一种西兰花多肽组分微波辅助提取及活性测定方法
【专利摘要】本发明公开了一种西兰花多肽组分微波辅助提取及活性测定方法，包括以下步骤：S100：液氮研磨备制，将西兰花阴干，用液氮研磨备制；S200：微波辐射；S300：分离上清液；S400：加入有机溶剂；S500：分离西兰花多肽组分。本发明可有效缩短提取时间、降低操作成本、减少有机溶剂用量，环保的优点，而且可显著提高提取效率，获得更多活性组分。
【专利说明】
一种西兰花多肽组分微波辅助提取及活性测定方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种提取方法，具体涉及一种西兰花多肽组分微波辅助提取及活性测定方法。【背景技术】
[0002]西兰花是一种很受人们欢迎的蔬菜，它味道鲜美，营养也很高，还有很高的药用价值。它的维生素C含量非常丰富，它还具有抗癌功效，西兰花的平均营养价值及防病作用远远超出其他蔬菜。西兰花多肽为西兰花中一种有效的抗癌成分，多肽类化合物广泛存在于自然界中，其中对具有一定生物学活性的多肽的研究，一直是药物开发的一个主要方向。西兰花多肽活性组分应用于抗肿瘤细胞实验，具有抑制肿瘤细胞增生、促进肿瘤细胞凋亡的作用。目前对于西兰花多肽的提取一般采用有机溶剂沉淀法，该方法主要是通过加入亲水性的有机溶剂能够降低介质的介电常数，增加溶质分子之间的静电引力以及亲水性有机溶剂脱除蛋白质水化膜，降低蛋白质的亲水性，促进蛋白质的聚集和沉淀。但此方法受多种因素影响，如有机溶剂的选择，温度的控制，酸碱度、离子强度等。有机溶剂一般选择乙醇或丙酮。采用有机溶剂沉淀法提取蛋白质多肽提取时间长，有机溶剂用量大，成本高，由于长时间、大剂量的有机溶剂(乙醇或丙酮)作用导致多肽产物的活性降低。
【发明内容】
[0003]针对现有技术的缺陷，本发明提供了一种西兰花多肽组分微波辅助提取及活性测定方法。
[0004]—种西兰花多肽组分微波辅助提取方法，包括以下步骤:S100:液氮研磨备制，将西兰花阴干，用液氮研磨备制；S200:微波辐射，取研磨后的西兰花100份，加入鲜重的10% 的PVP、鲜重的300 %的Tr i s-HCl溶液，溶液浓度55mmo 1 /L-65mmo 1 /L，pH值6-7，混匀，进行微波辐射；S 3 0 0:分离上清液。将步骤S 2 0 0微波辐射后的溶液取出，放于4 °C中静置1 h， 4000rpm/min离心lOmin，取上清液;S400:加入有机溶剂，将步骤S300中的上清液加入预冷 (-20°C)的有机溶剂中，混匀，放于-20°C中静置20-60min; S500:分离西兰花多肽组分，在步骤S400之后，4000rpm/min离心lOmin，取离心后沉淀，倒扣除去残余液体后正放在-20°C中静置10-20min，加入蒸馏水溶解混勾，10000rpm/min离心6min，分离得到西兰花多肽粗提物。
[0005]优选的，步骤S200中西兰花重量(克)与微波功率(瓦)之比为1:5-9。步骤S400中所述有机溶剂为乙醇，则加入终浓度40%-80%乙醇于4°C搅拌l_3h;所述步骤S500包括离心分离上清，旋转蒸发除乙醇得到多肽粗提物。步骤S400中所述有机溶剂为丙酮，上清液与丙酮体积之比为1:2-3。
[0006]—种西兰花多肽组分微波辅助提取方法所提取的西兰花多肽粗提物组分分离及活性测定方法，包括以下步骤:S600:取西兰花多肽粗提物l-3ml加样到Sephadex G-25凝胶过滤色谱仪(16mmX100〇mm)，以蒸馏水进行洗脱，流速lmL ?mirT1，用蛋白核酸检测仪进行监测，波长280nm，收集各洗脱峰；S700:取西兰花多肽各组分体积100微升，放于试管中，加入5ml的考马斯亮蓝溶液，震荡摇匀，静置lOmin后，于595nm处测西兰花多肽各组分的吸光度值;S800:取西兰花多肽各分离组分样品液或蒸馏水(对照)与0.05mol ?.2Tris-HC1缓冲液混合于试管中，放在25°C的恒温水浴中20min。加入一定量邻苯三酚溶液，震荡混匀，测量吸光度值，计算各分离组分对超氧阴离子自由基的清除率。
[0007]本发明的有益效果:建立了一种从西兰花中高效、快速提取植物蛋白多肽的现代提取工艺。该方法利用微波辅助技术结合化学沉淀法提取西兰花多肽，凝胶层析分离活性组分。本发明克服了高浓度有机溶剂易引起蛋白质变性失活，操作需要在低温下进行，加入有机溶剂时需要搅拌均匀以避免局部浓度过大等缺点。利用微波辅助提取技术具有试剂用量少，环保，洗脱时间快，分离完全、回收率较高等优点。葡聚糖凝胶层析分离多肽活性组分具有吸附容量大、流速快、分辨率高等特点。可有效缩短提取时间、降低操作成本、减少有机溶剂用量，环保的优点，而且可显著提高提取效率，获得更多活性组分。【附图说明】
[0008]图1是本发明提取方法的流程图；
[0009]图2A是采用有机溶剂提取的多肽分离图谱；
[0010]图2B是采用微波辅助提取的多肽分离图谱。【具体实施方式】
[0011]为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的【具体实施方式】做详细的说明，使本发明的上述及其它目的、特征和优势将更加清晰。在全部附图中相同的附图标记指示相同的部分。并未刻意按比例绘制附图，重点在于示出本发明的主旨。
[0012]本发明采用微波辅助提取西兰花多肽，由于微波的高频电磁波能够穿透介质到达物料内部，通过吸收微波能，细胞内部温度上升，细胞膨胀、破裂，有效成分自由流出，并在较低的温度下溶解于介质中；微波产生的电磁场还可加速被萃取组分的分子由固体内部向固液界面扩散的速率;此外，微波辐射能作用于分子时，可促进分子作极性变换运动，产生键的振动、撕裂和粒子间的摩擦和碰撞，生成热能，促使细胞破裂，细胞液溢出并扩散至溶剂中。在微波提取中，吸收微波能的差异可使基体物质的某些区域或提取体系中的某些组分被选择性加热，从而使被提取物质从基体或体系中分离，进入到溶剂中。[〇〇13] 实施例1
[0014]请参阅图1，本发明的微波辅助提取西兰花多肽组分的方法主要包括以下步骤。 [〇〇15]S100:液氮研磨备制。将西兰花用蒸馏水洗净后，取花蕾，阴干，用液氮研磨备制。
[0016]S200:微波辐射。取研磨后的西兰花100份(克)，加入鲜重的10 %的PVP、鲜重的300%的Tris-HCL溶液，溶液浓度55mmol/L-65mmol/L，pH值6-7，混勾，放入微波炉中，西兰花重量(克)与微波功率(瓦)之比为1: 5-9，优选的为1:8，微波的功率对西兰花多肽的提取至关重要，功率过大则会破坏多肽结构，功率过小则不能使得有效成分自由流出，为此本申请的发明人经过多次试验发现其西兰花重量(克)与微波功率(瓦)之比为1:7-9时，既可以不破坏多肽结构，又可以使得西兰花中的细胞膨胀、破裂，采用这一比例可以达到最佳的辅助提取效果。实验表明当西兰花重量(克)与微波功率(瓦)之比为1:5时，西兰花多肽的流出率为37% (大部分多肽成分还存留在细胞中)，1:8时多肽的流出率为87%，1:10时多肽的流出率为40.5% (大部分多肽成分被破坏)。在本实施例中，微波功率为800W下微波辐射8-15s〇
[0017]S300:分离上清液。将步骤S200微波辐射后的溶液取出，放于4°C中静置lh，4000rpm/min离心1 Omin，取上清液。[〇〇18]S400:加入有机溶剂。将步骤S300中的上清液加入预冷(-20°C )的有机溶剂中，本申请中有机溶剂采用丙酮，上清液:丙酮=1:2.5，混匀，放于-20 °C中静置10_20min。上清液与丙酮之比对于最终多肽的提取率和多肽的活性有着重要影响，如前所述过多的有机溶剂会导致多肽产物的活性降低，而有机溶剂过少则西兰花中的多肽不能完全溶于有机溶剂中，造成提取率低。本
【申请人】通过大量实验发现，在微波辅助提取中上清液:丙酮为1:2-3 (体积比)时可以获得最佳的提取率。实验表明当上清液:丙酮为1:1时(体积比)，西兰花多肽的提取率为30.5%，含85.3%的活性多肽，当上清液:丙酮为1:2.5时(体积比)提取率为 80%，含83.3%的活性多肽，当上清液:丙酮为1:4时(体积比)提取率为73%，含30.3%的活性多肽。为此本申请中为了获得最佳的提取率和多肽活性，采用上清液:丙酮= 1:2.5(体积比)。[0〇19]S500:分离西兰花多肽组分。在步骤S400之后，4000rpm/min离心lOmin，取离心后沉淀，倒扣除去残余液体后正放在_20°C中静置10_20min，加入蒸馏水溶解混匀(lg: 100微升)10000rpm/min离心6min，取上清液。分离得到西兰花多肽粗提物。
[0020]实施例2
[0021]进一步的，本申请还公开了一种西兰花多肽组分的活性测定方法，包括以下步骤:[〇〇22]S600:取西兰花多肽粗提物l-3ml加样到Sephadex G-25凝胶过滤色谱仪(16mmX1000mm)，以蒸馏水进行洗脱，流速lmL ? mirT1，用蛋白核酸检测仪进行监测，波长280nm，收集各洗脱峰。[〇〇23]S700:取西兰花多肽各组分体积100微升，放于试管中，加入5ml的考马斯亮蓝溶液，震荡摇匀，静置lOmin后，于595nm处测西兰花多肽各组分的吸光度值。[〇〇24]S800:取西兰花多肽各分离组分样品液或蒸馏水(对照)与0.05mol ? L^pH:8.2Tris-HCl缓冲液混合于试管中，放在25°C的恒温水浴中20min。加入一定量邻苯三酚溶液，震荡混匀，测量吸光度值，计算各分离组分对超氧阴离子自由基的清除率。
[0025]实验例
[0026]通过该实验例的比较可以进一步说明本发明实施例1提取方法的优点。[〇〇27] 实验工艺条件:
[0028]传统的有机溶剂提取法:西兰花洗净，剪下花蕾，阴干备用。称量湿重花蕾，按鲜重的10 %加入PVP，液氮研磨，加入浓度为62.5mmol/L Tris-HCl提取液，4°C放置lh，去沉淀， 取上清液，加入一定体积_20°C预冷丙酮，于_20°C放置，去上清，取沉淀。沉淀_20°C放置 20min。加入蒸馏水溶解沉淀得西兰花多肽粗提物。
[0029]微波辅助提取法:西兰花洗净，取花蕾，阴干备用。称量湿重花蕾，按鲜重的10%加入PVP，液氮研磨，加入浓度为62.5mmol/L Tris-HCl提取液，混匀，放入微波炉中，微波功率 800W，小火下微波辐射1 Os，取出，4 °C放置lh，去沉淀，取上清液，按一定比例加入-20 °C预冷丙酮，于-20°C放置，去上清，取沉淀。沉淀-20°C放置20min。加入蒸馏水溶解沉淀得西兰花多肽粗提物。
[0030]实验结果:
[0031](1)提取时间、丙酮用量的比较
[0032]以上两种方法分别针对提取液pH值、料液比、液酮比、丙酮提取时间四个因素做正交实验分析，结果表明:改良型丙酮沉淀法的最优提取条件为提取液pH值为7、料液比为1: 3、液酮比为1:4.5，提取时间为40min;微波辅助的丙酮提取法最优提取条件为提取液pH值为7、料液比为1:3、液酮比为1:2.5，提取时间为20min。从最优工艺条件的比较可见微波辅助提取法具有提取时间短、操作成本低、减少丙酮用量，环保的优点，而且丙酮作用时间短可以减少对多肽产物活性的影响。[〇〇33](2)提取率的比较
[0034]分别利用优化工艺，取相同质量阴干西兰花花蕾，进行西兰花多肽的提取，考马斯亮蓝染色法测定获得西兰花多肽粗提物的含量，计算提取率，各重复三次。改良型丙酮沉淀法的提取率为l〇〇g原料提取300-390mg粗多肽，微波辅助提取法的提取率为100g原料提取 565-760mg粗多肽。由此数据可见，微波辅助提取可显著增加西兰花多肽的提取率。[〇〇35](3)分离图谱的比较
[0036]利用改良型丙酮沉淀法和微波辅助丙酮沉淀法提取西兰花多肽后利用凝胶过滤层析进行多肽分离的谱图分别如图2A、2B所示，其中横坐标为洗脱时间，纵坐标为吸光度。 从图中可以看出微波辅助提取法各峰尖吸光度及峰面积明显高于传统溶剂提取法。
[0037]从上述实验例可以看出，与有机溶剂提取法相比微波辅助提取法可有效缩短提取时间、降低操作成本、减少丙酮用量，环保的优点，而且可显著提高提取效率，获得更多活性组分。
[0038]在以上的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是以上描述仅是本发明的较佳实施例而已，本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，因此本发明不受上面公开的具体实施的限制。同时任何熟悉本领域技术人员在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。
【主权项】
1.一种西兰花多肽组分微波辅助提取及活性测定方法，其特征在于，包括以下步骤:S100:液氮研磨备制，将西兰花阴干，用液氮研磨备制；S200:微波辐射，取研磨后的西兰花100份，加入鲜重的10 %的PVP、鲜重的300 %的 Tris-HCL溶液，溶液浓度55mm〇l/L-65mm〇l/L，pH值6-7，混匀，进行微波辐射；S300:分离上清液，将步骤S200微波辐射后的溶液取出，放于4°C中静置lh，4000rpm/ min离心lOmin，取上清液；S400:加入有机溶剂，将步骤S300中的上清液加入预冷的有机溶剂中，混匀，放于-20°C 中静置20_60min;S500:分离西兰花多肽组分，在步骤S400之后，离心，取离心后分离物，分离得到西兰花 多妝粗提物。2.根据权利要求1所述的西兰花多肽组分微波辅助提取方法，其特征在于，步骤S200中 西兰花重量(克)与微波功率(瓦)之比为1:5-9。3.根据权利要求1所述的西兰花多肽组分微波辅助提取方法，其特征在于，所述步骤 S400中所述有机溶剂为浓度40%-80%乙醇，所述步骤S500包括于4°C搅拌l_3h;离心分离 上清，旋转蒸发除乙醇，分离得到西兰花多肽粗提物。4.根据权利要求1所述的西兰花多肽组分微波辅助提取方法，其特征在于，所述步骤 S400中所述有机溶剂为丙酮，所述步骤S500包括4000rpm/min离心lOmin，取离心后沉淀，倒 扣除去残余液体后正放在-20 °C中静置10_20min，加入蒸馏水溶解混匀，10000rpm/min离心 6min，分离得到西兰花多肽粗提物。5.根据权利要求1所述的西兰花多肽组分微波辅助提取方法，其特征在于，步骤S400中 所述有机溶剂为丙酮，上清液与丙酮体积之比为1:2-3。6.—种如权利要求1-5任一所述的西兰花多肽组分微波辅助提取方法所提取的西兰花 多肽粗提物组分分离及活性测定方法，其特征在于，包括以下步骤:S600:取西兰花多肽粗提物l-3ml加样到Sephadex G-25凝胶过滤色谱仪(16mmX 1000mm)，以蒸馏水进行洗脱，流速lmL ? mirT1，用蛋白核酸检测仪进行监测，波长280nm，收 集各洗脱峰；S700:取西兰花多肽各组分体积100微升，放于试管中，加入5ml的考马斯亮蓝溶液，震 荡摇匀，静置lOmin后，于595nm处测西兰花多肽各组分的吸光度值；S800:取西兰花多肽各分离组分样品液或对照蒸馏水与0.05mol ? 1/^11 = 8.2 Tris-HC1缓冲液混合于试管中，放在25°C的恒温水浴中20min，加入一定量邻苯三酚溶液，震荡混 匀，测量吸光度值，计算各分离组分对超氧阴离子自由基的清除率。
【文档编号】G01N30/14GK106053191SQ201610333006
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年5月18日
【发明人】徐俊杰, 吕士杰, 李妍, 朱文赫, 张巍, 芦晓晶, 刘洋
【申请人】吉林医药学院