专利名称：大豆脂肪氧化酶Lox3的单克隆抗体杂交瘤细胞株及其抗体和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单克隆抗体，特别涉及分别分泌抗大豆脂肪氧化酶同功酶Loxl、Lox2和Lox3的单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单克隆抗体,细 胞株保藏编号分别为CGMCC5121、CGMCC5122及CGMCC5123，还涉及各自分泌的单克隆抗体在利用双抗体夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)检测大豆脂肪氧化酶同功酶当中的应用，属于生物检测技术领域。
背景技术：
大豆中含有三种脂肪氧化酶(Lipoxygenase,简称Lox)同功酶即Loxl、Lox2和Lox3,它们能专一催化具有cis, cis-1, 4-戍二烯结构的多元不饱和脂肪酸通过分子加氧，形成具有共轭双键的氢过氧化衍生物，即醛、酮等具有挥发性的异味物质，使大豆具有豆腥味，从而降低了豆制品的耐储性、食用性和营养价值。通常在大豆加工过程中人们通过加热、微波照射、改变介质的PH值、有机溶剂萃取和醛水解酶等方法消除豆腥味，但这些方法都会不同程度地降低豆制品的营养价值，并且使得成本增高。培育脂肪氧化酶缺失品种可以从根本上解决上述问题。但在脂肪氧化酶缺失材料的选育过程中，Lox在田间不存在指示性状，从种子外观和农艺性状上无法鉴别，并且田间脂肪氧化酶缺失材料选择工作量大，因此急需一种快速、简便、成本低、一次可以同时检测出三种脂肪氧化酶的检测方法。目前脂肪氧化酶的常用的检测方法是薄层等电聚焦电泳(IEF)检测方法，这种方法主要是通过酶染法和蛋白染色方法结合使Lox同功酶带显色，虽然能同时检测出三种脂肪氧化酶，但检测中常常会因Lox的缺失而发生其它Lox等电点正极漂移现象；另外该方法所需设备、试剂昂贵，操作要求严格，一般育种、仓储单位和加工质检部门不便操作。另外据日本Suzuki, Y 等 1992 年报道(Prodution and use ofmonolional antibodies against rice embryo lipoxygenase-3, Biosci Biotech.Biochem. 56:678-679):用单克隆抗体可以检测水稻中的Lox3,这种方法虽然结果准确可靠，但检测过程中除需要做封闭外，还需要过夜包被酶标板，因此耗时，操作起来不方便。申请号00112539. 7的专利公开了一种作物脂肪氧化酶同功酶的检测方法，该方法具有操作简便、结果直观等特点。但由于它是利用脂肪氧化酶的偶联氧化还原指示剂显色反应的原理来进行测定的，所以它的灵敏度和特异性受到一定的限制。
发明内容
本发明的目的在于避免上述方法的缺陷，建立能分别分泌抗大豆脂肪氧化酶同功酶Loxl、Lox2、Lox3的特异性单克隆抗体的3个杂交瘤细胞株,利用这些细胞株分泌的特异性单克隆抗体来组装可以用于同时检测大豆中三种脂肪氧化酶同功酶的双抗体夹心酶联免疫吸附(DAS-ELISA)检测试剂盒 。该试剂盒适用于对大豆中三种脂肪氧化酶的定性和定
量测定。本发明所解决的第一个技术问题是提供了一组抗大豆脂肪氧化酶同功酶的单克隆抗体杂交瘤细胞株，其特征在于所述的单克隆抗体杂交瘤细胞株包括抗大豆脂肪氧化酶Loxl的单克隆抗体杂交瘤细胞株，为小鼠的脾细胞与SP2/0细胞经过细胞融合产生，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为CGMCC5121 ;及抗大豆脂肪氧化酶Lox2的单克隆抗体杂交瘤细胞株，为小鼠的脾细胞与SP2/0细胞经过细胞融合产生，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为CGMCC5122 ;及抗大豆脂肪氧化酶Lox3的单克隆抗体杂交瘤细胞株，为小鼠的脾细胞与SP2/0细胞经过细胞融合产生，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为CGMCC5123。所述的抗大豆脂肪氧化酶Loxl、Lox2、Lox3的单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立方法如下①免疫抗原制备分别取单缺Loxl的大豆种子(记为Lox-1)、单缺Lox2的大豆种子五星2号(记为Lox-2)、单缺Lox3的大豆种子(记为Lox_3) (Lox_l、Lox_3可以通过国家种质库获得，五星2号(Lox-2)可以从市场上买到)，用钢锉磨成豆粉，以及Sigma公司产品Soybean Lox typel_B (同时含有3种大豆脂肪氧化酶,几乎不含其它大豆蛋白),分别与8 15倍体积的的pH为8. 0的Tris — CaCl2缓冲液混匀，浸提0. 5-1小时，4°C 12000rpm离心IOmin,,取上清备用，分别为Lox-1上清液、Lox_2上清液、Lox_3上清液、Soybean Loxtype1-B上清液；②小鼠免疫选择4 6周龄的行动敏捷的纯系BALB/C雌小鼠，分别称量各小鼠体重并标记；取步骤①中制备的Lox-1、Lox-2、Lox-3上清液，用生理盐水将其稀释到蛋白含量4mg/ml，加入等体积弗氏完全佐剂混合后，采取皮下多点注射首次免疫小鼠，各上清液分别免疫5只小鼠并做标记,每只小鼠的免疫剂量为0. 4 0. 6mg ；③注射环磷酰胺溶液(CY):将步骤②中首次免疫的小鼠分别于免疫10min、24h、48h后，按照90mg/kg的量分别对小鼠进行颈背部多点注射浓度20mg/ml的环磷酰胺溶液(CY)进行消减；④效价测定及再次免疫首次免疫I周后用步骤①中制备的Soybean Loxtypel-B上清液作抗原对步骤③中的小鼠按照步骤②方法再次进行免疫，第二次免疫一周后进行第三次免疫，第三次免疫后第四天从小鼠尾部分别取血2-3滴，离心取上清，用间接酶联免疫吸附法测定其效价(效价测定利用Soybean Lox typel_B包被),如果效价小于
1:1600,1周后对各小鼠用Soybean Lox typel-B按照步骤②方法再次进行免疫,并进行效价测定，直至血清效价达到或高于1:1600为止；⑤加强免疫3种免疫小鼠中，每种均选择血清效价最高的小鼠在细胞融合前3天按步骤④加强免疫I次；⑥细胞融合分别取步骤⑤中的不同小鼠的脾细胞与复苏的SP2/0细胞混匀，在细胞培养板HAT培养基上分别筛选阳性杂交瘤细胞；⑦特异性阳性细胞株筛选细胞融合7 15天后，采用间接酶联免疫吸附法，利用Soybean Lox typel_B作为检测抗原进行阳性筛选，同时利用单缺Loxl的大豆种子(Lox-1)的豆粉上清液作为检测抗原进行交叉检测，上清液的0D450值与空白对照孔的0D450值之比大于2.1的即判断为阳性孔，并且与Lox-1反应表现为阴性的孔，其中的杂交瘤细胞称为阳性细胞株，该细胞株分泌的单克隆抗体为特异性抗Loxl的。用同样的方法，均利用Soybean Lox typel_B作为检测抗原进行阳性筛选,利用五星2号豆粉上清液对分泌抗Lox2的单克隆抗体进行交叉检测,利用Lox-3豆粉上清液对分泌抗Lox3的单克隆抗体进行交叉检测；⑧亚克隆采用有限稀释法对步骤⑦中筛选到的3种阳性细胞株分别进行亚克隆，连续两次亚克隆之后剔除掉假阳性细胞株，在检测过程中均按照⑦中的方法同时进行 阳性和交叉检测，最终可以获得分别分泌抗Loxl、Lox2、Lox3的特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本发明所解决的第二个技术问题是提供由权利要求1所述的单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆抗体包括由抗大豆脂肪氧化酶Loxl的单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的特异性抗Loxl的单克隆抗体 '及由抗大豆脂肪氧化酶Lox2的单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的特异性抗Lox2的单克隆抗体 '及由抗大豆脂肪氧化酶Lox3的单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的特异性抗Lox3的单克隆抗体。上述的单克隆抗体是通过以下方法得到的将上述步骤⑧中得到的分泌Loxl、Lox2、Lox3单克隆抗体细胞株分别以(I 2) X IO6个细胞/只的量接种到经过石蜡油预处理过的不同BALB/C小鼠腹腔，诱导腹水产生抗体，经过6 8天后即可采集腹水或血清，分别得到Loxl、Lox2、Lox3单克隆抗体。本发明所解决的第三个技术问题是提供所述的单克隆抗体在检测大豆脂肪氧化酶同功酶中的应用。本发明所解决的第四个技术问题是提供所述的单克隆抗体在制备检测大豆脂肪氧化酶同功酶试剂盒中的应用。本发明所解决的第五个技术问题是提供一种检测大豆脂肪氧化酶同功酶的方法，其特征在于包含以下步骤A、将本发明的分别抗大豆脂肪氧化酶Loxl、Lox2、Lox3的单克隆抗体杂交瘤细胞株所分泌的各单克隆抗体分离纯化；B、采用辣根酶标记步骤A纯化后的单克隆抗体，分别获得辣根酶标记的抗大豆LoxU Lox2和Lox3的单克隆抗体，作为检测抗体，酶标后分别命名为L_1，L_2，L-3 ；C、利用大豆脂肪氧化酶同功酶Loxl、Lox2、Lox3的多克隆抗体作为固相抗体包被酶标板，B中得到的L-l，L-2，L-3作为检测抗体，利用抗原抗体的结合反应，通过显色与否及深浅来检测大豆种子当中Loxl、Lox2、Lox3这3种脂肪氧化酶的缺失类型和含量。所述的步骤A中所得到的各单克隆抗体采用辛酸-硫酸铵法进行分离纯化，步骤如下
①用0. 06M醋酸缓冲液将所采集的腹水或血清稀释3-4倍，用NaOH调pH为4. 5，并记下液体体积；②在振荡下滴加辛酸(每毫升稀释的腹水或血清中加25ul辛酸)，室温下搅拌30min,4°C, IOOOOrpm离心30min,弃沉淀，留上清；(加辛酸必须一滴一滴加)③过滤上清液，加入0.1M pH7. 4的PBS (每10份上清液加I份PBS)，用NaOH调pH 为 7.4，4°C放置 30min ；④研磨硫酸铵，每毫升混合液加0. 28g硫酸铵,搅拌30min, IOOOOrpm离心20min ；⑤取沉淀溶于原腹水或血清1/10体积的0. OlM PBS中，用50倍体积的0. OlMPBS缓冲液透析过夜，换液2-3次；⑥将液体从透析袋取出，4°C, IOOOOrpm离心20min,去沉淀，即为纯化的单克隆抗体，浓缩后_20°C保存备用。 所述的步骤B中将抗大豆Loxl、Lox2和Lox3的单克隆抗体进行酶标制备检测抗体的步骤如下①称取2mg的HRP酶，溶于三蒸水中，加入新近配制的过碘酸钠溶液，混匀后置40C，30min,加入乙醇溶液,室温，30min,加入Img纯化抗体,混勻,调pH值至9. 0,4°C过夜；②加入硼氢化钠，混匀，置4°C 2h ;③将酶标抗体混合液加入等体积饱和硫酸铵溶液，置4°C 30min后离心，用pH7. 4磷酸盐缓冲液透析过夜，即可。所述步骤C中大豆脂肪氧化酶多克隆抗体制备的步骤如下①免疫动物选择与初次免疫选择重量在2 3kg之间的纯种新西兰大白兔，将Soybean Lox typel_B蛋白稀释成8mg/ml作为抗原，与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化后，采取背部皮下多点注射免疫兔子，每只兔子免疫剂量为1. 6mg ；②再次免疫间隔10 14天后利用不完全付氏佐剂和浓度为8mg/ml的SoybeanLox typel-B蛋白等体积混合后按照步骤①进行再次免疫，如此进行第三次免疫；③效价测定第三次免疫后第11天从上述步骤②中免疫的大白兔耳缘静脉取血检测其效价，如果效价小于1:10000时，则对步骤②中大白兔再次按照步骤②免疫，如此反复免疫直至所测效价高于1:10000为止；④多克隆抗体的制备3天后对步骤③效价最高的大白兔采用颈动脉放血法采血，分离血清，采用间接酶联免疫吸附法测定分离血清与Loxl、Lox2、Lox3及大豆中其它蛋白的交叉，证明该血清与Loxl、Lox2、Lox3均有交叉而与大豆中其它蛋白无交叉后即得到多克隆抗体血清。所述步骤C中检测大豆种子当中Lox-l、Lox-2、Lox_3这3种脂肪氧化酶的缺失类型和含量包括如下操作步骤①待测大豆中Lox提取液的制备将待测大豆的种子磨成豆粉，加入8 15倍体积的pH为8. 0的Tris - CaCl2缓冲液，混匀后离心取上清备用；②洗板用Tween20 — NaCl缓冲液将多克隆抗体包被的酶标板反复洗3 4次，每次2 3min，拍干，目的洗去未结合到板子上的多克隆抗体；③-1加样将步骤①中制备的Lox提取液加到步骤②备好的酶标板中，同时做阳性和阴性对照，25°C 37°C放置30 90min后按照步骤②洗板；
③-2加样将sigma公司Soybean Lox typel-B产品稀释成80万活力单位/ml的标准液，用了￥661120 —恥(1缓冲液按10、30、90、270、810、2430、7290、21870、65610、196830、590490,0共12个稀释浓度进行倍比稀释，同时将步骤①中制备的Lox提取液稀释成10、50,100,200共4几个浓度梯度，然后将不同稀释浓度的标准液和Lox提取液按每个浓度100 μ L/孔分别加到步骤②备好的酶标板中，均设3次重复，37°C放置45min-60min后按照步骤②洗板；④-1加入大豆脂肪氧化酶同功酶Loxl、Lox2和Lox3单克隆抗体试剂(L_1、L_2、L-3):将大豆脂肪氧化酶同功酶Loxl、Lox2和Lox3单克隆抗体试剂(L_l、L_2、L-3)分别加入到步骤③-1已加入待测样品的酶标板孔内，25°C 37°C放置30-90min后按照步骤②洗板；④-2加入大豆脂肪氧化酶同功酶Loxl、Lox2和Lox3单克隆抗体试剂(L_1、L_2、L-3):将大豆脂肪氧化酶同功酶Loxl、Lox2和Lox3单克隆抗体试剂(L_l、L_2、L-3)分别 加入到步骤③-2已加入待测样品的酶标板孔内，25°C 37°C放置30-90min后按照步骤②洗板；⑤显色及终止将含有20%的3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺的无水乙醇底物液和pH为5. O磷酸盐柠檬酸缓冲液底物液等体积混合，加入到所有孔中，避光放置15 20min，显色的样品中含有与所加单克隆抗体相对应的Lox，不显色的样品中则不含有与所加单克隆抗体相对应的Lox ;加入底物液体积1/2的2M H2SO4终止液终止显色；⑥酶标仪读数设置参数450nm，外部振摇3秒；⑦标准曲线的绘制按步骤③-2中标准液的稀释度的log值为横坐标，以步骤⑦中得到的OD值为纵坐标，绘制“S”形标准曲线；⑧利用“S”形标准曲线中间呈线性关系的一段，利用该线段的回归方程以及待测样品系列稀释度的OD值计算出Lox的活力单位数。本发明所解决的第六个技术问题是根据上述的检测方法提供一种检测大豆脂肪氧化酶同功酶的试剂盒，该试剂盒包括盒体、设在盒体内的酶标板和存放在盒体内的试剂，其特征在于盒内存放的瓶装检测试剂由以下试剂组成pH为8. O的Tris - CaCl2缓冲液；阳性对照试剂；阴性对照试剂；Tween20 - NaCl溶液缓冲液；由抗大豆脂肪氧化酶Loxl、LOX2、LOX3的单克隆抗体杂交瘤细胞株所分泌的各单克隆抗体分别经辣根酶标记后得到的抗大豆脂肪氧化酶同功酶L0X1、L0X2和Lox3单克隆抗体试剂；含有20%的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺的无水乙醇底物液；pH为5. O磷酸盐柠檬酸缓冲液底物液；2M H2SO4终止液；用双蒸水将sigma公司Soybean Lox typel_B产品稀释成80万活力单位/ml得到的标准液；其中，所述的阳性对照为从普通大豆种子中提取的总蛋白。其中，所述的阴性对照为从脂肪氧化酶全缺失大豆中提取的总蛋白。相较于现有技术，本发明的优点在于1、利用Sigma公司的Soybean Lox typel-B产品作为免疫抗原诱发哺乳动物产生多克隆抗体，后将多抗隆抗体结合到酶标板上；同时在不纯化大豆Lox蛋白的前提下，利用大豆脂肪氧化酶近等基因系century材料通过消减免疫法首先使用环磷酰胺将大豆中其它蛋白在实验小鼠体内的免疫反应屏蔽掉，再用含有目的大豆Lox蛋白的混合样品免疫实验小鼠，诱发小鼠体内产生对Loxl、Lox2和Lox3专一的抗体,制备特异杂交瘤细胞,避开了蛋白纯化这一难题；2、通过筛选阳性细胞株与交叉检测同时进行，极大程度上降低了筛选到分别抗大豆Loxl、Lox2和Lox3的强特异性单克隆抗体的工作量；3、检测时多克隆抗体已被结合到酶标板上，检测过程中不需做封闭和过夜包被酶标板，因此省时，操作方便；4、利用抗原抗体的结合反应，通过显色检测酶的存在和酶的含量，检测时形成“多抗+样品+单抗”双抗体夹心，准确可靠、特异性强； 5、样品处理简单，一次可以同时检测出三种脂肪氧化酶，并且一次可以同时检测多个样品，适用于育种单位、仓储单位和加工质检部门，最适用于育种中大量品种(系)的筛选。
图1为30个近等基因系高代材料检测结果图；图2为“S”形标准曲线。涉及的菌种保藏抗大豆脂肪氧化酶Loxl的单克隆抗体杂交瘤细胞株(Loxl-E1),为小鼠的脾细胞与SP2/0细胞经过细胞融合产生的杂交瘤细胞株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为CGMCC5121，保藏日期为2011年7月26日；抗大豆脂肪氧化酶Lox2的单克隆抗体杂交瘤细胞株(LoX2-G5)，为小鼠的脾细胞与SP2/0细胞经过细胞融合产生的杂交瘤细胞株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为CGMCC5122，保藏日期为2011年7月26日；抗大豆脂肪氧化酶Lox3的单克隆抗体杂交瘤细胞株(LoX3-H8)，为小鼠的脾细胞与SP2/0细胞经过细胞融合产生的杂交瘤细胞株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为CGMCC5123，保藏日期为2011年7月26日。
具体实施例方式下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。实施例1:抗大豆脂肪氧化酶同功酶的单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立1.1实验材料大豆脂肪氧化酶全缺失材料“中特I号”购自中国农业科学院作物科学研究所；美国Century近等基因系材料国家资源库保存号分别为Lox_l =WDDO 1483,Lox-3 :WDDO1485 ；缺Lox-2酶大豆品种“五星2号”，审定号国审豆2004005 ；BALB/C小鼠和小鼠SP2/0细胞购自军事医学科学院实验动物中心(北京)；新西兰大白兔购自河北省实验动物中心；
96孔聚苯乙烯酶标板购自厦门市云鹏科技发展有限公司。1. 2化学试剂HAT培养基、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、Soybean Lox typel-B均为Sigma公司产品；辣根酶(HRP)购买自北京华美转导科技有限公司；其它所用化学试剂均购自北京鼎国生物技术有限责任公司。
1. 3试验方法①免疫抗原制备取单缺Loxl的大豆种子、单缺Lox2五星2号大豆种子、单缺Lox-3的大豆种子(可以通过国家种质库获得)，用钢锉磨成豆粉(分别磨10g)，Sigma公司产品Soybean Lox typel-B10g (同时含有3种大豆脂肪氧化酶,不含其它大豆蛋白),上述材料用8 15倍体积的pH为8. O的Tris — CaCl2缓冲液混匀，浸提I小时，4°C 12000rpm离心IOmin,取上清备用；②小鼠免疫选择4 6周龄的行动敏捷的纯系BALB/C雌小鼠15只，分成3组(命名为a、b、c组)，每组5只，分别编号为1、2、3、4、5号，分别称量各小鼠体重并标记(如表I);取步骤①中制备的单缺Loxl的大豆种子、单缺Lox2五星2号大豆种子、单缺Lox-3的大豆种子的上清液分别用生理盐水将其稀释到蛋白含量4mg/ml，加入等体积弗氏完全佐剂混合后，分别采取皮下多点注射首次免疫小鼠，每只小鼠的免疫剂量为O. 6mg，注射单缺Loxl的大豆种子(Lox-1)上清液的为a组，注射单缺Lox2的大豆种子(Lox-2)上清液的为b组，注射单缺Lox3的大豆种子(Lox-3)上清液的为c组；表1:各组小鼠体重统计表
权利要求
1.抗大豆脂肪氧化酶LOX3的单克隆抗体杂交瘤细胞株，其特征在于所述的单克隆抗体杂交瘤细胞株为小鼠的脾细胞与SP2/0细胞经过细胞融合产生，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为CGMCC5123。
2.由权利要求1所述的单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。
3.权利要求2所述的单克隆抗体在检测大豆脂肪氧化酶Lox3中的应用。
4.权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测大豆脂肪氧化酶Lox3试剂盒中的应用。
全文摘要
本发明公开了抗大豆脂肪氧化酶Lox3的单克隆抗体杂交瘤细胞株，保藏编号为CGMCC5123，本发明还公开了由该杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体及其在检测大豆脂肪氧化酶Lox3中的应用。
文档编号G01N33/577GK102994454SQ20121055490
公开日2013年3月27日 申请日期2011年8月2日 优先权日2011年8月2日
发明者张孟臣, 马志民, 秦君, 闫龙, 李亚璞, 蒋春志, 邸锐, 唐晓东 申请人:河北省农林科学院粮油作物研究所