专利名称：一种用于检测脂肪氧合酶活性的方法
技术领域：
本发明涉及一种用于检测脂肪氧合酶活性的方法，具体说是一种用辣根过氧化物酶电极 来检测脂肪氧合酶活性的方法。
背景技术：
目前为止，已公开报道的测定脂肪氧合酶活性方法包括氧电极法、量压法、分光光度法、
Fe(CNS)3显色法、硫代巴比妥酸显色法、同位素标记法等，各种方法的测定原理和测定参数
不同，具有各自不同的优缺点。氧电极法灵敏度高，测定参数与反应体系浊度无关，但需要严 格控制反应系统的温度和气密性。量压法测定参数与反应体系浊度无关，但由于测定时需不 断振动反应瓶以保持底物的乳化，酶活性大小会因振动而部分损失，且必须严格控制体系温 度的恒定和气密性。分光光度法灵敏度高，操作简便，但受体系浊度影响，必须把底物浓度
稀释很多倍才能测量，不能反映底物真实状态下的酶活，且不便于跟踪反应的进程。Fe(CNSh 显色法中Fe(CNS)3不稳定，而且呈现的吸光度与生成的Fe(CNS)3量之间缺乏良好的线性关 系。硫代巴比妥酸显色法的吸光度可连续测定，但受F^+、 Fe2+、 C^+等离子干扰。同位素标 记法的放射强度可跟踪反应的进程，但价格昂贵，操作不便。
本发明采用生物酶电极来测量脂肪氧合酶活性。生物酶电极的原理是把酶固定在电化学 电极的表面上制成酶电极，利用酶在生化反应中能够发生特殊的催化作用，将反应过程中消 耗或产生的化学物质用转换器转变成电信号再记录下来。
脂肪氧合酶可以催化不饱和脂肪酸中含双顺式1，4-戊二烯结构，通过分子加氧，形成过 氧化氢衍生物。辣根过氧化酶修饰电极检测有机过氧化物的原理如下辣根过氧化酶与ROOH 基团发生催化氧化反应，HRP被氧化后还原为原始状态时，还原电流与有机过氧化物的浓度 成比例。由于辣根过氧化酶修饰的电极可以定量测定有机过氧化物的浓度，因此本实验采用 辣根过氧化酶修饰的电极测量脂肪氧合酶活性。结果表明，这种方法具有响应速度快，与体 系的浊度无关，可在线测量的特点。
发明内容
本发明的目的在于一种用于检测脂肪氧合酶活性的方法，具体说是一种用辣根过氧化物 酶电极来检测脂肪氧合酶活性的方法。
本发明的设计思想是利用脂肪氧合酶可以催化不饱和脂肪酸中含双顺式1,4-戊二烯结 构，通过分子加氧，形成有机过氧化物。由于辣根过氧化物酶可催化脂肪酸氢过氧化物裂解 形成低分子量物质，如己醛等，因此可以采用辣根过氧化酶测量脂肪氧合酶活性。将辣根过 氧化酶制备成生物传感器，利用其响应速度快，与体系的浊度无关，可在线测量的特点，可 定量测量脂肪氧合酶活性。本发明的技术方案是这样实现的
1)将0.1 1.0mLTween20分散于10mL0.2 1.5mol/L的硼酸盐缓冲液中，摇动下逐滴加入 0.1 1.0mL亚油酸，充分混合，加入lmol/L的盐酸调PH至9.0，然后将上述缓冲液稀释到500mL，
作为底物待用。测定前，将脂肪氧合酶溶解在底物中，作为电解液。
2) 将一定量的聚丙烯酸酯预聚体，在避光条件下用有机溶剂配制成溶液，再与酶溶液等 体积混合，搅拌均匀制成混合溶液，滴涂在电极表面，在;i^下经可见光照射0.1h 3h使聚合 物预聚体发生聚合，得到光固定化辣根过氧化物酶电极。
3) 所有电化学实验均采用三电极系统，螺旋的铂丝作辅助电极，饱和甘汞(SCE)电极为 参比电极，辣根过氧化物酶修饰电极为工作电极；在进行电化学实验前，溶液用高纯氮除氧 至少30min。
在上述内容的基础上，酶活力效价测定的具体步骤包括
1) 将已知酶活的脂肪氧合酶标准样品溶液、底物溶液在10 40。C水浴箱中恒温IO分钟；然后
把60mL底物溶液放置于电解池中。
2) 将脂肪氧合酶标准样品溶液lmL加入放有底物溶液的电解池中，置10 4(TC水浴箱反应3 分钟。
3) 将螺旋的铂丝作辅助电极，饱和甘汞(SCE)电极为参比电极，辣根过氧化物酶修饰电极为 工作电极，在电压为-0.4 -0.1V开始测量其电流值。
4) 将不同浓度的标准样品所得的电流值对浓度做图，为标准曲线。
5) 取待测脂肪氧合酶样品，重复过程l-3，所得值与标准曲线对照，可知其酶活。
本发明由于采用了上述技术方案，具有以下优点
1) 本发明利用聚丙烯酸酯将辣根过氧化酶固定在玻碳电极和石墨电极表面，形成稳定的 辣根过氧化酶-聚丙烯酸酯修饰电极。在聚丙烯酸酯中，辣根过氧化酶可以直接与电极之间传 递电子，因此此方法不受溶液浊度的影响。
2) 此方法可以跟踪反应进程，很方便地考察反应的动力学过程。
具体实施例方式
实施例1大豆中脂肪氧合酶酶活的测定
1) 大豆经粉碎后经石油醚9次浸提得到脱脂大豆粉(40目过筛)。脱脂豆粉加水(料液 比为1 : 10 (w/v))并用lmol/L盐酸调至pH4.5，搅拌60min，过滤；滤液中加入固体硫酸 铵至40%饱和，离心分离20min，弃去沉淀；上清液中加入固体硫酸铵至60%饱和，离心分 离20min，沉淀用pH9.0， 0.2 mol/L的硼酸盐缓冲液溶解得到脂肪氧合酶酶液。
2) 将0.1mUTween20分散于10mL0.2mol/L的硼酸盐缓冲液中，摇动下逐滴加入O.lmL亚油 酸，充分混合，加入lmol/L的盐酸调PH至9.0，然后将上述缓冲液稀释到500mL，作为底物待 用。
3) 将0.5g的聚丙烯酸酯预聚体，在避光条件下用10g质量分数比为1:2的正丁醇:丙酮 有机溶剂配制成溶液，再与质量分数为5%的辣根过氧化物酶水溶液等体积混合，搅拌均匀成混合溶液。取混合溶液滴涂在玻碳电极表面，在25°C下可见光照射O.lh使聚合物预 聚体发生聚合，得到光固定化辣根过氧化物酶修饰电极。
4) 将已知酶活的脂肪氧合酶标准样品溶液、底物溶液在1(TC水浴箱中恒温10分钟；然 后把60mL底物溶液放置于电解池中。
5) 将脂肪氧合酶标准样品溶液lmL加入放有底物溶液的电解池中，置1(TC水浴箱反应 3分钟。
6) 将螺旋的铂丝作辅助电极，饱和甘汞(SCE)电极为参比电极，辣根过氧化物酶修饰电 极为工作电极，采用德国ZAHNER公司IM6电化学工作站，应用Thales syste 2000电化学 软件，在电压为-0.4V开始测量其电流值。
7) 将不同浓度的标准样品所得的电流值对浓度做图，为标准曲线。
8) 取待测的大豆脂肪氧合酶样品，重复过程4-6，所得电流值与标准曲线对照，可知其 酶活。
实施例2番茄中脂肪氧合酶酶活的测定
1) 番茄经粉碎加水(料液比为1 : 10 (w/v))并用1 mol/L盐酸调至pH 4.5，搅拌60 min， 过滤；滤液中加入固体硫酸铵至40%饱和，离心分离20min，弃去沉淀；上清液中加入固体 硫酸铵至60%饱和，离心分离20min，沉淀用pH9.0， 0.2 mol/L的硼酸盐缓冲液溶解得到脂 肪氧合酶酶液。
2) 将1.0mLTween20分散于10mL 1.5mol/L的硼酸盐缓冲液中，摇动下逐滴加入1.0mL亚油 酸，充分混合，加入lmol/L的盐酸调PH至9.0，然后将上述缓冲液稀释到500mL，作为底物待 用。
3) 将0.5g的聚丙烯酸酯预聚体，在避光条件下用10g质量分数比为1:2的正丁醇:丙酮 有机溶剂配制成溶液，再与质量分数为5%的辣根过氧化物酶水溶液等体积混合，搅拌均匀制 成混合溶液。取10pl混合溶液滴涂在玻碳电极表面，在25。C下可见光照射3h使聚合物预聚 体发生聚合，得到光固定化辣根过氧化物酶修饰电极。
4) 将已知酶活的脂肪氧合酶标准样品溶液、底物溶液在4(TC水浴箱中恒温10分钟；然 后把60mL底物溶液放置于电解池中。
5) 将脂肪氧合酶标准样品溶液lmL加入放有底物溶液的电解池中，置40'C水浴箱反应 3分钟。
6) 将螺旋的铂丝作辅助电极，饱和甘汞(SCE)电极为参比电极，辣根过氧化物酶修饰电 极为工作电极，采用德国ZAHNER公司IM6电化学工作站，应用Thales syste 2000电化学 软件，在电压为-0.1V开始测量其电流值。
7) 将不同浓度的标准样品所得的电流值对浓度做图，为标准曲线。
8) 取待测的番茄脂肪氧合酶样品，重复过程4-6，所得电流值与标准曲线对照，可知其 酶活。实施例3 土豆中脂肪氧合酶酶活的测定
1) 土豆经粉碎加水(料液比为1 : 10 (w/v))并用1 mol/L盐酸调至pH 4.5，搅拌60 min， 过滤；滤液中加入固体硫酸铵至40%饱和，离心分离20min，弃去沉淀；上清液中加入固体 硫酸铵至60%饱和，离心分离20min，沉淀用pH9.0， 0.2 mol/L的硼酸盐缓冲液溶解得到脂 肪氧合酶酶液。
2) 将0.5mLTween20分散于10mL1.0mol/L的硼酸盐缓冲液中，摇动下逐滴加入0.5mL亚油 酸，充分混合，加入lmol/L的盐酸调PH至9.0，然后将上述缓冲液稀释到500mL，作为底物待 用。
3) 将0.5g的聚丙烯酸酯预聚体，在避光条件下用10g质量分数比为1:2的正丁醇:丙酮 有机溶剂配制成溶液，再与质量分数为5%的辣根过氧化物酶水溶液等体积混合，搅拌均匀制 成混合溶液。取1(^1混合溶液滴涂在玻碳电极表面，在25°C下可见光照射lh使聚合物预聚 体发生聚合，得到光固定化辣根过氧化物酶修饰电极。
4) 将已知酶活的脂肪氧合酶标准样品溶液、底物溶液在20'C水浴箱中恒温10分钟；然 后把60mL底物溶液放置于电解池中。
5) 将脂肪氧合酶标准样品溶液lmL加入放有底物溶液的电解池中，置2(TC水浴箱反应 3分钟。
6) 将螺旋的铂丝作辅助电极，饱和甘汞(SCE)电极为参比电极，辣根过氧化物酶修饰电 极为工作电极，采用德国ZAHNER公司IM6电化学工作站，应用Thales syste 2000电化学 软件，在电压为-0,2V开始测量其电流值。
7) 将不同浓度的脂肪氧合酶标准样品溶液所得的电流值对浓度做图，为标准曲线。
8) 取待测的土豆脂肪氧合酶样品，重复过程4-6，所得电流值与标准曲线对照，可知其 酶活。
权利要求
1. 一种用于检测脂肪氧合酶活性的方法。其特征在于将已知酶活的脂肪氧合酶标准样品溶液、底物溶液在10～40℃水浴箱中恒温10分钟；然后把60mL底物溶液放置于电解池中。将底物溶液1mL加入放有底物溶液的电解池中，置10～40℃水浴箱反应3分钟。将螺旋的铂丝作辅助电极，饱和甘汞(SCE)电极为参比电极，辣根过氧化物酶修饰电极为工作电极，在电压为-0.4～-0.1V开始测量其电流值。将不同浓度的标准样品所得的电流值对浓度做图，为标准曲线。取待测脂肪氧合酶样品，重复前面过程，所得值与标准曲线对照，可知其酶活。
2. 根据权利要求1所述的用于检测脂肪氧合酶活性的方法，其特征在于将0.1~1.0mL Tween20分散于10mL 0.2-1.5mol/L的硼酸盐缓冲液中，摇动下逐滴加入0.1~1.0mL亚油 酸，充分混合，加入lmol/L的盐酸调PH至9.0，然后将上述缓冲液稀释到500mL，作为 底物待用。
3. 根据权利要求1所述的用于检测脂肪氧合酶活性的方法，其特征在于电化学测定前，将 已知酶活的脂肪氧合酶标准样品溶液、底物溶液在10 4(TC水浴箱中恒温10分钟。
4. 根据权利要求1所述的用于检测脂肪氧合酶活性的方法，其特征在于电化学测定前，将 底物溶液lmL加入放有底物溶液的电解池中，置10 40'C水浴箱反应3分钟，作为电解 液。
5. 根据权利要求1所述的用于检测脂肪氧合酶活性的方法，其特征在于电化学测量时，采 用三电极系统，辣根过氧化物酶修饰电极为工作电极。
6. 根据权利要求1所述的用于检测脂肪氧合酶活性的方法，其特征在于在电压为-0.4 -0.1V时测量其电流值。
全文摘要
本发明涉及一种用于检测脂肪氧合酶活性的方法。将已知酶活的脂肪氧合酶标准样品溶液、底物溶液在10～40℃水浴箱中恒温10分钟；然后把60mL底物溶液放置于电解池中，将脂肪氧合酶标准样品溶液1mL加入放有底物溶液的电解池中，置10～40℃水浴箱反应3分钟。将螺旋的铂丝作辅助电极，饱和甘汞(SCE)电极为参比电极，辣根过氧化物酶修饰电极为工作电极，在电压为-0.4～-0.1V开始测量其电流值。将不同浓度的标准样品所得的电流值对浓度做图，为标准曲线。取待测脂肪氧合酶样品，重复前面过程，所得值与标准曲线对照，可知其酶活。结果表明，这种方法具有响应速度快，与体系的浊度无关，可在线测量的特点。
文档编号G01N27/416GK101419188SQ20071016795
公开日2009年4月29日 申请日期2007年10月25日 优先权日2007年10月25日
发明者仁 刘, 许芳萍, 伟 顾, 高海燕 申请人:江南大学