专利名称：纸材料制造中的氧化酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及脂肪酸氧化酶在纸材料制造中的用途以及制造纸材料的方法，该方法包括用脂肪酸氧化酶处理造纸浆(papermaking pulp)和/或造纸生产用水(process water)的步骤。
背景技术：
纸材料制造中使用酶是众所周知的，为此目的所使用的酶的实例有蛋白酶、脂肪酶、木聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶，以及诸如氧化还原酶(酚氧化酶)的各种氧化酶，例如漆酶和过氧化物酶。
这些酶的效果是普遍的，例如可用于控制诸如沥青(pitch)沉积、改进强度、脱墨、改进排水、软化薄页纸和漂白等。
在造纸法中，在生产纸浆和纸的过程中，将溶解的和胶态的物质(DCS)分散在生产用水中。DCS经常是指木沥青或木树脂。沥青粘附在辊上使造纸机产生问题，并在纸材料中生成斑点或孔。
木材除了包括主要成分纤维素、半纤维素和木质素外，还包括约1-10％的沥青或各种萃取物(extractive)。沥青的主要成分是脂肪酸、甘油三酯、甾醇、甾酯(steryl esters)和所谓的树脂酸，例如松香酸。
WO 00/53843公开了某些甾酯酶制剂和它们在造纸中水解掉沥青中甾酯部分的应用。
美国专利6,066,486公开了包括衍生于莓实假单胞菌(Pseudomonas fragi)的胆甾醇酯酶的酶制剂及其水解纸浆树脂的用途。
JP 2000080581公开了某些过氧化物酶在制浆或造纸方法中分解松香酸的用途。
X.Zhang在Pulp & Paper Canada，1013(2000)，59-62页中公开了对例如漆酶除去溶解的和胶态的物质的能力的研究。
而且，Karlsson等人在Reactivity of Trametes Laccases With Fatty andResin Acids；Appl.Microbiol.Biotechnol.(2001)55317-320中公开了使用漆酶处理沥青试样(model pitch)制剂的实验。
然而，上述文献没有一个公开了本文所定义的脂肪酸氧化酶在纸材料制造中的用途。
发明概述本发明的发明者出乎意料地发现一些氧化酶，即脂肪酸氧化酶，有利于用在纸材料制造中。这些酶的一个重要效果是能减少沥青的沉积；而且，这些酶具有对浆和所生成的纸材料进行漂白的效果；最后，也观察到这些酶具有脱墨效果。
发明详述纸和纸桨术语“造纸法(paper-making processs)”是指一种方法，其中将纸浆悬浮于水中，与各种添加剂混合，然后送至设备中，在这些设备中形成纸、纸板、薄页纸和毛巾纸等，然后挤压并干燥。
术语“纸材料(paper material)”是指能从纸浆中制备的产品，例如纸、挂面纸板(linerboard)、瓦楞纸板、薄页纸、毛巾纸、瓦楞纸箱或盒。
术语“造纸浆(paper-making pulp)”或“纸浆(pulp)”是指能用作生产纸材料的任何纸浆。例如，纸浆可供应成原浆或者来自于可再生的来源。造纸浆可以是木浆，非木浆或由废纸制成的浆。木浆可由诸如松树(pine)、红木(redwood)、冷杉(fir)、云杉(spruce)、雪松(cedar)和铁杉(hemlock)的针叶木制成，或由诸如枫木(maple)、桤木(alder)、桦树(birch)、胡桃树(hickory)、山毛榉(beech)、白杨(aspen)、金合欢树(acacia)和桉树(eucalyptus)的阔叶木制成。非木浆可由，例如从蔗渣、竹、棉花或洋麻制成。废纸浆可由再制桨的废纸制成，例如报纸、混合的办公室废纸、计算机打印纸、白账簿、杂志、牛奶包装盒和纸杯等。
在一个具体实施方案中，所要处理的造纸浆包括阔叶木浆和针叶木浆。
所要处理的木浆可以是机械浆(例如磨木浆(GP))、化学浆(例如Kraft浆或亚硫酸盐浆)、半化学浆(SCP)、热法机械浆(TMP)、化学热磨机械浆(CTMP)或漂白的化学热磨机械浆(BCTMP)。
机械浆是通过研磨和精制的方法制成的，其中原料用周期性的压力脉冲处理。TMP是热法机械浆，GW是磨木浆，PGW是压力磨木浆，RMP是盘磨机械浆，PRMP是压力盘磨机械浆，CTMP是化学热磨机械浆。
化学浆是通过碱蒸煮，清除大部分木质素和半纤维素而制成的。在Kraft制桨或硫酸盐蒸煮中，用硫化钠或氢氧化钠作为主要蒸煮用化学物质。在这些纸浆类型中，作为碱蒸煮的结果，沥青的甘油三酯部分将会被水解成脂肪酸和甘油。脂肪酸氧化酶特别适用于处理这些纸浆，这是因为如其名称所述，这些酶将进一步催化分解由甘油三酯碱解生成的脂肪酸。
所要处理的Kraft浆可以是漂白的Kraft浆，其可以包括针叶木漂白的Kraft(SWBK，也称为NBKP(Nadel Holz Bleached Kraft Pulp))、阔叶木漂白的Kraft(HWBK，也称为LBKP(Laub Holz Bleached Kraft Pulp))或其混合物。
本发明方法中使用的纸浆是机械或化学浆或其组合的悬浮液。例如，本发明方法中使用的纸浆可包括0％，10-20％，20-30％，30-40％，40-50％，50-60％，60-70％，70-80％，80-90％或90-100％的化学浆。在一个具体的实施方案中，化学浆构成部分用于制造纸材料所用的纸浆。在此处的上下文中，“构成部分”是指在本发明方法所要使用的纸浆中，化学浆所占的百分比在1-99％的范围内。在具体实施方案中，化学浆所占的百分比在2-98％，3-97％，4-96％，5-95％，6-94％，7-93％，8-92％，9-91％，10-90％，15-85％，20-80％，25-75％，30-70％，40-60％或45-55％范围内。
在本发明用途和方法的具体实施方案中，化学浆是Kraft浆、亚硫酸盐浆、半化学浆(SCP)、热法机械浆(TMP)、化学热磨机械浆(CTMP)、漂白的化学热磨机械浆(BTMP)。在具体的实施方案中，Kraft浆是漂白的Kraft浆，例如针叶木漂白的Kraft(SWBK，也称为NBKP(Nadel Holz Bleached Kraft纸浆))、阔叶木漂白的Kraft(HWBK，也称为LBKP(Laub Holz Bleached KraftPulp))或其混合物。
工艺条件本发明方法特别适用于在制桨或造纸法工艺中氧化和水解构成沥青的化合物，这样做是为了例如避免沥青问题。
本发明方法可应用到任何含沥青的纸浆，特别可应用到含有大量亚油酸或其它不饱和游离脂肪酸的纸浆。
在加工纸和纸浆的情况下，可在纸浆生产的任何阶段运行本发明的方法。酶可加至任何保持器(holding tank)，例如储浆器(贮槽(chest))、储存塔、混合槽或计量槽。酶处理可在纸浆漂白之前、与纸浆漂白过程一起或在漂白之后进行。当与纸浆漂白一起进行时，可连同漂白用化学物质，例如氯和二氧化氯一起加入酶制剂。施加氧、过氧化氢或臭氧或其结合也可漂白纸浆。也可连同这些物质一起加入酶制剂。优选在漂白前加入酶制剂。也可将酶加入源于漂白的循环生产用水(白水)和源于机械或化学机械制浆过程的生产用水(褐色水(brown water))。在Kraft制浆方法的具体实施方案中，在粗液洗涤过程中加入酶。
在此处的上下文中，“生产用水”包括1)作为原料加入造纸法中的水；2)在制造纸材料方法的任何步骤中生产的中间水产品；3)作为方法的输出或副产品的废水。在具体实施方案中，生产用水是、已经是、现在是或将是循环的(再循环的)，即在该方法的另一步骤中再使用。术语“水”也指任何水性介质、溶液、悬浮液，例如普通的自来水以及自来水与造纸法中常用的各种添加剂和佐剂的混合物。在一个具体实施方案中，生产用水含有低含量的固态(干)物质，例如低于20％，18％，16％，14％，12％，10％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％或低于1％干物质。
本发明的用途和方法不包括PCT/DK02/00251的实施例2所述的、衍生于用于漂白纸浆工业的废水中的染料的Magnaporthe salvinii的脂肪氧合酶的用途。
本发明的方法可以在纸和纸浆加工的常规条件下进行。工艺条件将是所施加的酶、反应时间和给定条件的函数。
本发明的酶应当以有效的量加入。所谓的“有效的量”是指该量足以获得所需和所期待的效果，例如氧化沥青组分、获得所需漂白和/或脱墨等效果。
在一个具体的实施方案中，脂肪酸氧化酶和其它酶(如果有的话)的剂量是每吨纸浆加入0.1mg酶蛋白至100.000mg酶蛋白(各种酶)。
在另一个具体实施方案中，脂肪酸氧化酶和其它酶(如果有的话)的量在0.00001-20范围内，或每克木质纤维材料(干重)0.0001-20mg酶(以纯酶蛋白计算)，例如每克木质纤维材料0.0001-10mg/g，0.0001-1mg/g，0.001-1mg/g，0.001-0.1mg/g或0.01-0.1mg/g的酶。再次说明，这些量是指各种酶的量。
可以在常规浓度(consistency)下进行酶处理，例如0.5-10％干物质。在具体实施方案中，浓度在0.5-45；0.5-40；0.5-35；0.5-30；0.5-25；0.5-20；0.5-15；0.5-10；0.5-8；0.5-6或0.5-5％干物质范围内。
酶处理可以在约10℃至100℃的温度下进行。其它温度范围(均为“从约”和“至约”)的实例如下20-100，30-100，35-100，37-100，40-100，50-100，60-100，70-100，10-90，10-80，10-70，10-60和30-60℃以及此处说明的上限和下限的任何组合。通常温度在约20-90℃或约20-95℃，优选约40-70℃或约40-75℃。
酶处理可以在约2至约12的pH值下进行。其它pH范围(均为“从约”和“至约”)的实例如下3-12，4-12，5-12，6-12，7-12，8-12，9-12，2-11，2-10，2-9，2-8，4-10和5-8以及此处说明的上限和下限的任何组合。通常pH在约2-11范围内，优选在约4-9.5或约6-9的范围内。
酶处理的合适持续时间可以为数秒到数小时，例如约30秒至约48小时，或约1分钟至约24小时，或约1分钟至约18小时，或约1分钟至约12小时，或约1分钟至约5小时，或约1分钟至约2小时，或约1分钟至约1小时，或约1分钟至约30分钟。通常反应时间为约10分钟至3小时，10分钟至10小时，优选为15分钟至1小时或15分钟至2小时。
如需要的话，空气中的分子氧将通常以足够的量存在。因此，反应可以方便地在开放式系统，即常压下进行。
除脂肪酸氧化酶和其它酶(如果有的话)之外，各种添加剂也可用在本发明用途或方法中。因为表面活性剂和/或分散剂存在和/或被添加至造纸浆中，所以本发明方法和用途可以在造纸浆中常规使用的阴离子、非离子、阳离子和/或两性离子(zwitterionic)表面活性剂和/或分散剂存在下进行。阴离子表面活性剂的实例是烷基、取代烷基或芳基的羧酸盐、硫酸盐、磺酸盐或磷酸盐。脂肪酸是烷基羧酸盐的实例。非离子表面活性剂的实例是聚氧乙烯化合物，例如醇乙氧基化物、丙氧基化物或混合的乙氧基/丙氧基化物、聚甘油和其它多元醇以及一些嵌段共聚物。阳离子表面活性剂的实例是例如硫酸季铵盐和某些胺的水溶性阳离子聚合物，例如表氯醇/二甲基胺聚合物(EPI-DMA)及其交链溶液的胺、聚二烯丙基二甲基氯化铵(DADMAC)、DADMAC/丙烯酰胺共聚物和例如美国专利5,681,862和5,575,993公开的紫罗烯聚合物。两性离子或两性表面活性剂的实例是甜菜碱、氨基乙酸盐、氨基丙酸盐、亚氨基丙酸盐和各种咪唑啉衍生物。也可以使用美国专利5,256,252中公开的聚合物。
根据本发明，表面活性剂，例如上述的表面活性剂及其任意组合也可以与本文所定义的脂肪酸氧化酶一起使用，并且与这种酶一起包括在组合物中。组合物中各种表面活性剂的量可以为组合物的约8至约40％(w/w)。在具体实施方案中，各种表面活性剂的量在约10至38，或约12至36，或约14至34，或约16至34，或约18至34，或约20至34，或约22至34，或约24至34，或约26至34，或约28至32％(w/w)。
在另一个具体实施方案中，上述的各个范围是指表面活性剂总量。酶EC编号(EC-number)可用于酶分类，例如脂肪酶EC编号用于含有脂肪酶活性的酶。请参考Recommendations(1992) of the Nomenclature Committeeof the International Union of Biochemistry and Molecular Biology，AcademicPressInc.，1992。
应当理解本文中的术语“酶”，以及各种酶和酶种类包括野生型酶，及其保留活性的变体(variant)。这些变体可通过重组技术(recombinant technique)生成。野生酶也可由重组技术或从天然物质中分离和提纯得到。
在一个具体实施方案中，所述的酶具有明确的定义，这是指只有一个主要的酶组分存在。这可通过在合适的尺寸排除柱上分馏得到。可以得获得这些定义明确的或提纯的或高度提纯的酶，如本领域公知的和/或与所述具体酶相关的出版物所述的。
脂肪酸氧化酶术语“一种”脂肪酸氧化酶是指至少一种这样的酶。术语“至少一种”是指一种、两种、三种、四种、五种、六种或甚至更多种这样的酶。
在此处的上下文中，脂肪酸氧化酶是比水解基质丁香醛连氮(syringaldazine)更有效地水解亚油酸的酶。“更有效”是指具有更高的反应速率。测定可使用实施例2所述的方法，并计算(1)基质亚油酸(吸光度在234nm)上每分钟吸光度(absorbancy)的增加量和(2)基质丁香醛连氮(吸光度在530nm)上每分钟吸光度的增加量之间的差，即计算反应速率差(ReactionRate difference，RRD)＝(d(A234)/dt-d(A530)/dt)。如果RRD大于零，则所述的酶适合为此处定义的脂肪酸氧化酶。如果RRD为零或小于零，则所述的酶并非脂肪酸氧化酶。
在具体实施方案中，RRD为至少0.05，0.10，0.15，0.20或至少0.25吸光度单位/分钟。
在实施例2方法的具体实施方案中，酶是明确定义的。更进一步，在实施例2的方法中，调节酶的剂量以在234nm或530nm上获得每分钟最大吸光度增加量。在具体实施方案中，最大吸光度增加量在0.05-0.50；0.07-0.4；0.08-0.3；0.09-0.2或0.10-0.25吸光度单位/分钟范围内。酶的剂量，例如可以在0.01-20；0.05-15或0.10-10mg酶蛋白/毫升的范围内。
另外，“脂肪酸氧化酶”可定义为能够比丁香醛连氮更有效氧化不饱和脂肪酸的酶。可以在包括丁香醛连氮或亚油酸作为基质以及pH为6和温度为30℃的情况下，在本实施例1中所述的标准血氧计装置中比较得到酶的活性。
在具体实施方案中，脂肪酸氧化酶定义成分类为EC 1.11.1.3或EC1.13.11.-的酶，其中EC 1.13.11.-是指其子类中任何的酶，目前有49种EC1.13.11.1-EC 1.13.1 1.49。EC 1.11.1.3是指定的脂肪酸过氧化物酶，EC1.13.11.-是指通过并入两个氧原子作用在单个供体上的指定的氧合酶。
在另一个具体实施方案中，EC 1.13.11.-酶被为成EC 1.13.11.12，EC1.13.11.31，EC 1.13.11.33，EC 1.13.11.34，EC 1.13.11.40，EC 1.13.11.44或EC 1.13.11.45类，分别为指定的脂肪氧合酶、花生四烯酸酯12-脂肪氧合酶(arachidonate 12-lipoxygenase)、花生四烯酸酯15-脂肪氧合酶、花生四烯酸酯5-脂肪氧合酶、花生四烯酸酯8-脂肪氧合酶、亚油酸酯二醇合成酶(linoleate diol synthase)和亚油酸酯11-脂肪氧合酶。
在另一个具体实施方案中，脂肪酸氧化酶是分类为EC1.13.11.12的脂肪酸氧合酶(LOX)，该酶催化聚合不饱和脂肪酸，特别是例如亚油酸的顺，顺-1，4-二烯的氧化作用并且生成过氧化氢的酶。但是其它的基质也可能被氧化，例如单不饱和脂肪酸。
微生物脂肪氧合酶(Microbial lipoxygenase)可衍生于，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，普通高温放线菌(Thermoactinomyces vulgaris)，尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)，串珠镰刀菌(Fusarium proliferatum)，Thermomyces lanugmosus，Pyricularia oryzae和Geotrichum菌株。WO02/20730的实施例3-4中描述了衍生于Gaeumannomyces graminis的脂肪氧合酶制剂；PCT/DK02/00251的实施例2中描述了在衍生于Magnaporthesalvinii的脂肪氧合酶的米曲霉(Aspergillus oryzae)里的表达式，并且该酶能够使用标准方法，如WO 02/20730的实施例4中所述的方法来提纯。
脂肪氧合酶(LOX)可以从植物种子，例如大豆、豌豆、鹰嘴豆和菜豆中提取。另外，脂肪氧合酶可以从哺乳动物细胞，例如兔网状细胞中获得。
通过检测氢过氧化物的形成，可以在25℃下公共分光光度计确定脂肪氧合酶活性。对标准分析而言，将10微升酶加入含有980微升的25mM磷酸钠缓冲剂(pH7.0)和10微升基质溶液(分散在0.2％(v/v)Tween20中的10mM亚油酸(不能过长时间保存))的石英比色杯中。通常，充分稀释酶确保以开始(first minute)时，所加的基质具有最大10％的翻转(turn-over)。得到在234nm的吸光度，然后从所获曲线的线性部分估算速率。顺-反-共轭羟基(过氧化氢)脂肪酸被认为具有23,000M-1cm-1的分子消光系数。
脂肪酸氧化酶也可以和对酶来说能够增强其酶效应的基质一起加入。合适的基质是水解的油，例如来自大豆(富含亚油酸)或松浆油的油。可以通过脂解酶从加入的油中释放或者在Kraft制桨或硫酸盐蒸煮中产生的脂肪酸基质。
在具体实施方案中，基质是具有1，4-戊二烯结构，例如顺，顺-1，4-戊二烯结构的化合物，即其结构式内含有至少这种结构的化合物。此类基质的实例是不饱和脂肪酸，例如棕榈油酸、油酸、亚油酸、亚麻酸和花生四烯酸及其盐和酯，例如甲酯和乙酯。
在其它具体实施方案中，基质是亚油酸、亚油酸甲或乙酯、亚麻酸或亚麻酸甲或乙酯。
为研究加入基质对所述脂肪酸氧化酶的效果，可使用下述方法记录(乳化在0.2％Tween20中的)10mM松香酸的光谱，在200nm附近和250nm附近观察到特征峰。在第一个实验中，将脂肪酸氧化酶加入松香酸乳剂中；在第二个实验中，也加入脂肪酸氧化酶基质。酶例如是上述的衍生于M.salvinii的脂肪氧合酶；基质例如是亚油酸。用分光光度测定技术跟踪松香酸的分解，当一起加入亚油酸和脂肪氧合酶时，发现在200nm附近和250nm附近的峰很快降低。
在本发明上述方法和过程的具体实施方案中，基质，例如亚油酸的加入量是5-10000ppm(mg/l)或10-9000、10-8000、25-7500、30-7000、50-6000、50-5000、50-4000、75-3000、75-2500、80-2000、90-1500、100-1000、150-800或200-700ppm。在实施例4中，与脂肪酸氧化酶一起加入333ppm的亚油酸。
在本发明上述方法和过程的其它具体实施方案中，脂肪酸氧化酶的加入量是0.005-50ppm(mg/l)或0.01-40、0.02-30、0.03-25、0.04-20、0.05-15、0.05-10、0.05-5、0.05-1、0.05-0.8、0.05-0.6或0.1-0.5ppm。酶的量指的是明确定义的酶制剂的mg。
在本发明方法中，可以单独施加或结合其它酶一起施加脂肪酸氧化酶。术语“其它酶”是指至少一种其它的酶，例如一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或甚至更多种其它的酶。
术语“一起施加(一起使用)”是指可以在本发明方法的同一步骤或其它步骤中施加其它酶。其它方法步骤可以是造纸法中上游或下游的步骤，相对于用脂肪酸氧化酶处理造纸浆或生产用水的步骤而言。
在具体实施方案中，其它酶是具有蛋白酶、脂肪酶、木聚糖酶、角质蛋白酶(cutinase)、氧化还原酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶(endoglucanase)、淀粉酶、甘露聚糖酶(mannanase)、甾酯酶(steryl esterase)和/或胆甾醇酯酶活性的酶。氧化还原酶的实例是具有漆酶和/或过氧化物酶活性的酶。在优选的实施方案中，其它酶是脂肪酶。
方法中“步骤”是指至少一个步骤，其可能是一个、两个、三个、四个、五个或更多方法步骤。换句话说，可以在至少一个步骤中施加本发明的脂肪酸氧化酶，相对于加入脂肪酸氧化酶的步骤而言，该步骤可以是相同的或不同的步骤。
术语“酶制剂”是指包含至少一种脂肪酸氧化酶的产品。酶制剂也可以包括含有其它酶添加剂的酶，优选为脂解酶或含有氧化还原酶活性的酶，最优选为脂解酶。除了酶活性之外，此类制剂优选包含至少一种佐剂。用在纸和纸浆工业的酶制剂中佐剂的实例是缓冲剂、聚合物、表面活性剂和稳定剂。
其它酶任何具有蛋白酶、脂肪酶、木聚糖酶、角质蛋白酶、氧化还原酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、淀粉酶、甘露聚糖酶、甾酯酶和/或胆甾醇酯酶活性的酶可用作本发明用途和方法的其它酶。在下述一些非限制性实施例中列出了这些其它酶。用大写英文字母表示的酶是可从丹麦的DK-2880Bagsvaerd，Krogshoejvej 36的Novozymes A/S购买的酶。那些其它酶中的任何一种的活性可以用本领域中公知的方法分析，包括上述引用的文献中的方法。
角质蛋白酶的实例是那些衍生于Humicola insolens(US 5,827,719)、衍生于镰孢菌属(Fusarium)的菌株，例如F.roseumculmorum，或特别是F.solanipisi菌株(WO 90/09446；WO 94/14964，WO 94/03578)的酶。角质蛋白酶也可以衍生于丝核菌属(Rhizoctonia)，例如茄属丝核菌(R.solani)的菌株，或链格孢属(Alternaria)，例如甘蓝链格孢(A.brassicicola)的菌株(WO 94/03578)，或其变体，如WO 00/34450或WO 01/92502中所述的变体。
蛋白酶的实例是ALCALASE、ESPERASE、SAVINASE、NEUTRASE和DURAZYM蛋白酶。其它的蛋白酶衍生于拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)、曲霉属(Aspergillus)、根霉菌属(Rhizopus)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalcalophilus)、蜡状芽孢杆菌(B.cereus)、纳豆芽孢杆菌(B.natto)、B.vulgatus、蕈状芽孢杆菌(B.mycoide)和来自芽孢杆菌属(Bacillus)的枯草杆菌蛋白酶(subtilisins)，特别是如WO 88/03947中所公开的衍生于种(species)拟诺卡氏菌属亚种(Nocardiopsis sp.)和达松维尔拟诺卡氏菌属(Nocardiopsisdassonvillei)及其突变体的那些，如WO 91/00345和EP 415296的那些突变体。
淀粉酶的实例是BAN、AQUAZYM、TERMAMYL和AQUAZYM Ultra淀粉酶。脂肪酶的实例是RESINASE A2X脂肪酶。木聚糖酶的实例是PULPZYME HC半纤维素酶。内切葡聚糖酶的实例是NOVOZYM 613、342和476酶产品。
甘露聚糖酶的实例是Stahlband等人在J.Biotechnol.29(1993)，229-242中所公开的Trichoderma reesei内-β-甘露聚糖酶。
甾酯酶、过氧化物酶、漆酶和胆甾醇酯酶的实例是在本发明背景部分所述的参考文献中公开的那些。氧化还原酶其它的实例是在EP 730641、WO 01/98469、EP 719337、EP 765394、EP 767836、EP 763115和EP 788547所公开的过氧化物酶和漆酶。在此处上下文中，任何时候提到氧化还原酶的酶是指要求或受益于受体(例如氧或过氧化氢)、增强子(enhancer)、介质(mediator)和/或激活剂(activator)的存在，应当考虑包括此类化合物。在EP705327、WO 98/56899、EP 677102、EP 781328和EP 707637中公开了增强子和介质的实例。必要时，通过将氧化还原酶的酶系(例如漆酶或过氧化物酶的酶系)定义成酶和酶的受体、任选的增强子和/或介质的组合，以此进行区别。
本发明有一些具体实施方案，其中脂肪酸氧化酶的用途是减少造纸法中沥青的沉积。用于减少造纸法中沥青沉积的方法，其中该方法包括用包括脂肪酸氧化酶的酶制剂处理纸浆和/或生产用水；优选的方法，其中纸浆是机械浆或化学浆或其组合，例如化学浆。如上所述的方法，其中酶为EC1.13.11类，优选在1.13.11.12类里，优选其中酶衍生于Magnaporthaceae属的菌株，优选为M.salvinii，或Gaeumannomyces属，优选为G.graminis。如上所述的方法，其中所述处理是通过加入用于酶的基质，优选为亚油酸而进行的。如上所述的方法，其中酶制剂包括脂解酶和/或另一种氧化还原酶。如上所述的方法，其中处理是在20-90℃，优选为40-70℃范围内的温度下和/或2-11，优选为4-9.5范围内的pH下进行的，和/或其中处理是在10分钟至3小时内，优选为15分钟至1小时内进行的，和/或其中酶是在0.0001-20mg/g，优选为0.0001-10mg/g，更优选为0.001-1mg/g和最优选为0.01-0.1mg/g范围内的浓度加入的。在上述方法的实施方案中，酶制剂被加到造纸机前面的贮料箱或混合箱中。
此处所述的和要求的发明并非局限于此处所公开的具体实施方案的范围中，其原因在于这些实施方案旨在描述本发明的一些具体方面。等价的实施方案也将包括在本发明的范围内。从以上描述中可知，对本领域的技术人员来说，本发明的各种修改以及此处所示和所述的确实是显而易见的，这些修改也包括在附加的权利要求的范围之内。在冲突的情况下，包括定义在内的本公开将起确定作用。
在此引用各种文献，整体引用其公开作为参考。
实施例实施例1测量亚油酸上脂肪酸氧化酶的活性使用含有TriOxmatic 300氧电极和4毫升标准反应体积的“Oxi 3000Oximeter”(WTW，Weilheim，Germany)。
将10mg亚油酸(10ml60％亚油酸)溶解在1ml乙醇中，然后加入2微升Tween20。从该原料基质溶液中，使用小搅拌棒将50微升加入含有3.85ml缓冲溶液(Britton-Robinson100mM磷酸、乙酸和硼酸；用NaOH调节pH)的反应烧杯中，搅拌使溶液充分混合，将氧电极插入反应烧杯中。加入100微升提纯的酶溶液，即(a)浓度约0.4mg/ml的衍生于Magnaporthe salvinii的脂肪氧合酶；(b)浓度约0.76mg/ml的衍生于Gaeumannomyces的脂肪氧合酶(在最终反应中其约为0.02mg/ml)。这些脂肪氧合酶的制备方法如上所示。反应温度为25℃。测量溶解氧浓度，并以时间(分钟)为函数绘图。酶活性(mg/l/min)计算为加入酶后的曲线的线性部分的斜率。相关时，通过相减以校正基线，这是指如果在加入脂肪酸氧化酶(即，参照物)前，氧气浓度与时间为函数的曲线有大于约0.05O2/ml/min的斜率，则从试样斜率值中减去该斜率。
实验结果如下表1所示。
表1
实施例2脂肪酸氧化酶如下所示，测试四种酶，即两种漆酶和两种脂肪氧合酶。衍生于Polyporus pinsitus的漆酶具有SDS-Page的65kDa MW，IEF的3.5pl，以及在pH5.5下60℃的最佳温度。衍生于Coprinus cinereus的漆酶具有SDS-Page的67-68kDa MW，IEF的3.5-3.8pl，以及在pH7.5下65℃的最佳温度。如WO96/00290和美国专利6,008,029所述，制备和提纯酶。两种脂肪氧合酶衍生于Magnaporthe salvinii和Gaeumannomyces graminis，其制备方法如上所述。
调节酶的剂量以确保在234nm/530nm上获得每分钟最大吸光度增加量，即在0.1-0.25吸光度单位/分钟范围内。
基质溶液将11.65mg亚油酸(60％Sigma)，以及在乙醇中的12.5ml0.56mM丁香醛连氮(Sigma)与去离子水混合，并使总体积添至25ml。
将所要测试的50微升酶制剂转移到含有900微升磷酸钠缓冲剂(50mM，pH7.0)和50微升基质溶液的石英比色杯。将比色杯放入恒温在23℃的分光光度计中，以时间为函数测量234nm和530nm的吸光度。530nm处的吸光度指示丁香醛连氮的分解，而234nm处的吸光度指示亚油酸的分解。在2至4分钟反应时间，即d(A234)/dt和d(A530)/dt的基础上计算以时间函数的吸光度增加量。
结果如下表2所示。在这四种酶中，只有两种脂肪氧合酶适合为此处所定义的脂肪酸氧化酶，这是因为只有这两种酶的RRD＝反应速率差＝(dA234/dt-dA530/dt)大于零。
表2
*这与零活性等同(分析错误)实施例3用脂肪酸氧化酶减少沥青沥青试样制备如下50％亚油酸60％(Sigma L-1626)，20％松香酸(Sigma A9424)，20％油酸(Merck 471)，5％胆甾醇亚油酸酯(Sigma C-0289)，5％橄榄油(Sigma O-1500)，在65℃下搅拌30分钟，在冰箱中保存不超过30天。
制备0.1％沥青悬浮液50mg沥青试样，1ml乙醇，
1ml0.1MNaOH，48ml缓冲剂(50mM硼酸盐pH9.0)，在室温下搅拌10分钟。
将圆形纸片(直径＝5.5-6mm；Multicopy80g/m2)转移到指定为A和B的两个96孔的微量滴定板(来自NUNC的ID 269620)的孔中。也使用其它两个类似的微量滴定板C和D，但没有纸片。将100微升的0.1％沥青悬浮液加入这四个微量滴定板的各个孔中。上述的衍生于Magnaporthe salvinii的脂肪氧合酶用作脂肪酸氧化酶，并将其加入微量滴定板A和C的孔中以获得10ppm的孔浓度(in-well-concentration)。将类似量的缓冲剂(50mM硼酸盐pH9.0)加入微量滴定板B和D的孔中。然后在振荡(600rpm)过程中，培养微量滴定板30分钟。30分钟后，将20微升酶处理的沥青悬浮液转移至相应微量滴定板A-D的另一套微量滴定板(Coming Inc.Costar UV板96孔，No.3635)，其中各板的每孔中含有200微升乙醇(增溶沥青组分)。松香酸，沥青的主要组分，在约255nm处强烈地吸收。因此，A255指示在悬浮液中剩余沥青的量。A255被确定为八个相同实验的平均值，根据用和不用纸培养后，沥青悬浮液中所测量的A255的差变(variation)(经过11次在乙醇中稀释后)，估计吸附到纸上的沥青量。
结果如下表3所示。在缺少脂肪酸氧化酶的情况下，沥青在纸上的基本(盲)吸收可以计算为D/B之比。至于纸对沥青的吸收，酶(试样)的效果可计算为C/A之比。如果(C/A-D/B)小于零，则其是一种显示酶已经使沥青沉积减少的方法。另外。所述酶效果可计算为((C-A)-(D-B))，如果该值小于零，则这将是另一种显示酶减少了沥青沉积效果的方法。除了纸之外，其它固态材料也可用于测试，例如金属和纺织品(Style400棉)。通过比较其它固态材料上的沉积，表明上述显示减少沥青沉积的方法是可实用的。
当然，考虑到所述脂肪酸氧化酶的特征来选择试验-pH(即缓冲剂)和试验-温度，例如在约4、5、6、7、8、9、10或11的试验pH和10、15、20、25、30、37、40、50、60、70、80、90或95℃的试验温度。
表3
实施例4漂白含有脂肪酸氧化酶的纸使用来自Eucalyptus grandis的未漂白的Kraft浆。在由Loretzen和Wettre制造的制浆机中以4％浓度重制浆。在pH＝9.0下，在缓冲剂(Britton-Robinson)中完成重制浆。
Britton Robinson缓冲剂100mM磷酸(85％) 6.28ml100mM乙酸(100％) 5.72ml100mM硼酸 6.18gDem.水直到1000ml通过加入氢氧化钠将pH调至9.0。
重制浆后，通过加入缓冲剂将浆料稀释至1％浓度，将pH调节至9.0。
在含有3g干纸浆，即300ml纸浆浆料的烧杯中，用脂肪酸氧化酶进行处理。在25℃水浴中，用电磁搅拌棒以500rpm进行处理。将333ppm亚油酸加入所有烧杯中。所用的脂肪酸氧化酶是上述所制备的提纯过的衍生于Gaeumannomyces graminis的脂肪氧合酶。所使用酶的量如表4和5所示。进行酶处理2小时，在各自条件下运行烧杯。
两小时后，通过加入5ml(固定量)的NaOH(27.65％的溶液)停止酶反应，这使得pH升至大于12，使酶失活。
使用700ml去离子水将烧杯中物体定量地转移到1000ml烧杯中。将该纸浆悬浮液倒入含有过滤纸的布氏漏斗(15cm直径)中。抽去水后，就形成了纸片(paper sheet)。从漏斗中除去纸片，然后与过滤纸分离。在由Lorentzenand Wettre制造的压纸机(sheet press)中，压制纸片。在金属板、2张吸墨水纸、2张过滤纸、该纸片、2张过滤纸、2张吸墨水纸、金属板的夹心结构中，以0.4MPa压力压制该纸片5.5分钟。用干纸取代湿纸，然后以0.4Mpa再压制2分钟。然后在空气中隔夜干燥该纸片。
使用Macbeth Color-Eye7000反射仪测量纸片的亮度，在600nm处记录该亮度，并且对每张纸片测量四次，测量结果如下表4所示。
使用Tappi Test Methods T236(Tappi Press)中所述的方法测量每张纸片的卡伯值(Kappa Number)，卡伯值描述纸浆脱木质素的程度。每次测量所使用的量是标准方法中所述的1/4。纸片中干物质的含量是通过计算卡伯值来决定的。所的结果如下表5所示。
表4
表5
实施例5用脂肪酸氧化酶对旧新闻用纸脱墨将200g撕碎的旧新闻用纸和1500ml水一起置于Hobart混合器(Hobart Mixer)中。水浴温度设定为45℃。开始时低速搅拌约0.5-1分钟，然后将3.6公斤/吨(7磅/吨)表面活性剂和2mg(10mg/吨纸浆)的如上所述制备的衍生于Magnaporthe salvinii的脂肪氧合酶加入混合器中，然后加入500ml水至Hobart中，充分混合。使搅拌器低速运行约30分钟，碎浆机温度设定为45℃，pH值为7。
将一半纸浆从混合器中转移至容器中，并稀释至10升，然后搅拌2分钟。
原料垫(feed pad)从混合器中量取30ml纸浆，用水稀释至300ml，然后充分混合。使用Wattman#40过滤纸在真空下过滤纸浆。在90℃(195F)下干燥该垫10分钟。
常规洗涤垫从容器中量取900ml浆料，然后缓慢倒至80目的过滤网上，缓慢地摇动直至排出所有的水。移去纸浆，然后将其放入1000ml烧杯中，烧杯用水添加至900ml刻度。然后缓慢搅拌纸浆，称量300ml浆料，然后使用Wattman#40过滤纸在真空下过滤纸浆。在90℃(195°F)下干燥该垫10分钟。
高度洗涤垫从容器中称量900ml纸浆浆料，然后缓慢倒至80目的过滤网上，缓慢地摇动直至排出所有的水。用自来水清洗纸浆3分钟，然后移去纸浆，将其放入1000ml烧杯中，烧杯用水添加至900ml刻度。然后缓慢搅拌纸浆，称量300ml浆料，然后使用Wattman#40过滤纸在真空下过滤纸浆以形成过滤垫。在90℃(195°F)下用高速干燥器(speed dryer)干燥该垫10分钟。
使用Tappi标准方法(T452)，通过Macbeth分色睛(color eye)测量垫的亮度。
使用两种商业购买的酶，即脂肪酶RESINASE A 2X和纤维素酶DENIMAX L依上所述进行比较实验，这两种酶均可购自丹麦的DK-2880Bagsvaerd，Krogshoejvej 36的Novozymes A/S。这两种酶制剂的用量是0.51公斤/吨纸浆(1磅/吨)。
结果如表6所示。
表权利要求
1.脂肪酸氧化酶纸材料制造中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，用于减少沥青的沉积。
3.如权利要求1-2中任一项所述的用途，用于漂白。
4.如权利要求1-3中任一项所述的用途，用在由包括来自回收、印刷的纸材料浆的造纸浆中制造纸材料的方法中，用于脱墨。
5.如权利要求1-4中任一项所述的用途，其中化学浆形成部分制造纸材料中所用的纸浆。
6.如权利要求1-5中任一项所述的脂肪酸氧化酶的用途，与用于该酶的基质一起使用。
7.如权利要求1-6中任一项所述的脂肪酸氧化酶的用途，与具有蛋白酶、脂肪酶、木聚糖酶、角质蛋白酶、氧化还原酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、淀粉酶、甘露聚糖酶、甾酯酶和/或胆甾醇酯酶活性的其它酶一起使用。
8.如权利要求7所述的用途，其中其它的氧化还原酶具有漆酶和/或过氧化物酶的活性。
9.如权利要求7-8中任一项所述的用途，其中其它酶具有脂肪酶活性。
10.制造纸材料的方法，该方法包括用脂肪酸氧化酶处理造纸浆和/或生产用水的步骤。
11.如权利要求10所述的方法，还包括形成和干燥酶处理的浆的步骤。
12.如权利要求10-11中任一项所述的方法，其中酶处理产生的结果为a)减少沥青沉积；b)漂白生成的纸材料。
13.如权利要求10-12中任一项所述的方法，其中化学浆形成部分制造纸材料中所用的纸浆。
14.如权利要求10-13中任一项所述的方法，其中造纸浆包括来自回收印刷纸材料的浆，其中酶处理产生漂白所生成的纸材料的结果，该结果至少部分是由于所述酶的脱墨效果而带来的。
15.如权利要求10-14中任一项所述的方法，其中在酶处理步骤之前或之中，加入用于所述酶的基质。
16.如权利要求10-15中任一项所述的方法，还包括用具有蛋白酶、脂肪酶、木聚糖酶、角质蛋白酶、氧化还原酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、淀粉酶、甘露聚糖酶、甾酯酶和/或胆甾醇酯酶活性的其它酶处理造纸浆和/或生产用水的步骤。
17.如权利要求16所述的方法，其中其它的氧化还原酶具有漆酶和/或过氧化物酶的活性。
18.如权利要求16-17中任一项所述的方法，其中其它酶具有脂肪酶的活性。
19.如权利要求16-18中任一项所述的方法，其中用所述其它酶进行的处理发生在与脂肪酸氧化酶进行的处理之前、同时和/或之后。
全文摘要
脂肪酸氧化酶在制造纸材料，例如纸、挂面纸板、瓦楞纸板、薄页纸、毛巾纸、瓦楞纸箱或盒中的用途。脂肪酸氧化酶的实例是EC 1.13.11.类的氧合酶，包括其子类中的任何一种酶，例如EC 1.13.12类的脂肪氧合酶。这些酶的效果是减少沥青沉积，也在纸浆和生成的纸材料上发现漂白和脱墨效果。脂肪酸氧化酶可以与基质、蛋白酶、脂肪酶、木聚糖酶、角质蛋白酶、氧化还原酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、淀粉酶、甘露聚糖酶、甾酯酶和/或胆甾醇酯酶或表面活性剂和其它佐剂一起使用。
文档编号D21C5/02GK1575363SQ02821148
公开日2005年2月2日 申请日期2002年10月17日 优先权日2001年10月23日
发明者金·博尔奇, 尼尔·弗兰克斯, 亨里克·伦德, 徐辉, 罗菁 申请人:诺维信公司, 诺维信北美公司