / 技术）10:667-674)。 用于转化单子叶植物的替代方法是基于原生质体转化，如由Omirulleh(奥米儒勒）等人， 1993, Plant Mol. Biol.(植物分子生物学）21:415-428所描述。另外的转化方法包括US 6395966和US 7151204(两者都通过引用以其全文结合于此）中所描述的那些。
[0161] 在转化后，根据本领域熟知的方法选出已并入了表达构建体的转化体，并使其再 生成为完整植物。通常设计转化程序用于通过如下方法在再生期间或在后续世代中选择性 消除选择基因：例如，使用带有两个独立的T-DNA构建体的共转化或利用特异性重组酶位 点特异性地切除选择基因。
[0162] 除用本发明的构建体直接转化特定植物基因型外，还可以通过使具有该构建体的 植物与缺乏该构建体的第二植物进行杂交来产生转基因植物。例如，可以通过杂交将编码 多肽或结构域的构建体引入特定植物品种中，无需总是直接地转化该给定品种的植物。因 此，本发明不仅涵盖了从根据本发明已经转化的细胞直接再生的植物，而且还涵盖了这类 植物的后代。如在此使用的，后代可以是指根据本发明制备的亲本植物的任何代的后代。此 类后代可以包括根据本发明制备的DNA构建体。杂交导致通过供体植物系与起始系交叉授 粉，将转基因引入植物系。此类步骤的非限制性实例描述于US 7151204中。
[0163] 植物可以通过回交转化方法生成。例如，植物包含被称为回交转化的基因型、种 系、近交体、或杂交体的植物。
[0164] 可以使用遗传标记以协助本发明的一种或多种转基因从一个遗传背景渗入到另 一个。标记协助的选择提供了相对于常规育种的优势，在于其可以用于避免由表型变异导 致的错误。另外，遗传标记可以在具体杂交的个别后代中提供有关良种种质相对程度的数 据。例如，当具有所希望性状并且另外具有非农艺学所希望的遗传背景的植物与良种亲本 杂交时，可以使用遗传标记来选择不仅具有感兴趣的性状，还具有相对较大比例所希望种 质的后代。以此方式，使一种或多种性状渗入特定遗传背景所需的世代数得以最小化。
[0165] 本发明还涉及产生本发明的多肽或结构域的方法，这些方法包括（a)在有益于产 生该多肽或结构域的条件下培养转基因植物或植物细胞，该转基因植物或植物细胞包含编 码该多肽或结构域的多核苷酸；并且（b)回收该多肽或结构域。
[0166] 组合物
[0167] 下文阐述的组合物组分的非限制性列表适合用于这些组合物中，并且在此的方法 可以合宜地并入本发明的某些实施例中，例如用以辅助或增强清洁性能，用于处理有待清 洁的底物，或用以在与香料、着色剂、染料或类似物一起的情况下修饰该组合物的美感。掺 入组合物中的任何此类组分的水平是除了先前引用的用于掺入的任何材料之外的。这些额 外组分的精确性质、其掺入水平将取决于组合物的物理形式和将在其中使用组合物的清洁 操作的性质。除非另外指明，按百分率计的量是按组合物的重量（wt%)计。适合的组分材 料包括但不局限于表面活性剂、助洗剂、螯合剂、染料转移抑制剂、分散剂、酶、以及酶稳定 齐U、催化材料、漂白活化剂、过氧化氢、过氧化氢源、预形成的过酸、聚合物分散剂、粘土去除 /抗再沉积剂、增亮剂、泡沫抑制剂、染料、调色染料、香料、香料递送系统、结构弹力剂、织物 软化剂、载体、助水溶物、加工助剂、溶剂和/或颜料。除了以下披露之外，此类其他组分的 适合实例以及使用水平发现于US 5576282、US 6306812、和US6326348中，据此通过引用将 这些文献结合。
[0168] 因此，在某些实施例中，本发明不包含以下附属材料的一种或多种：表面活性剂、 助洗剂、螯合剂、染料转移抑制剂、分散剂、另外的酶、以及酶稳定剂、催化材料、漂白活化 齐?、过氧化氢、过氧化氢源、预形成的过酸、聚合物分散剂、粘土去除/抗再沉积剂、增亮剂、 泡沫抑制剂、染料、香料、香料递送系统、结构弹力剂、织物软化剂、载体、助水溶物、加工助 齐U、溶剂和/或颜料。然而，当一种或多种组分存在时，这样的一种或多种组分可以是如下 文详述的存在的：
[0169] 表面活性剂-根据本发明的组合物可以包括表面活性剂或表面活性剂系统，其中 该表面活性剂可以选自非离子型表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性 表面活性剂、兼性离子表面活性剂、半极性非离子表面活性剂、及其混合物。当存在时，表面 活性剂典型地是以从〇.1被 (％至6〇￥1:(%、从1￥1:(%至5〇￥1:(%或从5￥1: (%至4〇￥1:(%的水平存 在。
[0170] 适合的阴离子去污表面活性剂包括硫酸盐和磺酸盐去污表面活性剂。
[0171] 适合的磺酸盐去污表面活性剂包括烷基苯磺酸盐，在一个方面为Cich13烷基苯磺酸 盐。可以通过磺化可商购的直链烷基苯（LAB)获得适合的烷基苯磺酸盐（LAS);适合的LAB 包括低碳2-苯基LAB，例如Isochem?或Petrelab?，其他适合LAB包括高碳2-苯基LAB， 例如Hyblene?。一种适合的阴离子洗涤剂表面活性剂是通过DETAL催化工艺获得的烷基 苯磺酸盐，但其他合成途径（如HF)也可以是适合的。在一个方面，使用LAS的镁盐。
[0172] 适合的硫酸盐去污表面活性剂包括烷基硫酸盐，在一个方面，为C8_18烷基硫酸盐， 或王要为C 12烧基硫酸盐。
[0173] 另外的适合的硫酸盐去污表面活性剂是烧基烧氧基化硫酸盐，在一个方面为烧基 乙氧基化硫酸盐，在一个方面为C 8_18烧基烧氧基化硫酸盐，在另一个方面为C 8_18烧基乙氧 基化硫酸盐，典型地烷基烷氧基化硫酸盐具有从0. 5至20或从0. 5至10的平均烷氧基化 度，典型地烷基烷氧基化硫酸盐是C8_18烷基乙氧基化硫酸盐，具有从0. 5至10、从0. 5至7、 从0. 5至5或甚至从0. 5至3的平均乙氧基化度。
[0174] 烧基硫酸盐、烧基烧氧基化硫酸盐和烧基苯横酸盐可以是直链或支链的、取代或 未取代的。
[0175] 去污表面活性剂可以是中链分支的去污表面活性剂，在一个方面为中链分支的阴 离子去污表面活性剂，在一个方面为中链分支的烷基硫酸盐和/或中链分支的烷基苯磺酸 盐，例如中链分支的烷基硫酸盐。在一个方面，中链分支是(V 4烷基，典型地为甲基和/或 乙基基团。
[0176] 适合非离子去污表面活性剂是选自下组，该组由以下各项组成=C8-C18烷基乙氧基 化物，例如NEODOL?; C6-C12烷基苯酚烷氧基化物，其中该烷氧基化物单元可以是乙烯氧 基单元，丙烯氧基单元或其混合物；C 12-C18醇和C 6-C12烷基苯酚与环氧乙烷/环氧丙烷嵌段 聚合物的缩合物，例如Pluronic?; C14-C2^链分支的醇；C 14-C22中链分支的烷基烷氧基化 物（典型地具有从1至30的平均烷氧基化度）；烷基多糖，在一个方面为烷基多糖苷；多羟 基脂肪酸酰胺；醚封端的聚（烷氧基化）醇表面活性剂；及其混合物。
[0177] 适合的非离子去污表面活性剂包括烷基多糖苷和/或烷基烷氧基化醇。
[0178] 在一个方面，非离子去污表面活性剂包括烷基烷氧基化醇，在一个方面为(：8_ 18烷 基烧氧基化醇，例如〇8_18烧基乙氧基化醇，该烧基烧氧基化醇可以具有从1至50、从1至30、 从1至20、或从1至10的平均烷氧基化度。在一个方面，烷基烷氧基化醇可以是C 8_18烷基 乙氧基化醇，具有从1至10、从1至7,更多是从1至5或从3至7的平均乙氧基化度。烷 基烷氧基化醇可以是直链或支链的、以及取代或未取代的。适合的非离子表面活性剂包括 Lutensol?。
[0179] 适合的阳离子去污表面活性剂包括烷基吡啶鎗化合物、烷基季铵化合物、烷基季 鱗化合物、烷基三锍化合物、及其混合物。
[0180] 适合的阳离子去污表面活性剂是具有以下通式的季铵化合物：(R) (R1) (R2) (R3) N+X^其中R是直链或支链的、取代或未取代的C6_18烷基或烯基部分，R JP R 2独立地选自甲 基或乙基部分,R3是羟基、羟甲基或羟乙基部分，X是提供电荷中性的阴离子，适合的阴离子 包括卤化物，例如氯化物；硫酸盐；以及磺酸盐。适合的阳离子去污表面活性剂是单_(： 6_18烷 基单-羟乙基二甲基季铵氯化物。高度合适的阳离子去污表面活性剂是单-C8_ 1(l烷基单-羟 乙基二甲基季铵氯化物、单-Cich12烷基单-羟乙基二甲基季铵氯化物以及单-C 1(|烷基单-羟 乙基二甲基季铵氯化物。
[0181] 适合的两性表面活性剂/兼性离子表面活性剂包括氧化胺和甜菜碱。本发明的胺 中和的阴离子表面活性剂-阴离子表面活性剂以及附属的阴离子共表面活性剂可以按酸 形式存在，并且所述酸形式可以被中和以形成希望用于本发明洗涤剂组合物的表面活性剂 盐。典型的用于中和的试剂包括金属反离子碱，例如氢氧化物，如NaOH或Κ0Η。用于中和本 发明的阴离子表面活性剂和处于其酸形式的附属阴离子表面活性剂或共表面活性剂的另 外优选的试剂包括氨、胺、或烷醇胺。优选烷醇胺。适合的非限制性实例包括单乙醇胺、二 乙醇胺、三乙醇胺、以及其他本领域中已知的直链或支链的烷醇胺；例如，高度优选的烷醇 胺包括2-氨基-1-丙醇、1-氨基丙醇、单异丙醇胺、或1-氨基-3-丙醇。胺中和可以进行 到完全或部分的程度，例如，阴离子表面活性剂混合物的部分可以被钠或钾中和，并且阴离 子表面活性剂混合物的部分可以被胺或烷醇胺中和。
[0182] 包含一种或多种阴离子表面活性剂以及另外一种或多种非离子表面活性剂、并可 任选地与另外的表面活性剂例如阳离子表面活性剂的混合物的表面活性剂系统可以是优 选的。优选的阴离子与非离子表面活性剂的重量比是至少2:1、或至少1:1至1:10。
[0183] 助洗剂-本发明的组合物可以包括一种或多种助洗剂、共助洗剂、助洗剂系统 或其混合物。当使用助洗剂时，清洁组合物将典型地包括至少lwt%、从2wt%至60wt% 或从5wt%至10wt%的助洗剂。在洗涤餐具清洁组合物中，助洗剂的水平典型地是 40wt% -65wt%，或是50wt% -65wt%。该组合物可以是基本上不含助洗剂；基本上不含 意为"没有有意添加的"沸石和/或磷酸盐。典型的沸石助洗剂包括沸石A、沸石P和沸石 MAP。典型的磷酸盐助洗剂是三聚磷酸钠。
[0184] 助洗剂和/或共助洗剂可以具体是形成具有Ca和Mg的水溶性复合物的螫合剂。 可以使用本领域中已知用于洗涤剂中的任何助洗剂和/或共助洗剂。助洗剂的非限制性实 例包括沸石、二磷酸盐（焦磷酸盐）、三磷酸盐（如三磷酸钠（STP或STPP))、碳酸盐（如 碳酸钠）、可溶性硅酸盐（如偏硅酸钠）、层状硅酸盐（例如来自赫斯特公司（Hoechst)的 SKS-6)、乙醇胺（如2-氨基乙-1-醇（MEA)、亚胺基二乙醇（DEA)和2, 2'，2"-次氨基三乙 醇（TEA))、以及羧甲基菊粉（CMI)、以及其组合。
[0185] 清洁组合物可以单独地包括一种共助洗剂，或与一种助洗剂，例如沸石助洗剂组 合。共助洗剂的非限制性实例包括聚丙烯酸酯的均聚物或其共聚物，例如聚（丙烯酸） (PAA)或共聚（丙烯酸/马来酸）（PAA/PMA)。另外的非限制性实例包括柠檬酸盐，螯合剂， 例如氨基羧酸盐、氨基多羧酸盐和膦酸盐，以及烷基-或链烯基琥珀酸。另外的具体实例 包括2, 2'，2"-次氨基三乙酸（NTA)、乙二胺四乙酸（EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸（DTPA)、 亚氨二琥珀酸（IDS)、乙二胺-Ν，Ν'-二琥珀酸（EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸（MGDA)、谷氨 酸-Ν，N-二乙酸（GLDA)U-羟乙烷-1，1-二基双（膦酸）（HEDP)、乙二胺四（亚甲基）四 (膦酸）（EDTMPA)、二亚乙基三胺五（亚甲基）五（膦酸）（DTPMPA)、Ν-(2-羟乙基）亚氨基 二乙酸（EDG)、天冬氨酸-N-单乙酸（ASMA)、天冬氨酸-Ν，N-二乙酸（ASDA)、天冬氨酸-N-单 丙酸（ASMP)、亚氨二琥珀酸（IDA)、N-(2-磺甲基）天冬氨酸（SMAS)、N-(2-磺乙基）天 冬氨酸（SEAS)、N-(2-磺甲基）谷氨酸（SMGL)、N-(2-磺乙基）谷氨酸（SEGL)、N-甲基亚 氨基二乙酸（MIDA)、α-丙氨酸-N，N-二乙酸（α-ALDA)、丝氨酸-N，N-二乙酸（SEDA)、 异丝氨酸-N，N-二乙酸（ISDA)、苯丙氨酸-N，N-二乙酸（PHDA)、邻氨基苯甲酸-N，N-二乙 酸（ANDA)、对氨基苯磺酸-N，N-二乙酸（SLDA)、氨基乙磺酸-N，N-二乙酸（TUDA)和磺甲 基-N，N-二乙酸（SMDA)、N-(羟乙基）-亚乙基二胺三乙酸盐（HEDTA)、二乙醇甘氨酸（DEG)、 二亚乙基三胺五（亚甲基膦酸）（DTPMP)、氨基三（亚甲基膦酸）（ATMP)、以及其组合和盐。 另外的示例性助洗剂和/或共助洗剂描述于例如WO 09/102854、US 5977053中。
[0186] 盩合剂和晶体牛长抑制剂-在此的组合物可以包含螯合剂和/或晶体生长抑制 齐U。适合的分子包括铜、离子和/或锰螯合剂及其混合物。适合的分子包括DTPA (二亚乙基 三胺五乙酸）、HEDP (羟基乙烷二膦酸）、DTPMP (二亚乙基三胺五（亚甲基膦酸））、1，2-二羟 基苯-3, 5-二磺酸二钠盐氢氧化物、乙二胺、二亚乙基三胺、乙二胺二琥珀酸（EDDS)、N-羟 基乙基乙二胺三乙酸（HEDTA)、三亚乙基四胺六乙酸（TTHA)、N-羟基乙基亚氨基二乙酸 (HEIDA)、二羟基乙基甘氨酸（DHEG)、亚乙基二胺四丙酸（EDTP)、羧甲基菊粉以及2-膦羧基 丁烷1，2, 4-三羧酸（Bayhibit? AM)及其衍生物。典型地，该组合物可以包括从0. 005wt% 至15wt%或从3. Owt%至10wt%的螯合剂或晶体生长抑制剂。
[0187] 漂白组分-适合用于并入本发明的方法和组合物中的漂白组分包括多于一种漂 白组分中的一种或混合物。适合的漂白组分包括漂白催化剂、光漂白剂、漂白活化剂、过氧 化氢、过氧化氢源、预形成的过酸及其混合物。总之，当使用一种漂白组分时，本发明的组合 物可以包括从0.00001界1: (%至90￥1:(%、0.0001￥1:(%至50￥1:(%或从0.001￥1: (%至25￥1:(%的漂 白组分。适合的漂白组分的实例包括：
[0188] (1)预先形成的过酸：适合的预先形成的过酸包括但不局限于选自下组的化合 物，该组由预先形成的过氧酸或其盐组成，典型地是过氧羧酸或其盐或过氧硫酸或其盐。
[0189] 预先形成的过氧酸或其盐优选是一种过氧羧酸或其盐，典型地具有对应于以下化 学式的化学结构：
[0190]

【权利要求】
1. 一种具有脂肪酶活性的分离的多肤，该多肤选自下组，该组由w下各项组成： (a)具有与SEQ ID NO:2的成熟多肤至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少 96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性的一种多肤； 化）一种多肤，该多肤是由一种多核巧酸编码的，该多核巧酸在低严谨度条件下、中严 谨度条件下、中-高严谨度条件下、高严谨度格条件下或非常高严谨度条件下与（i)SEQ ID NO: 1的成熟多肤编码序列、或（ii) (i)的全长补体杂交； (C) 一种多肤，该多肤是由一种多核巧酸编码的，该多核巧酸具有与SEQ ID NO: 1的成 熟多肤编码序列至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性； (d) (a)、化）或（C)的多肤的一种变体，该变体在一个或多个位置处包括取代、缺失、和 /或插入；W及 (e) (a)、化）、（C)或（d)的多肤的一个片段，该片段具有脂肪酶活性。
2. 如权利要求1所述的多肤，包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2的成熟多肤或由其组 成。
3. 如权利要求2所述的多肤，其中该成熟多肤是SEQ ID NO:2的氨基酸1至292。
4. 一种组合物，该组合物包括如权利要求1-3中任一项所述的多肤。
5. 如权利要求4所述的组合物，其中与缺乏脂肪酶的等效组合物相比，所述组合物更 有效地去除一个表面上存在的多种脂质污物。
6. 如权利要求4-5中任一项所述的组合物，进一步包括一种或多种二价阳离子，该些 二价阳离子优选地选自巧（Ca")、镇（Mg")和铁-II (化"）。
7. 如权利要求4-6中任一项所述的组合物，进一步包括选自下组的一种或多种表面活 性剂，该组由W下各项组成；阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂、兼 性离子表面活性剂。
8. 如权利要求4-7中任一项所述的组合物，其中该表面活性剂包括选自下组的一种或 多种表面活性剂，该组由W下各项组成；十二焼基苯賴酸轴、氨化挪油酸轴、月桂醇離硫酸 轴、C12-14链焼醇聚離-7、C12-15链焼醇聚離-7、C12-15链焼醇聚離硫酸轴、W及C14-15 链焼醇聚離-4。
9. 如权利要求4-8中任一项所述的组合物，在从8. 0至11的抑下配制。
10. 如权利要求4-9中任一项所述的组合物，其中该组合物选自下组，该组由W下各项 组成；洗衣清洁组合物、洗碗清洁组合物、硬表面清洁组合物和个人护理清洁组合物。
11. 如权利要求4-10中任一项所述的组合物，其中该组合物的形式是选自下组，该组 由W下各项组成；液体、凝胶、皂条、粉末、颗粒状固体、片剂、或其任何组合。
12. 如权利要求4-11中任一项所述的组合物，其中该组合物在从约10°C至90°C的温度 下，在水解脂质方面是有效的。
13. 如权利要求7-12中任一项所述的组合物，其中与包括替代Liprl39脂肪酶的疏棉 状嗜热丝抱菌脂肪酶（Lipolase?)的等效组合物相比，在水解脂质底物方面，该组合物更 有效。
14. 如权利要求4-13中任一项所述的组合物，进一步包括选自W下各项的一种或多种 酶；半纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磯脂酶、醋酶、角质酶、 果胶酶、甘露聚糖酶、果胶裂解酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酷氧化酶、脂加氧酶、木质素 酶、支链淀粉酶、稼酸酶、聚戊糖酶、马拉纳酶、目-葡聚糖酶、阿拉伯糖巧酶、透明质酸酶、软 骨素梅、漆酶、淀粉酶、或其混合物。
15. 如权利要求4-14所述的组合物，其中与包含替代具有与SEQ ID NO: 2至少92% - 致性的脂肪酶的疏棉状嗜热丝抱菌脂肪酶的等效组合物中的疏棉状嗜热丝抱菌脂肪酶的 稳定性相比，具有与SEQ ID N0:2至少92% -致性的脂肪酶的稳定性更大，优选地，其中在 最终组合物和/或最终洗涂介质中测量稳定性。
16. 产生根据权利要求4-15中任一项所述的组合物的一种方法，该方法包括添加具有 与SEQ ID N0:2至少92%-致性的脂肪酶和表面活性剂。
17. 清洁表面的一种方法，该方法包括使该表面上存在的待清洁的一种脂质污物与根 据权利要求4-15中任一项所述的组合物接触。
18. 水解表面上脏物和/或污物中存在的脂质的一种方法，该方法包括使该脏物和/或 污物与如权利要求1-3中任一项所述的多肤或如权利要求4-15中任一项所述的组合物接 触。
19. 一种分离的多核巧酸，该多核巧酸编码如权利要求1-3中任一项所述的多肤。
20. -种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包括如权利要求19所述的 多核巧酸，该多核巧酸可操作地连接至指导该多肤在一个表达宿主内的产生的一个或多个 控制序列。
21. -种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包括如权利要求19所述的多核巧酸，该多核 巧酸可操作地连接至指导该多肤的产生的一个或多个控制序列。
22. -种产生如权利要求1-3中任一项所述的多肤的方法，该方法包括： (a)在有益于产生该多肤的条件下培养一种细胞，该细胞W其野生型形式产生该多肤； 并且 化）回收该多肤。
23. -种产生具有脂肪酶活性的多肤的方法，该方法包括： (a)在有益于产生该多肤的条件下培养如权利要求21所述的宿主细胞；并且 化）回收该多肤。
【文档编号】C11D3/386GK104471048SQ201380037105
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2013年7月11日 优先权日:2012年7月12日
【发明者】R·P·奥林斯基, P·尼尔森, K·博尔奇, A·V·赖泽, C·H·汉森, L·鲍恩斯加德 申请人:诺维信公司