专利名称：脂解酶分析的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种测定脂解酶活性的方法，以及利用此方法从多肽文库中筛选所需脂解酶的方法。
背景技术：
脂解酶是一类能水解酯键的酶，其广泛用于各种工业中，例如去污工业和烘烤工业。
有很多不同的检测脂解酶活性的方法是公知的，例如Gupta R et al.，2003，Biotechnol.Appl.Biochem，37，63-71综述了这些方法。
由于对新的和/或旧脂解酶的变异体，特别是一些适合于工业应用的脂解酶的持续需求，新的能检测所述酶活性的分析方法也变得必要。
发明概述本发明提供了一种测定脂解酶活性的方法，该方法包括检测脂解酶与底物间的酶促反应的气相pH值，其中底物含有位于C1-C10羧酸与醇之间的酯键。
另外，本发明提供了一种从多肽文库中筛选所需脂解酶的方法，该方法包括a)检测文库中的多肽与底物间的酶促反应的气相pH值，其中，该底物包含位于C1-C10羧酸与醇之间的酯键b)挑选所需脂解酶发明详述定义本发明上下文中的术语“多肽”意欲包括寡肽、多肽和类似的蛋白质。
本发明上下文中的术语“亲本(parent)”理解为修饰后能产生蛋白变异体的蛋白。亲本蛋白可以是天然形成(野生型)的多肽，或者是通过任意合适方法制备的天然存在多肽的变异体。举例来说，亲本蛋白可以是天然存在蛋白的变异体，其可通过取代、化学修饰、缺失或截断天然存在多肽的一个或多个氨基酸残基得到修饰，或者通过在天然存在多肽的氨基酸序列上增加或插入一个或多个氨基酸残基的方式得到修饰。
本发明上下文中的术语“变异体”理解为与亲本蛋白相比有一个或多个氨基酸残基被修饰的蛋白。
本发明上下文中的术语“修饰”或“修改”理解为包括蛋白的化学修饰和编码蛋白的DNA的遗传操作。修饰可以是在所需氨基酸处或其内的氨基酸侧链的置换、取代、缺失和/或插入。因此，术语“修饰的蛋白”理解为包含相对于亲本蛋白的修饰的蛋白。
脂解酶/所需脂解酶本发明中的脂解酶/所需脂解酶是指能够水解酯键的脂解酶。举例来说，这些酶包括诸如三酰甘油脂酶(EC 3.1.1.3)、脂蛋白脂酶(EC 3.1.1.34)、甘油单脂脂酶(EC 3.1.1.23)、溶血磷脂酶和酯酶(EC 3.1.1.1，EC 3.1.1.2)的脂酶。括号中的字符是国际生物化学联合会酶学委员会(Enzyme Commission of the International Unionof Biochemistry)根据酶的催化活性种类编排的系统分类号。
脂解酶/所需脂解酶可以是原核生物酶，具体而言是细菌酶，比如，来自假单胞菌属(Pseudomonas)的酶类。这样的例子有假单胞菌脂酶，例如来自洋葱假单胞菌(P.cepacia)(US 5,290,694，pdb file 1OIL)，荚壳假单孢菌(P.glumae)(N Frenkenet al.(1992)，Appl.En-vir.Microbiol.58 3787-3791，pdb files 1TAH和1QGE)，类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 334 462)和假单孢菌属的菌株(Pseudomonassp.Strain) SD 705(FERM BP-4772)(WO 95/06720，EP 721 981，WO 96/27002，EP 812 910)的假单胞菌脂酶。荚壳假单孢菌的脂酶序列与粘稠色杆菌(Chromobacterium viscosum)(DE 3908131 A1)的氨基酸序列一致。其它例子有细菌角质酶，例如来自假单胞菌，如门多萨假单孢菌(P.mendocina)(US 5,389,536)或恶臭假单孢菌(P.putida)(WO 88/0936)的细菌角质酶。
可选择地，脂解酶/所需脂解酶可以是真核生物酶，例如真菌脂解酶，如腐质酶科(Humicola family)和接合菌科(Zygomycetes family)脂解酶，和真菌角质酶。
真菌角质酶的例子有茄病镰孢(Fusarium solani)pisi角质酶(S.Longhi等，Journal of Molecular Biology，268(4)，779-799(1997))和Humicola insolens(US5,827,719)角质酶。
脂解酶的腐质酶科由来自H.lanuginosa菌株DSM 4109的脂肪酶和与该脂肪酶具有50％以上同源性的脂肪酶组成。来自H.lanuginosa(与Thermomyceslanuginosus同义)的脂酶在EP 258 068和EP 305 216中被描述，并且具有US5,869,438的SEQ ID NO2的1-269位显示的氨基酸序列。
腐质酶科也包括下列脂解酶来自沙门氏柏干酪青霉(Penicillium camembertii)(P25234)的脂酶，来自尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)(EP 130064，WO 98/26057)的脂酶/磷脂酶，来自异孢镰孢(F.heterosporum)(R87979)的脂酶，来自臭曲霉(Aspergillus foetidus)(W33009)的溶磷脂酶，来自米曲霉(A.oryzae)(JP-A10-155493)的磷脂酶A1，来自米曲霉(D85895)的脂酶，来自黑曲霉(A.niger)(Y09330)的脂酶/阿魏酸酯酶，来自塔宾曲霉(A.tubingensis)(Y09331)的脂酶/阿魏酸酯酶，来自塔宾曲霉(WO 98/45453)的脂酶，来自黑曲霉(WO 98/31790)的溶血磷脂酶，来自茄病镰孢(F.solanii)的具有6.9的等电点和表观分子量为30千道尔顿的脂酶(WO 96/18729)。
接合菌家族包括与Rhizomucor miehei(P19515)脂酶具有至少50％同源性的脂酶。该家族也包括来自反射犁头霉(Absidia reflexa)，A.sporophora，伞枝犁头霉(A.corymbifera)，A.blakesleeana，A.griseola(在WO 96/13578和WO 97/27276中都有描述)和米根霉(Rhizopus oryzae)(P21811)的脂酶。括号中的字符表示在EMBL，GenBank，GeneSeqp或Swiss-Prot数据库中的出版号或登记号。
多肽文库本发明还涉及一种从多肽文库中筛选所需脂解酶的方法。本发明上下文中的术语“多肽文库”理解为至少是两种不同的多肽的集合，即至少含有两种有一个或多个不同氨基酸位点的多肽，例如，多肽中的氨基酸数目可不同或者某一特定位点的氨基酸可不同。
通常，可以通过在可表达多肽的宿主细胞中导入编码多肽文库的核酸序列来制备多肽文库。由于遗传密码简并性，该文库中的不同核酸序列的数目可能多于不同多肽的数目。
具体而言上述核酸序列文库可以编码亲本脂解酶的变异体，即与亲本脂解酶相比至少有一个氨基酸位点不同的多肽。因而筛选的方法可以用来筛选亲本脂解酶的变异体。这些变异体可以通过例如随机或定点突变亲本脂解酶或其他本领域技术人员公知的方法获得。因而在一个具体实施方案中，多肽文库可以是亲本脂解酶变异体的文库。合适的亲本脂解酶的例子包括但不限于前面脂解酶部分所提到的。具体而言，亲本脂解酶可以是脂酶(Lipolase)，来源于在EP 258 068和EP 305 216中描述的Humicola lanuginos的脂酶，或者是来源于假单胞菌属或芽孢杆菌属(Bacillus)的脂酶。
在另一实施方案中，上述核酸序列文库可以编码来源于一个或多个不同生物体的多肽。因此该方法可以用来筛选表达脂解酶活性的一个或多个不同生物体。
在另一实施方案中，多肽文库可以通过合成多肽的途径获得。
制备核苷酸序列文库的方法、将其导入宿主细胞、在宿主细胞中表达上述多肽文库编码的多肽，以及合成多肽的方法对本领域技术人员来说是熟知的，这些方法可以在诸如“分子克隆实验指南”，Sambrook等(1989)，Cold Spring Harborlab.，Cold Spring Harbor，NY；Ausubel，F.M.等(编辑)；“分子生物学研究方法(Currentprotocols in Molecular Biology)”，John Wiley和Sons，，(1995)；Harwood，C.R.，和Cutting，S.M.(编辑)；“芽孢杆菌分子生物学方法(Molecular Biological Methodsfor Bacillus)”，John Wiley和Sons，(1990)；“DNA克隆实用入门(DNA CloningA Practical Approach)，卷I和卷II”，D.N.Glover ed.(1985)；“寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)”，M.J.Gait ed.(1984)；“核酸杂交(Nucleic AcidHybridization)”，B.D.Hames & S.J.Higgins编辑(1985)；“转录和翻译(TranscriptionAnd Translation)”，B.D.Hames & S.J.Higgins，编辑(1984)；“动物细胞培养(AnimalCell Culture)”，R.I.Freshney，ed.(1986)；“固定化细胞和酶(mmobilized Cells AndEnzymes)”，IRL出版，(1986)；“分子克隆实践指南(A Practical Guide To MolecularCloning)”，B.Perbal，(1984)等文献中找到。
底物本发明中的底物含有位于C1-C10羧酸和醇之间的酯键。
本发明上下文中的C1-C10羧酸理解为具有一般通式R-COOH的羧酸，这里的R是指具有0-9个碳原子(C-原子)的碳氢化合物。碳氢化合物一般理解为只含有碳和氢的化合物，然而本发明文中的R也可以被替代，例如，被卤素替代。
R可以是饱和碳氢化合物，即烷烃(alkane)，即只含有单键的碳氢化合物，R也可以是不饱和碳氢化合物，即含有一个或多个双键或三键的碳氢化合物。含有双键的碳氢化合物也称作烯烃，而含有三键的碳氢化合物也称作炔烃。在大多数天然存在的底物中，碳氢化合物是烷烃或烯烃。
R可以是直链的或支链的，也可以是环型的或芳香型的。
本发明中的C1-C10羧酸可以是C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9或C10羧酸，特别是，它可以由2-8个，例如，4-8个碳原子组成。
在本发明的具体实施方案中，C1-C10羧酸的R基团是直链的、未被取代的碳氢化合物。像这样合适的C1-C10羧酸的例子包括但不限于丁酸(CH3(CH2)2COOH)、戊酸(CH3(CH2)3COOH)、己酸(CH3(CH2)4COOH)和辛酸(CH3(CH2)6COOH)或癸酸(CH3(CH2)8COOH)。
通常将包含具有CH3(CxHy)COOH通式的长碳氢链的羧酸称为脂肪酸。脂肪酸由很多不同的脂类组成，这些脂肪酸中的脂通过酯键与醇共价相连。这样的脂类的例子包括但不限于三酰基甘油(也称为甘油三酯)、蜡、双半乳糖甘油二酯(digalactosyl diglycerides)和磷脂，这里的三酰基甘油是含有三个脂肪酸和甘油的三酯，蜡是被酯化到长链醇上的一种脂肪酸，而磷脂是一种在脂的亲水基团含有磷酸基团的脂类。所有这些结构对于本领域技术人来说都是熟知的。虽然很多天然存在的脂类包括具有10个以上的碳原子的烃链的羧酸，包括10个或10个以下的碳原子的羧酸的天然存在的脂类也是被知晓的。本发明中的底物可以是脂类，例如，那些上文中所提到的中的一种，具体而言它可以是三酰基甘油。因而本发明中的底物中的醇具体可以是甘油、甘油-3-磷酸、长链醇或这些醇的修改型(modified version)。其他可作底物的醇的例子对本领域技术人员而言是熟知的。
本发明中的底物可以是天然形成的底物、合成的底物或加工的底物，例如，某天然形成底物被人工加工所得的底物。本发明上下文中的术语“天然形成的底物”(天然存在的底物，natural occurring substrate)被理解为一种存在于自然界中的化合物。
许多脂类，那些天然形成的和那些被人工加工过的脂类，都包括了不同的甘油三酸酯和脂肪酸(当它们以脂肪酸存在，而不是其他化合物，如甘油三酯，的一部分的形式存在时，有时被描述为游离脂肪酸)的混合物。这些脂类的组合物常通过不同脂肪酸的含量而被描述。在本发明的一个具体实施方案中，底物可以是一种或多种不同甘油三酸酯的混和物，一种或多种脂肪酸的混和物，或是一种或多种不同甘油三酯与一种或多种不同脂肪酸的混和物。具体而言，本发明中的底物可以是包含由一种或多种不同甘油三酯和一种或多种不同脂肪酸混和而成的脂肪或油类，譬如动物脂肪，如乳脂或黄油，或者植物脂肪，如橄榄油。如果底物包括不同甘油三酯和/或脂肪酸混合物，其可能具体是包括0.1-100w/w％之间，如0.5-100w/w％或1-95w/w％或1-85w/w％或1-75w/w％或1-50w/w％或1-25w/w％或5-95w/w％或5-75w/w％或5-50w/w％或5-25w/w％或10-95w/w％或10-75w/w％或10-50w/w％或10-25w/w％或15-95w/w％或15-75w/w％或15-25w/w％或20-95w/w％或20-75w/w％或20-50w/w％或25-95w/w％或25-75w/w％或25-50w/w％或40-100w/w％或40-80w/w％或60-80w/w％或50-100w/w％或50-75w/w％或60-100w/w％或60-80w/w％或70-100w/w％或70-95w/w％或70-80w/w％之间的诸如前文所述之一的C1-C10羧酸的底物。
测定pH值气相pH值可以通过任何已知的pH值检测方法进行测定。在一个具体实施方案中，pH值指示剂被用来测定pH值，这里的术语“pH值指示剂”理解为能检测pH值的任何方法。比如，pH值指示剂可以是一种在某一pH值下变色和/或发荧光的化合物。通常，由于不同的pH值指示剂只能在特定的pH值范围内指示pH值，选择的pH值指示剂常常依赖于被检测的特定pH值。为本领域技术人员所熟知的在某一特定pH值时变色的pH值指示剂化合物的例子包括但不限于龙胆紫(Crystal Violet)、甲酚红、百里酚蓝、藻红B、2，4-二硝基酚、溴酚蓝、甲基橙、溴甲酚绿(Bromcresol Green)、甲基红、溴甲酚紫(Bromcresol Purple)、茜素(Alizarin)、溴百里酚蓝(Bromthymol Blue)、酚红、间硝基苯酚(m-nitrophenol)、o-甲酚酞(o-Cresolphtalein)、酚酞(Phenolphthalein)、百里酚酞(Thymolphthalein)、茜素黄(Alizarin Yellow)R和Oregon绿(Oregon Green)羧酸(分子探针)。另外，也可使用商业用pH值指示剂，它们能通过颜色和/或荧光指示宽范围的pH值。
由于C1-C10羧酸的酸性，它们的释放通常将降低气相pH值。因而在所述酸进入pH值指示剂之前，根据其气相pH值，pH值指示剂将能具体测得或指示0-14之间的pH值，例如pH2-12，pH3-12，pH3-10，pH3-9，pH4-12，pH4-10，pH5-12，pH5-10，pH5-8，pH6-12，pH6-10或pH6-8。在本发明的一个具体实施方案中，pH值指示剂可以是溴甲酚绿。
然而，其他pH值指示剂也视作可以使用，其包括但不限于荧光pH值指示剂。
利用pH值指示剂检测气相pH值可以通过例如视觉或pH值指示剂的自动检测方法完成。pH值指示剂可以存在于例如液体介质或固体介质或胶质(如琼脂糖)中。本领域技术人员熟知检测吸光率或荧光的方法。
本发明的方法本发明的一个实施方案涉及一种测定脂解酶活性的方法，该方法包括检测脂解酶与底物间酶促反应的气相pH值，其中底物含有位于C1-C10羧酸和醇之间的酯键。
本发明的发明者发现脂解酶与与底物间酶促反应的气相pH值可用于检测脂解酶的活性，其中底物含有位于C1-C10羧酸和醇之间的酯键。脂解酶能水解底物的酯键，从而能使C1-C10羧酸从底物中释放出来。由于脂解酶的性质，大多数测定其活性的分析方法需在室温或稍高的温度环境下进行，例如10-80℃。在此温度环境下C1-C10的汽化压力才能足够使至少一部分释放的C1-C10羧酸成为气相。本发明的发明者发现释放的C1-C10羧酸或一部分进入气相中的羧酸可以通过检测气相pH值而检测到，并且该pH值的大小与脂解酶的活性相关。释放的C1-C10羧酸对气相pH值的影响理所当然地依赖于反应发生前气相pH值的大小，然而，由于C1-C10羧酸是一种酸，所以相对于反应发生前的气相pH值，其通常将降低其气相pH值。
本发明还涉及到在多肽文库中筛选所需脂解酶的方法，方法包括a)检测文库多肽与底物发生的酶促反应的气相pH值，其中底物含有一个位于C1-C10羧酸与醇间的酯键b)挑选所需脂解酶用于挑选所需脂解酶的标准通常是根据检测所需脂解酶与其底物间的酶促反应的气相pH值。举例来说，可以根据实际的pH值，也可通过比较检测得的pH值与对照的气相pH值的不同来挑选。因而具体可以根据酶与底物反应导致气相pH值的变化来挑选目的脂解酶。对照可以是例如酶促反应发生前的气相pH值，或也可以是已知脂解酶的酶促反应的气相pH值，该已知脂解酶的酶促反应的反应条件与被用来筛选多肽文库的酶促反应相同。例如，如果文库表示亲本脂解酶变异体，就可以用亲本脂解酶与底物的酶促反应的pH值作为对照来挑选某变异体(所需脂解酶)，其变异体和底物发生酶促反应的气相pH值与通过亲本脂解酶产生的pH值是不同的。具体而言就是可以有目的性的挑选变异体(所需脂解酶)，其反应的气相pH值会高于或低于亲本脂解酶反应的pH值。
其他对照可以根据挑选所需脂解酶的标准来选择使用。
当该方法用于检测脂解酶的活性时，对照同样需要用到。比如，可以使用一种所谓的内部标准，例如，通过将被测脂解酶生成的pH值与已知脂解酶生成的pH值比较，使校正分析-再分析偏差(assay-assay variations)成为可能，这是一个本领域技术人员很熟悉的问题。这样的对照也可以用于从多肽文库中筛选所需脂解酶。
接下来的部分是为了概括本发明的所有方法，引用“酶促反应”是为了涵盖本发明的脂解酶与本发明的底物的酶促反应，以及本发明中多肽文库中的多肽与本发明的底物间的酶促反应，然而，上述文库可以含有不与本发明中的底物反应的多肽。
本发明中的酶促反应可以在液体溶液中进行。然而，在本发明的一个具体实施方案中，酶促反应可以在织物上发生。本发明上下文中所述的气相理解为与酶促反应发生相相接触的气相。举例来说，如果酶促反应在液体溶液中发生，那么本发明所述的气相是与液体溶液相接触的气相，而如果酶促反应在织物上发生，气相就是与织物相接触的气相。如果酶促反应是在封闭的容器中发生的，气相当然通过容器来界定，然而，本发明的酶促反应也可以在开放的容器中进行。如果能使酶促反应在开放容器中进行，那么从酶促反应中释放出的C1-C10羧酸就能与pH值指示剂发生反应。如前所述，在一个具体的实施方案中pH值指示剂可以在液体介质、固体介质或胶体介质(例如琼脂糖)中存在。在该实施方案中，本发明的脂解酶与底物发生酶促反应释放的C1-C10羧酸进入到上述酶促反应发生相之上的气相中，随后再进入到含有pH值指示剂的相(例如琼脂糖)中。
pH值可以在酶促反应过程中随时被检测，例如可以在酶促反应达到平衡前进行检测，和/或在释放的C1-C0羧酸在发生了/发生酶促反应的相例如液相，与气相之间达到平衡之前进行检测。测量酶活性时，原则上是测量酶与底物发生的酶促反应的反应速率。因而当本发明方法中使用对照，并且在酶促反应在达到平衡前检测pH值时，理所当然重要的是，脂解酶/所需脂解酶和底物间的酶促反应与对照和底物间的酶促反应是同时发生的。
实际上，pH值指示剂可以从酶促反应一开始就存在于气相中，经过一段时间后再读取pH值指示剂，其可以再与对照的pH值相比较。
如果酶促反应在溶液中发生，该溶液可以包含其它成分，例如盐类、pH稳定剂、去污剂等等，这些成分可以保持脂解酶/所需脂解酶的最佳活性。
脂解酶或多肽文库与底物间的酶促反应可以在任何合适的容器中进行，例如摇瓶、微量滴定板(如24孔/板、96孔/板、384孔/板、1536孔/板或每板孔数更多的滴定板)或纳升无孔隔间(nanoliter well-less compartment)。使用微量滴定板的优势在于它通常易于检测自动化，这一点在筛选多肽文库的过程中是特别有用的。
在本发明的一个具体实施方案中，脂解酶与底物间的酶促反应在一容器中进行，该容器与含有pH值指示剂的第二容器相连。例如，酶促反应在一微量滴定板上进行，而pH值指示剂在另一微量滴定板上，该滴定板倒置在发生酶促反应的滴定板上。随后便可以通过对含有pH值指示剂的微量滴定板的底部(底部朝上)的目测或自动检测来测定气相pH值。
本发明所述的方法可以通过多种方式得到使用，比如，如果脂解酶或多肽文库是被宿主细胞所表达的，那么用这些细胞的培养基肉汤作为脂解酶/多肽文库的来源。然而，“纯的”脂解酶的脂解活性也可以通过本发明中的方法来检测，其中术语“纯的”意在涵盖只包含小部分其它成分的脂解酶样品，例如至少含40w/w％、50w/w％、60w/w％、70w/w％、80w/w％、90w/w％、95w/w％或95w/w％的脂解酶的样品。
在一个具体的实施方案中，脂解酶或多肽文库与本发明的底物间的酶促反应，可以在织物上发生。因而本发明所述的方法在酶促反应之前可包括以下步骤i)将脂解酶或多肽文库与织物接触ii)可选地漂洗织物如果织物被漂洗，本发明的脂解酶或多肽文库与底物间的酶促反应在一个实施方案中可以通过在步骤i)或步骤ii)之后将脂解酶或多肽文库与该酶相接触而实现。在另一实施方案中，酶促反应可以这样实现将本发明的底物与织物相接触，任选地漂洗织物，然后将其与脂解酶或多肽文库接触。因而，在一个具体实施方案中，本发明的方法在酶促反应之前可以包括下列步骤i)将脂解酶或多肽文库与织物相接触，其中在该织物与脂解酶或多肽文库的接触前，该织物已与底物接触并可选地进行了漂冼，其中所述底物含有位于C1-C10羧酸和醇之间的酯键ii)可选地漂洗织物在本发明的一个具体实施方案中，该方法的实施可以通过使织物上存在不含位于C1-C10羧酸和醇之间的酯键的底物，例如猪油。然后可以将织物与脂解酶接触，可选地随后进行漂洗。织物上残留的脂解酶的量可以这样测量将存在于织物上的所述脂解酶与含有位于C1-C10羧酸和醇之间的酯键的底物反应，并按以上文所述方法检测该酶促反应的气相pH值。然后，该pH值可以用来衡量织物上的脂解酶的活性。
在一个具体实施方案中，通过使织物接触含有去污剂和脂解酶或多肽文库的溶液，使脂解酶或多肽文库接触织物。这一过程尤其可以在类似于洗涤衣物的条件下完成，例如，如WO02/42740中所述的，在机械应力的存在下进行。
许多C1-C10羧酸具有大多人认为难闻的气味。因此，本发明的方法也可用来检测由于脂解酶与包含位于C1-C10羧酸和醇之间的酯键的底物之间的酶促反应而释放到气相中的难闻气味。当脂解酶用于去污剂中时，洗涤后的衣物不会释放出难闻气味是特别有用的。因而本发明的方法特别可以用于筛选脂解酶，例如相比于特定的对照酶，与底物发生反应时释放更多或更少的C1-C10羧酸的脂解酶。
织物在本发明的上下文中，术语“织物”包括织品(fabrics)、服装(garments)和纱线(yarns)。
织品可以是由丝线通过编织、针织或无纺方法构造的。编织和针织要求纱线作为给料，而非织造物则是由丝线通过随机连结(random bonding)得到的(纸张可以被认为是无纺的)。在本文中，术语“织品”还意在包括纤维以及其他类型的加工织品。
编织品(woven fabric)是在织机上于纵向伸展的经纱(wrap yams)之间编织纬纱(“filling”或weft yarns)而构造的。为了润滑和保护经纱在编织时纬纱高速地插入时免遭磨损，必须在编织前为经纱上胶浆。纬纱可以以“一上一下”(平纹编织)或“一上两下”(斜纹编织)的方式或其他任意多种排列方式通过经纱来编织。强度、质地和图案不仅和纱线的类型/品质有关，而且和编织的类型有关。通常，女装(dresses)、衬衫、裤子、床单、毛巾、帷帘(draperies)等等都是由编织品制造的。
针织是通过联结纱线的联锁线圈而形成织品。编织是由两种纱线构造的并有许多“端头”(ends)，与之相反，针织物则是由单股连续的纱线制造的。就象编织那样，有许多不同的方式把纱线圈绕在一起，而最终织品的特性都依赖于纱线和针织的类型。内衣裤、毛衣、短袜、运动衫、汗衫等等通常来源于针织品。
无纺织品(non-woven)是片状织品，是通过机械、热、化学或溶剂介导的过程连接和/或联锁纤维与纤丝(filaments)而制造的。生成的织品可以是网状结构(web-like structure)、片层(laminates)或膜(films)的形式。典型例子是一次性婴儿尿布、手巾、擦拭用品(wipes)、外科大褂、“环保(environmental friendly)”型时装所用纤维、过滤介质、被褥、屋面材料、二维织物衬里和许多其它物品。
用于本发明的织物可以是任何已知的织物(编织的、针织的、或无纺的)。具体而言，织物可以是含纤维素的或纤维质(celluosic)的织物，例如棉、粘胶纤维、人造丝、苎麻布、亚麻、lyocell(例如，由Courtaulds Fibers生产的Tencel)、或它们的混合物，或者，它可以是合成织物，例如聚酯、聚酰胺、或尼龙或这些物质的混合物，或者含纤维素或纤维质的纤维与合成纤维的混合物的织物。另一个合适织物的例子是包含其它天然纤维的织物，例如毛料、丝或它们的混合物、或者它们与上述的一种或多种纤维的混合物的织物。纤维混合物的例子包括但不限于粘胶纤维/棉混合物、lyocell/棉混合物、粘胶纤维/毛料混合物，lyocell/毛料混合物、棉/毛料混合物；亚麻(亚麻布)、苎麻及其他基于纤维质纤维的织品，包括所有纤维质纤维同其他的纤维，例如毛料、聚酰胺、丙烯酸类纤维与聚酯纤维的混合物，例如棉/聚酯混合物、粘胶纤维/棉/聚酯混合物、毛料/棉/聚酯混合物、亚麻/棉混合物等等。术语“毛料”是指任何商业使用的动物毛产品，例如，来自绵羊、骆驼、兔子、山羊、美洲驼的毛料，和著名的美利奴(merino)羊毛、设得兰(Shetland)羊毛、开斯米(cashmere)羊毛、阿尔帕卡(alpaca)毛、马海毛(mohair)等等，并包括了毛纤维与动物毛。这些织物可以是经漂白的、染色或非染色的。术语“聚酯”是指聚(对苯二甲酸亚乙酯)，它通过缩合合成，熔融抽丝，可能还被切段分级、可能还与其他纤维类型混合，再纺成纱线。纱线染色并且针织成布匹或者被制成地毯，或者纱线织成织品并染色。
酶结合或粘附于织物的能力不但取决于特定的酶，而且取决于织物的类型。例如，在漂洗期间，通常从聚酯制成的织物上去除脂解酶要比从棉纱制成的织物上去除脂解酶来得更困难，因为相比于较亲水的材料，脂解酶倾向于更稳固地结合并粘附于疏水性材料。
漂洗在本发明的上下文中，术语“漂洗”应理解为用水基溶液与织品接触，接着除去所述溶液，其中术语“水基溶液”应理解为最多包含20w/v％非水成分的溶液，例如最多10w/v％或5w/v％或3w/v％或2w/v％或1w/v％或0.5w/v％的非水成分。这些非水成分的例子将在下文给出。
由于本发明所述的方法可以用来模拟洗衣过程，漂洗就可以特别地模拟在洗涤衣物期间的漂洗条件。通常，衣物是用水漂洗的；然而水的组成依赖于水的来源而变化，例如它可能是河水、泉水或地下水。此外，水源的地理位置可以影响其成份。
给定水源的水硬度(总硬度)取决于其碱土金属钙、镁、锶和钡的盐的含量。由于通常锶和钡在水中仅仅微量存在，所以水的硬度定义为钙离子(Ca2+)和镁离子(Mg2+)的含量。表述水的硬度的习惯做法是将水硬度的表示仅与钙关联，也就是说将镁离子的含量也表示为钙含量。经常用于硬度的实际测量单位是所谓的德国度，其定义如下1°dH＝10mg/lCaO。
“硬”水是那些包含高浓度的碳酸钙及其他矿物质的水。
“软”水是那些包含低浓度的碳酸钙及其他矿物质的水。
那些存在于用来漂洗的水基溶液中的其它组分的实例包括但不限于缓冲液，特别是pH值在4-10之间的缓冲液、盐类、软化剂和少量的去污剂。如果织物和酶/多肽文库已经在去污剂存在下进行了接触，例如通过织物的“洗涤”，则特别可能存在少量的去污剂。适宜的缓冲液的实例包括但不限于如下表格1所述。
表格1
除如上所述的Ca2+和Mg2+离子之外，存在于水基溶液中的盐类或离子的实例包括但不限于NaCl、KCl、锶和钡。
在洗涤中为了改善衣物的手感和清新度并减少静电积累，软化剂常常被使用(参见例如Levinson MI，1999，Journal of Surfactants and Detergents，2，223-235)。软化剂中的主要成分之一是阳离子表面活性剂(tensides或surfactants)，例如二氨基胺(diamidoamine)、双酯季铵盐(diester quaternary)或基于三乙醇胺的esterquat，然而，它也可以包含其它成分例如芳香剂、防腐剂、缓冲液、染料、荧光增白剂、酶、染料稳定剂、紫外线吸收剂、氯清除剂和/或电解质(参见例如Levinson MI，1999，Journal of Surfactants and Detergents，2，223-235)。
容器本发明还涉及了包含至少两个部分的容器，其中一个部分包含一个pH值指示剂，另一个部分适于容纳液体。所述容器可以具有任意物理形式并可以由任意材料制成。特别地，容器可以具有这样的物理(physical)形式，使得可以从容器外部读出由pH值指示剂所指示的pH值，例如，包含pH值指示剂的容器的那一部分可以特别地由透明材料制成。在一个具体实施方案中，所述容器也具有这样的物理形式，使得可以自动读取pH值指示剂所指示的pH值，例如通过使用可以根据所选pH值指示剂来测量吸光率或荧光的装置。在一个具体实施方案中，所述容器可以包含多个容器，每个容器包括两个部分，其中一部分包含一pH值指示剂而另一部分适于容纳液体。更具体地，所述的多个容器可以具有这样的物理形状两个微量滴定板置于彼此顶部，其中一个滴定板倒置(upside down)另一个使得各个板的孔彼此相对。如果该容器包含多个容器，那么可以特别使用防止气体从一个容器进入另一个容器的手段。例如，可以将材料片置于容器的两个部分之间，其中所述材料具有与每一单独的容器相对应的孔洞。可以如实施例中的描述其中一片石蜡封口膜置于第一微量滴定板上，所述石蜡封口膜包含孔洞，所述孔洞与微量滴定板的各孔口互相连通，然后将第二微量滴定板微量滴定板倒置于第一微量滴定板上，使得第一和第二微量滴定板的孔口相互接通。如此，第一微量滴定板的各个孔口将和第二微量滴定板的孔口接通，同时第一微量滴定板的孔口之间的区域与第二微量滴定板的类似区域之间将被石蜡封口膜所封堵。
但是，其它形状的容器与/和其它材料制成的容器也可以被应用。
材料与方法脂解酶Lipolase是来源于在EP 258068和EP305216中描述的Humicola lanuginosa的脂肪酶。Lipex是Lipolase的变体并已在WO 0060063中描述。
培养基SC＝合成的完全培养基方法微洗涤(Micro-laundry)把被猪油或黄油污染的织物样品冲压进96孔微量滴定板的孔中。每个孔中施加150μl的去污剂(100mM的L-精氨酸)。将10μl的表达要测定的酶的酵母细胞上清液(已于微量滴定板上SC培养基中生长3-4天)加入到每个孔中，接着将微量滴定板在30℃，500rpm下保温20分钟。用洗板器除去洗涤水，接着如下所述样品漂洗。
漂洗在用不同的酶浓度进行微洗涤(Micro-laundry)试验(如上所述)后，使用硬度为15°dH的人工制得的水(参见材料与方法部分)漂洗存在于微孔中的织物样品。
漂洗过程这样进行加入180微升硬度为15°dH的水，将板置于300rpm的定轨振荡器上5分钟，然后除去漂洗水。这个漂洗过程总共重复3次。在最终除去漂洗水之后，向孔中加入脂肪酶底物，用于测定存在于各个织物样品上的脂肪酶活性。
酸碱指示板(溴甲酚绿-琼脂糖)将1克琼脂糖(Gibco BRL，Life technologies)溶于100ml 0.1mM的四硼酸二钠十水合物(#0268 JT Baker，Mallinckrodt Baker，Deventer，Holland)。
在微波炉中略微加热溶液直到全部的琼脂糖被融化。在冷却到55℃后，在0.1mM的硼酸钠中加入溴甲酚绿直到终浓度为0.006％。
制备两种不同的带溴甲酚绿-琼脂糖的板a)聚苯乙烯微孔板(标准尺寸96孔的微量滴定板)的每个孔中加80微升b)小容量微批量板(microbatch plate)的每个孔中加15微升将这些板送到分光光度计，在614nm处测量板上每个孔的吸光率，从而读取pH值。
在614nm处的高吸光率表明pH值没有变化，而在614nm处的低吸光率表明pH值已下降，也就是说更为酸性。
由于在洗涤及漂洗后已清洗的织物还可包含极少量的脂肪酶，它能够降解同样还存在于织物上的黄油，使之变成脂肪酸。这些脂肪酸中的一部分是有挥发性的，将从织物上蒸发，通过洗涤板的孔进入对面包含溴甲酚绿-琼脂糖的板(pH值指示板)。这些游离脂肪酸将进入缓冲液，并且由于它的酸性将降低pH值，从而指示剂将相应变化。
实施例实施例1用不同脂肪酶洗涤的织物样品的短链脂肪酸释放的测定将被黄油和苏丹红沾染的织物样品置于96孔微量滴定板的孔中。用Lipase，Lipex，Var3或Var5以0，0.12，0.25，0.5，1或2ppm的酶浓度按照微洗涤试验(如上所述)洗涤样品，接着如上所述漂洗。这个漂洗过程总共重复3次。在漂洗水最终除去之后，在该包含经过洗涤和漂洗的织物样品的96孔板的顶端放置石蜡封口膜，该石蜡封口膜具有与每个孔的开口相对应的洞。
将一包含80微升溴甲酚绿-琼脂糖/孔(a)的pH值指示板，和一包含15微升溴甲酚绿-琼脂糖/孔的板，各自倒置于包含经过洗涤和漂洗的织物样品的96孔板的顶端。这些板这样放置，使得带96洞的石蜡封口膜成为织物板和指示板之间的渗漏密封。这样的板夹层结构(plate sandwich)以大约2公斤的重量装配来保持很好的密封，所以任何蒸发的化合物都被垂直方向地传到指示板上的垂直孔，而不被水平地传到其它指示孔。在室温下保温18小时后，在分光光度计中测定有溴甲酚绿-琼脂糖的孔在614nm处的吸光率。结果如下显示在表2中。
表2
这些结果表明Var3和Var5两者比Lipolase和Lipex更多地降低了气相pH。
在类似的方案中用气相色谱法测定释放的C1-C10羧酸数值，显示了类似上述的结果。
权利要求
1.测定脂解酶活性的方法，其包含测定脂解酶与底物间的酶促反应的气相pH值，其中底物包含位于C1-C10羧酸和醇之间的酯键。
2.从多肽文库筛选所需脂解酶的方法，其包含a)测定文库的多肽与底物间的酶促反应的气相pH值，其中底物包含位于C1-C10羧酸和醇之间的酯键；b)选择所需的脂解酶。
3.根据前述任一项权利要求的方法，其中C1-C10羧酸选自丁酸、戊酸、己酸和辛酸。
4.根据前述任一项权利要求的方法，其中醇是丙三醇。
5.根据权利要求4的方法，其中底物是甘油三酯。
6.根据前述任一项权利要求的方法，其中底物是甘油三酯和脂肪酸的混合物，例如乳脂、黄油、橄榄油。
7.根据前述任一项权利要求的方法，其中脂解酶或所需脂解酶是脂肪酶(E.C.3.1.1.3)。
8.根据前述任一项权利要求的方法，其中底物存在于织物上。
9.根据前述任一项权利要求的方法，其中在酶促反应之前，所述方法包含以下步骤i)将脂解酶或多肽文库与织物接触，和ii)可选地漂洗织物。
10.包含至少两个部分的容器，其中一个部分包含pH值指示剂，其它部分适于容纳液体。
全文摘要
本发明涉及一种测定脂解酶活性的方法，其包括测定脂解酶与底物间的酶促反应的气相pH值，其中底物包含位于C1－C10羧酸和醇之间的酯键。此外，还涉及一种从多肽文库中筛选所需脂解酶的方法，在所述方法中包括了文库检测。
文档编号C12Q1/44GK1965077SQ200580018643
公开日2007年5月16日 申请日期2005年6月7日 优先权日2004年6月7日
发明者马茨·E·比约恩瓦德, 格诺特·阿贝尔 申请人:诺维信公司