L－氨基酸酰胺不对称水解酶及其编码dna的制作方法

专利名称：L－氨基酸酰胺不对称水解酶及其编码dna的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的L-氨基酸酰胺不对称水解酶和其编码DNA，以及其用途。更具体地，本发明涉及新的酶，所述酶具有至少立体选择性水解L-氨基酸酰胺，尤其是L-2-烷基半胱氨酸酰胺(L-2-alkylcysteine amide)的酰胺键的活性；编码所述酶蛋白的DNA；其中已引入了所述DNA的重组微生物；利用所述重组微生物显著提高酶的培养物生产率的方法，以及利用所获得的酶有效地将L-氨基酸酰胺转变为L-氨基酸的方法。光学活性氨基酸和氨基酸酰胺，尤其是光学活性2-烷基半胱氨酸和2-烷基半胱氨酸酰胺是用作多种工业化学品、药物、和农业化学品的生产中间体的重要原料。
背景技术：
作为从氨基酸酰胺生产光学活性氨基酸的方法，例如，包括利用微生物或这种微生物的细胞处理产物的方法被称为工业上有益的方法，所述微生物含有立体选择性不对称地水解外消旋的氨基酸酰胺的酰胺键的酶(专利文献1和2)。这种作为源于活体的催化剂的酶具有极好的特征，其允许在温和反应条件下以极高的反应特异性生产目标产物。然而，其可催化的底物类型是有限的，并且由于细胞生产的酶量少因而反应需要大量的细胞，因此，由于其经济上的劣势，存在所述方法不能使用的技术问题。
因此，为了增加具有上述活性的酶的生产量，已试图通过基因重组技术克隆编码酶蛋白的DNA来制备转化体，所述酶立体选择性地水解氨基酸酰胺，然后利用所述转化体由外消旋的氨基酸酰胺生产光学活性氨基酸(专利文献3至8和非专利文献1)。
例如，专利文献3公开了来自贪噬菌属(Variovorax)的D-酰胺酶、编码所述D-酰胺酶的DNA、均含有这种核酸的质粒、载体和微生物、与所述核酸杂交的核酸、用于生产所述核酸的引物等等。专利文献4公开了修饰的氨基酸酰胺酶和利用所述修饰的氨基酸酰胺酶生产D-氨基酸的方法。然而，这些方法只能对D-氨基酸酰胺起作用，因此L-氨基酸酰胺不能通过所述方法水解。
另一方面，作为作用于L-氨基酸酰胺的酶的例子，专利文献5公开了立体选择性水解L-氨基酸酰胺的酰胺键的酶，其源自产氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans)，以及编码所述酶的DNA。所述酶对L-脯氨酸酰胺有高活性，但对其它L-氨基酸酰胺具有低活性。
此外，专利文献6公开了源于食酸丛毛单胞菌(Comamonas acidovorans)的酶蛋白和编码所述蛋白质的DNA，以及利用所述酶蛋白生产光学活性有机酸的方法。专利文献6也公开了氨基酸酰胺的不对称水解(asymmetrichydrolysis)，其中只有亮氨酸酰胺和苯丙氨酸酰胺用作底物。还有，专利文献7公开了具有立体选择性水解α-氨基酸酰胺和α-羟基酸酰胺(α-hydroxylic acidamide)的酰胺酶活性的蛋白质以及编码所述蛋白质的DNA。然而，只公开了叔-亮氨酸酰胺作为优选的氨基酸酰胺底物。另外，专利文献8公开了获得含肽酰胺酶的微生物的方法、由所述方法获得的微生物、包含在所述微生物中的肽酰胺酶、和使用它们的方法。此酶对二肽酰胺、N-乙酰氨基酸酰胺、或受保护的氨基酸酰胺具有高活性，而不具有水解未保护的氨基酸酰胺的活性。更进一步，非专利文献1公开了立体选择性水解在α位置具有烷基的氨基酸酰胺的酶。然而，其中公开的例子限于具有碳氢化合物型侧链的氨基酸如甲基缬氨酸、甲基亮氨酸、和甲基苯丙氨酸，根本没有有关在侧链中具有巯基和烷基的2-烷基半胱氨酸的描述。
2-烷基半胱氨酸是烷基半胱氨酸的衍生物，其为非典型氨基酸，不同于典型的天然氨基酸，在α位置的碳原子上具有烷基并且在其分子中有多个反应性取代基，包括巯基、氨基和羧基。特别地，2-烷基半胱氨酸的光学活性形式是预期广泛用作多种工业化学品、药物、农业化学品等等的生产原料或一般手性结构单元(general chiral building block)的化合物，从工业的观点来说也是极为有用的，因此一直希望开发其工业上有益的且廉价的生产方法。
然而，如上所述，具有立体选择性地水解L-2-烷基半胱氨酸酰胺中的酰胺键活性的酶仍然是未知的，因此，利用这样的酶生产光学活性2-烷基半胱氨酸或光学活性2-烷基半胱氨酸酰胺的方法也是未知的。此外，对于L-氨基酸酰胺水解酶和有效地生产和利用该酶的方法一直存在需求，所述的L-氨基酸酰胺水解酶是高活性和高立体选择性的，且对其它L-氨基酸酰胺具有广泛的底物谱，以便可以应用于用作工业原料的多种氨基酸酰胺。
专利文献1JP-A-61-293394专利文献2JP-A-62-55097专利文献3JP-A-2003-225094专利文献4JP-A-2002-253256专利文献5JP-A-2003-250558专利文献6JP-A-08-256771专利文献7WO 00/63354专利文献8日本专利No.3112090非专利文献1H.F.M.Hermes等，Applied and Environmental Microbiology，Vol.60，No.1，p.153-159，1994发明内容本发明的目的是提供L-氨基酸酰胺不对称水解酶、编码该L-氨基酸酰胺不对称水解酶的DNA、重组微生物，其中已导入了包含该DNA的重组DNA、和利用它们生产光学活性氨基酸，尤其是光学活性2-烷基半胱氨酸的方法，上述所有均可优选用于生产光学活性氨基酸，尤其是光学活性2-烷基半胱氨酸，其为工业上有用的化合物，预期将广泛用作多种工业化学品、药物、和农业化学品的生产中间体。
本发明的发明人进行了深入的研究，以解决上述问题，结果发现了具有高的立体选择性地水解L-氨基酸酰胺尤其是L-2-烷基半胱氨酸酰胺中的酰胺键的酶活性的微生物，并且首次从所获得的微生物分离并纯化了显示上述催化活性的酶。此外，本发明的发明人首次分离并获得了编码该酶的DNA，并成功制备了包含所述DNA的重组DNA和重组微生物，其中所述重组DNA已被导入到重组微生物用于表达。此外，通过培养由此获得的重组微生物，有可能制备具有比野生型菌株明显更高的比活性(specific activity)的细胞或酶溶液，以非常有效地将L-氨基酸酰胺尤其是L-2-烷基半胱氨酸酰胺转变为相应的L-2-烷基半胱氨酸，所述野生型菌株已被用作DNA供体。
本发明的L-氨基酸酰胺不对称水解酶不仅具有不对称水解L-2-烷基半胱氨酸的活性，还具有非常广泛的底物谱。也就是说，L-氨基酸酰胺不对称水解酶能够不对称地水解相应于天然的典型氨基酸如L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、和L-苯丙氨酸的许多L-氨基酸酰胺，以及相应于所谓的非典型氨基酸如L-2-氨基丁酸、L-叔-亮氨酸、L-苯基甘氨酸、L-对-氯苯基甘氨酸、L-ε-醛基赖氨酸(アリシン)乙二醇缩醛(L-allicin ethylene acetal)、L-青霉胺(L-penicillamine)、和(4R)-5，5-二甲基-1，3-噻唑烷-4-羧酸((4R)-5，5-dimethyl-1，3-thiazolidin-4-carboxylic acid)的L-氨基酸酰胺。如上所述，本发明的酶是具有严格的立体特异性和与许多L-氨基酸酰胺反应的特性的新酶，所述的立体特异性选择性地水解L-氨基酸酰胺中的酰胺键，因此它是工业应用中非常出色的并不同于已知酶的酶。
也就是说，本发明涉及以下(1)中所述的L-氨基酸酰胺不对称水解酶、以下(2)或(3)中所述的编码L-氨基酸不对称水解酶的DNA、以下(4)或(5)中所述的重组微生物、以下(6)中所述的利用所述酶从L-氨基酸酰胺生产L-氨基酸的方法、和以下(7)至(9)中所述的从L-2-烷基半胱氨酸酰胺生产L-2-烷基半胱氨酸的方法。
(1)立体选择性地水解L-氨基酸酰胺的酰胺键的酶，其中所述酶包括SEQID NO8中氨基酸编号1至355代表的氨基酸序列，或者包括缺失、取代或添加1个或多个氨基酸的所述氨基酸序列。
(2)编码根据(1)的酶的酶蛋白的DNA。
(3)根据(2)的DNA，其包括SEQ ID NO7中核苷酸编号868至1932代表的核苷酸序列，或者在严紧条件下与所述核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
(4)重组微生物，其中已经导入了根据(2)或(3)的DNA。
(5)根据(4)的重组微生物，其中所述重组微生物是大肠杆菌(Escherichiacoli)。
(6)生产L-氨基酸的方法，其包括使L-氨基酸酰胺与根据(1)的酶反应以将所述的L-氨基酸酰胺转变为L-氨基酸。
(7)根据(6)的生产方法，其中所述L-氨基酸酰胺是式1代表的化合物 式(1)中，R1代表氢、低级烷基、取代的低级烷基、苯基、取代的苯基、杂环基团、取代的杂环基团、或者与和R1结合的碳原子及和所述碳原子结合的氨基组合形成含氮杂环的基团。此处，低级烷基的例子包括具有1至4个碳原子的烷基。取代的低级烷基的例子包括具有1至4个碳原子的烷基，其中一个或多个氢被例如羟基、甲氧基、巯基、甲基巯基、氨基、脒基、羧基、氨甲酰基、卤素基团、苯基、羟基苯基或咪唑基取代。取代的苯基的例子包括其中任意的氢被羟基、甲氧基、巯基、甲基巯基、氨基、脒基、羧基、氨甲酰基或卤素基团取代的苯基。杂环基团的例子包括吲哚基和咪唑基。取代的杂环基团的例子包括杂环基团如上述的吲哚基或咪唑基，其中任意的氢被羟基、甲氧基、巯基、甲基巯基、氨基、脒基、羧基、氨甲酰基、或卤素基团取代。与和R1结合的碳原子及和所述碳原子结合的氨基组合形成含氮杂环的基团的例子包括吡咯烷环、吡咯环、噻唑烷环、和唑烷环。
R2代表氢或具有1至4个碳原子的低级烷基。
但是，R1和R2同时代表氢的化合物排除在化合物(1)之外。
(8)根据(6)的生产方法，其中所述L-氨基酸酰胺是式2代表的化合物 式(2)中，R代表具有1至4个碳原子的低级烷基。
(9)根据(8)的生产方法，其中式(2)中的R为甲基。
本发明的酶可以具有SEQ ID NO8中所示氨基酸编号1至355代表的氨基酸序列，其中缺失、取代、或添加1个或多个氨基酸，只要所述酶不丧失其活性。“多个”氨基酸的数目优选为2至20个，更优选2至10个，特别优选2至5个。本发明的酶与SEQ ID NO8的氨基酸序列可以具有不小于80％，优选不小于90％，更优选不小于95％的同源性，并且具有立体选择性地水解L-氨基酸酰胺中的酰胺键的酶活性。
此外，编码本发明的酶的DNA可以是在严紧条件下与具有SEQ ID NO7的核苷酸编号868至1,932的核苷酸序列的DNA杂交的DNA，并且其编码立体选择性地水解L-氨基酸酰胺中的酰胺键的酶。所述严紧条件的例子包括具有不小于80％、优选不小于90％、更优选不小于95％同源性的DNAs相互杂交的条件。其具体例子包括实施杂交反应、并在60℃、1×SSC、0.1％SDS，优选在60℃、0.1×SSC、0.1％SDS，特别优选在65℃、0.1×SSC、0.1％SDS的条件下进行洗涤的条件。
优选实施方案描述以下将详细描述本发明的实施方案。
用作编码本发明的酶的DNA供体的微生物为具有立体选择性地水解L-氨基酸酰胺，尤其是L-2-烷基半胱氨酸酰胺中的酰胺键的酶活性的微生物。发现这种微生物的方法的例子包括从储存在典型培养物(type culture)中的菌株等选择的方法，以及从自然界分离的方法。本发明的发明人首先考察了保藏的菌株，并发现属于精朊杆菌属(Protaminobacter)、枝动菌属(Mycoplana)、黄色杆菌属(Xanthobacter)的微生物，更具体地，相应于所述微生物的白黄精朊杆菌(Protaminobacter aldoflavus)、多枝枝动菌(Mycoplana ramose)、两形枝动菌(Mycoplana dimorpha)、自养黄色杆菌(Xanthobacter autotrophicus)、黄黄色杆菌(Xanthobacter flavus)等等具有上述酶活性。
接下来，集中进行从自然界分离更优选的菌株。结果，本发明人成功地分离了鉴定为黄黄色杆菌(X.flavus)的新菌株。该菌株为非运动性革兰氏阴性杆菌，如以下真菌学特性所示(表1)，并鉴定为属于黄色杆菌属的微生物，因为它是多态的、过氧化氢酶阳性、和氧化酶阳性的。此外，利用16SrDNA(16SrRNA基因)约500bp的部分核苷酸序列评估了该微生物的分类单位(taxon)，结果，所述部分核苷酸序列与黄黄色杆菌的核苷酸序列一致，具有100％同源性，而且该菌株在分子树状图上与黄黄色杆菌位于相同位置，因此将该微生物鉴定为黄黄色杆菌，并命名为NR303菌株。
表1.真菌学特性细胞形态 杆菌大小(0.5-0.6×2.0μm)多态性 存在运动性 不存在是否存在孢子不存在革兰氏染色菌落形式(营养琼脂，30℃，24小时)圆形完全光滑的凸起的有光泽的奶油色生长温度37℃ +40℃ -过氧化氢酶 +氧化酶 +酸性/产气(葡萄糖)-/-O/F测试(葡萄糖) -/-硝酸盐的还原 +吲哚的产生 -葡萄糖的酸化 -精氨酸二水解酶 -脲酶 +七叶苷(エスクリン)水解 -明胶水解 -β-半乳糖苷酶-细胞色素氧化酶 +同化特性葡萄糖 -L-阿拉伯糖 -D-甘露糖 -D-甘露醇 -N-乙酰-D-葡糖胺 -麦芽糖 -葡萄糖酸钾 +正-癸酸 -己二酸 -dl-苹果酸+柠檬酸钠 +乙酸苯酯 -
厌氧生长 +以下将作为实施例来描述分离黄黄色杆菌NR303菌株的氨基酸酰胺不对称水解酶基因的方法和将所述基因导入大肠杆菌JM109菌株的方法，其中黄黄色杆菌NR303菌株已经由本发明的发明人新近分离。
利用含有通常能被同化的碳源、氮源、无机盐和各种微生物必需的营养物等的培养基进行提供DNA的微生物的培养。培养期间，优选4至10范围的pH，并优选20至39℃的温度。所述培养物在有氧条件下进行约1天至约1星期。
酶的纯化可以利用酶纯化的一般方法进行。也就是说，培养完成后，通过一般程序如离心或用膜分离，从培养溶液收集细胞，然后细胞用机械方法如超声处理破碎。此后，残留物通过离心等去除以获得粗酶溶液。接下来，可以通过使所述粗酶溶液经过盐析、吸附层析、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤层析、结晶等等来纯化。
所纯化的酶的N-末端氨基酸序列利用自动化Edman降解氨基酸测序仪HPG 1005A蛋白质测序系统(Hewlett-Packard Development Company)来测定，以所测定的N末端序列为基础设计用于PCR扩增的寡核苷酸(引物)。从黄黄色杆菌提取的染色体DNA用作模板，通过PCR扩增DNA并进行标记，由此获得探针。
用适当的限制酶如EcoRI部分消化从黄黄色杆菌提取的DNA。DNA片段和标记的DNA探针用于实施Southern杂交。提取并纯化此次鉴定的DNA，然后连接至适当的质粒载体，以转化大肠杆菌。
所标记的DNA探针用于菌落杂交，以获得含有目标DNA片段的克隆质粒。利用所述质粒测定已经掺入载体中的源于黄黄色杆菌的DNA的核苷酸序列。在所测定的核苷酸序列中鉴定L-氨基酸酰胺不对称水解酶基因氨基酸序列的开放阅读框(open reading flame)，由此证实上述步骤中获得的DNA片段中L-氨基酸酰胺不对称水解酶基因完全编码区的存在。
以所得L-氨基酸酰胺不对称水解酶基因的核苷酸序列为基础设计引物。从黄黄色杆菌提取的染色体DNA用作模板以通过PCR扩增上述DNA，并将所获得的DNA连接到质粒载体pUC19。将所得质粒命名为pMCA1。将pMCA1用于转化大肠杆菌JM109，将具有L-氨基酸酰胺不对称水解酶基因的重组细菌命名为pMCA1/JM109。
所获得的转化体pMCA1/JM109已于2004年5月21日以保藏号FERMAP-20056保藏在国际专利生物保藏单位(International Patent OrganismDepositary)，产业技术综合研究所(National Institute of Advanced IndustrialScience and Technology)(Tsukuba Central 6，1-1-1 Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本，邮政编码305-5466)，然后又依据布达佩斯条约转变为国际保藏，并给予保藏号FERM BP-10334。因此，编码本发明的酶的DNA也可以由所述转化体包含的质粒pMCA1获得。例如，质粒pMCA1可以用限制酶消化以获得上述DNA，所述限制酶识别存在于pUC19的多克隆位点中的序列，或者质粒pMCA1可以用作模板，利用以SEQ ID NO7的核苷酸序列为基础设计的引物进行PCR，由此获得上述DNA。
同时，本发明的DNA可以从黄黄色杆菌的其它菌株或除黄黄色杆菌之外的微生物的染色体获得。例如，利用以SEQ ID NO7的核苷酸序列为基础设计的探针，可以通过杂交反应从所述微生物的染色体DNA分离源于上述任一微生物的编码上述酶的DNA。
用于将本发明的DNA导入宿主微生物的载体可以是任何质粒载体如pUC18、pUC19、和pUC118以及噬菌体载体如λgt11。此外，本发明的DNA可以直接掺入宿主微生物的染色体中而不使用载体。用于转化的宿主微生物的例子包括，但不限于，属于埃希氏菌属(Escherichia)的细菌如大肠杆菌的JM105菌株和JM109菌株。
处理DNA或作为重组宿主的大肠杆菌所需的操作是本领域熟练技术人员通常所使用的，并且这些操作可以根据例如Molecular CloningA LaboratoryManual，3rd Ed.(ed.Sambrook J.and Russel D.W.)，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，2001(在下文中称为分子克隆第三版(Molecular Cloning 3rd Ed.))很容易地进行。所要使用的酶、试剂等都是商业上可获得的产品，并且除非另有说明，其目的完全可以根据指定的使用条件获得。从细菌提取全DNA可以根据例如Saito等(Biochim.Biophys.Acta.，72，619-629，1963)的方法进行。此外，标记DNA可以利用传统上常用的放射性同位素或非放射性化合物如异羟基洋地黄毒甙元(digoxigenin)、生物素和荧光素进行，并且可以利用RediprimeTMII Random Prime LabellingSystem(Amersham Pharmacia Biotech)、AlkPhosTM Direct Labelling andDetection System(Amersham Pharmacia Biotech)等等容易地进行。DNA的核苷酸序列的测定也可以利用分子克隆第三版等中描述的已知方法来进行。例如，可以根据所附手册说明，利用仪器如Li-Cor DNA测序仪4000L型容易地进行测定。此外，可以根据分子克隆第三版等中描述的方法等进行杂交。
利用含通常能够被同化的碳源、氮源、无机盐和微生物必需的营养物等的培养基进行本发明的转化体微生物的培养。培养期间，优选4至10范围的pH，并优选20至50℃的温度。培养在有氧条件下进行约1天至约1星期。本发明的酶可以通过一般的纯化方法从如此培养的转化体微生物获得。如此获得的酶可以用于从L-氨基酸酰胺如式(I)代表的化合物立体选择性地产生L-氨基酸的反应。在D-和L-氨基酸酰胺的混合物如外消旋化合物为底物的情况中，获得L-氨基酸和D-氨基酸酰胺的混合物。在这个情况中，L-氨基酸和D-氨基酸酰胺分别通过将它们彼此分离而获得，并将分离的D-氨基酸酰胺单独进行水解，由此获得D-氨基酸。此外，在酶学反应的底物仅由L-氨基酸酰胺组成的情况中，获得相应于L-氨基酸酰胺的L-氨基酸。所述转化体的细胞或细胞处理产物也可用于上述反应。例如，含细胞的培养溶液、分离的细胞、破碎的细胞等等可以用于上述反应。另外，细胞或酶可以根据一般方法固定并使用。
反应条件根据反应溶液中包含的L-氨基酸酰胺的种类和量而改变。然而，反应溶液中作为原料的氨基酸酰胺的浓度为0.1至40wt％，以包含酶的重组微生物的干细胞为基础，酶量为原料氨基酸酰胺重量的0.00001至3倍或者，通常优选0.00005至0.001倍。反应温度为10至70℃，并优选20至60℃，pH为4至13，优选5至10，或者更优选6至9。同时，当2-烷基半胱氨酸酰胺和2-烷基半胱氨酸置于有氧存在的条件下时，其倾向于被氧化并成为二聚化二硫化物。为了阻止该现象，生物化学不对称水解反应优选在惰性气体气氛如氮气下进行，但是也可以使用包括允许还原性物质如2-巯基乙醇共存于所述系统中的方法。同时，如果进行之前反应中对所有要使用的溶剂都脱气(deaerate)，则没有副产物产生，所述反应有利地进行。进行所述反应时，向反应体系添加如Mg、Cu、Zn、Fe、Mn、Ni、Co的金属离子能够进一步提高反应速率。添加的量通常无法描述，因为它根据金属离子的种类而有所变化，但希望以优选1至50ppm、或者更优选5至20ppm的浓度添加这种金属离子。例如，当添加5至20ppm的二价Mn离子时，与不添加离子的情况相比，反应速率显著提高到2至5倍。在另一方面，已用于所述不对称水解反应的细胞或细胞处理产物可以通过离心、过滤方法等手段收集，以再次用作不对称水解反应的酶学催化剂。当反应溶液中原料氨基酸酰胺的浓度高时，相对于氨基酸酰胺的酶量，可以在3倍或3倍以下的用量比范围内(其中3倍是用量比优选范围的上限)，适当地选择最适于反应进行的比例。
从不反应的D-氨基酸酰胺分离DL-氨基酸酰胺不对称水解反应中产生的L-氨基酸可以利用但不具体限于以下方法其包括通过一般固液分离手段如离心或过滤膜从完成反应后获得的溶液去除微生物细胞，然后在减压下浓缩所得溶液，并添加有机溶剂以由此沉淀氨基酸的方法；或者已知的方法如重结晶或柱层析法。用离子交换树脂进行的离子交换电渗析法，或利用离子交换树脂通过吸附/解吸进行分离的方法也是有效的。
本发明的L-氨基酸酰胺不对称水解酶具有有效水解L-2-烷基半胱氨酸酰胺中的酰胺键的特征，此外，其还具有极广泛的底物谱，因此可以利用本发明的酶产生相应于各种L-氨基酸酰胺的L-氨基酸。除了2-甲基-L-半胱氨酸之外，所述氨基酸的具体例子包括组成蛋白质的氨基酸如L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、和L-苯丙氨酸，还包括所谓的非蛋白质氨基酸如L-2-氨基丁酸、L-叔-亮氨酸、L-苯基甘氨酸、L-对-氯苯基甘氨酸、L-ε-醛基赖氨酸乙二醇缩醛、L-青霉胺、和(4R)-5，5-二甲基-1，3-噻唑烷-4-羧酸。
实施例将通过参考实施例和比较实施例更详细地描述本发明，但本发明不限于此。
实施例1氨基酸酰胺不对称水解酶的分离将黄黄色杆菌NR303菌株接种到3L培养基中，所述培养基具有以下表2所示的组成，在30℃培养170小时，然后通过离心获得细胞。以超声方式破碎240g湿重的细胞，并将所得物进行离心，由此制备无细胞提取物。
表2.培养基组成(NH4)2SO43gKH2PO41.4gNa2HPO43g
NaHCO30.3gMgSO4·7H2O 0.2g2％CaCl21g酵母提取物 0.2g维生素混合物1g尿素1g丙三醇 10g痕量元素3.5g1L(pH 7.0)将硫酸铵添加到无细胞提取物到30％饱和，并进行离心以去除沉淀。然后，再向上清添加硫酸铵到60％饱和。通过离心收集所产生的沉淀，并溶解于100mM磷酸钾缓冲液中，相对于10mM磷酸钾缓冲液将所得溶液进行透析。将所得产物吸附到DEAE-Toyopearl树脂(Tosoh Corporation)，所述树脂已用10mM磷酸钾缓冲液平衡过，之后进行离子交换层析。顺序使用Butyl-Toyopearl柱(Tosoh Corporation)和Gigapite柱(Seikagaku Corporation)将所获得的显示氨基酸酰胺不对称水解酶活性的级分进行柱层析，每种柱子都使用硫酸铵。通过SDS-PAGE分离所得到的纯化的酶，由此确认了所纯化的酶显示单一条带，并具有40,000的分子量。
实施例2N-末端氨基酸序列分析利用自动化Edman降解氨基酸测序仪HP G1005A Protein SequencingSystem(Hewlett-Packard Development Company)分析实施例1中纯化的多肽的N-末端氨基酸序列。氨基酸序列由SEQ ID NO1表示。
实施例3获得本发明的DNA片段将黄黄色杆菌接种到5.0mL的培养基中在30℃培养48小时，所述培养基具有表1所示的组成。通过离心获得微生物细胞，用苯酚-氯仿法获得所述微生物的染色体DNA。由实施例2测定的氨基酸序列设计引物，所述引物分别具有序列SEQ ID NO2(AF)、SEQ ID NO3(BF)、SEQ ID NO4(AR)、或SEQ ID NO5(BR)。在耐热DNA聚合酶的存在下，添加4种引物中的任意2种进行PCR。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。结果，在使用引物BF(SEQID NO3)和引物AR(SEQ ID NO4)的反应溶液中特异地扩增了87bp DNA，因此从琼脂糖电泳凝胶提取并纯化了DNA。将一部分DNA克隆到pT7Blue T-载体(Novagen)中，根据所附手册的操作方法利用Li-Cor DNA Sequencer4000L型测定其核苷酸序列(SEQ ID NO6)。利用RediprimeTMII Random PrimeLabelling System(Amersham Pharmacia Biotech)标记通过Degener PCR扩增的其余纯化的87bp DNA。
实施例4黄黄色杆菌染色体DNA文库的Southern杂交通过实施例3所述方法获得黄黄色杆菌的染色体DNA。用EcoRI消化所述DNA，然后使用实施例3制备的标记的87bp DNA作为探针来进行Southern杂交。方法根据分子克隆第三版。结果，探测到约5kb的DNA条带。从琼脂糖凝胶提取并纯化DNA，插入到pBluescript II SK(-)(Strategene)的EcoRI位点，并通过使用氯化钙的转化方法将所得产物导入大肠杆菌JM109中。
实施例5菌落杂交与亚克隆将实施例4中获得的大肠杆菌JM109的转化菌株涂布到含50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂培养基(含10.0g细菌用胰蛋白胨(Bacto Trypton)、5.0g细菌用酵母提取物(Bacto Yeast Extract)、10.0g氯化钠、和15.0g琼脂的1-L水溶液)上，在37℃培养过夜。将出现的菌落挑取到硝酸纤维素膜CELLULOSE NITRATE(Advantec Toyo Kaisha，Ltd.)上，利用实施例3获得的DNA探针进行杂交。作为杂交的结果，从阳性克隆获得了质粒，其核苷酸序列(SEQ ID NO7)利用Li-Cor DNA Sequencer 4000L型来测定。
实施例6表达质粒的构建和大肠杆菌的转化利用从黄黄色杆菌提取的染色体DNA作为模板和引物MCA-F与MCA-R(SEQ ID NOS9和10)进行PCR。纯化所得的PCR产物并用限制酶HindIII和XbaI消化。将所得产物连接到已用相同酶消化的pUC19(TAKARABIO INC.)以制备pMCA1，其用于通过氯化钙法转化大肠杆菌JM109。将转化的菌株涂布在含50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，所获得的在其上生长的克隆作为转化菌株pMCA1/JM109。
实施例7利用所述转化体不对称水解2-甲基半胱氨酸酰胺外消旋混合物添加氯化锰制备具有以下表3所示组成的培养基，将200mL的培养基注入到1-L锥形烧瓶中并灭菌。然后，所述培养基添加50μg/mL氨苄青霉素，然后用转化菌株pMCA1/JM109接种，之后37℃振荡培养15小时。随后，将培养溶液进行离心，由此获得相当于0.1g干细胞的活细胞。
表3.培养基组成pH7.0胰蛋白胨(Triptone)1％酵母提取物0.5％氯化钠0.5％将10.0g(58.6.mmol)盐酸2-甲基半胱氨酸酰胺的外消旋混合物溶解到300mL 50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)中。然后，将所述混合物注入500-mL烧瓶中，烧瓶中添加氯化锰水溶液，使得二价Mn离子的浓度变为10ppm，另外添加相当于0.01g干细胞的活细胞，之后在氮气流下在30℃搅动培养24小时，以使水解反应继续。
反应完成后，将反应溶液离心，由此去除细胞，获得上清。向上清添加1g活性碳，并搅拌1小时。然后，过滤分离活性碳，然后在减压下用蒸发器蒸馏出水。向所得产物添加20mL 2-丙醇，整体在加热条件下搅拌，然后冷却到5℃，之后过滤收集沉淀的结晶。通过添加乙醇重结晶通过过滤收集的结晶，由此获得3.04g(22.5mmol)2-甲基-L-半胱氨酸。从导入反应的外消旋混合物中的2-甲基-L-半胱氨酸酰胺的分离收率为76.8mol％，从2-甲基半胱氨酸酰胺的外消旋混合物的分离收率为38.4％。此外，在以下表4所示的HPLC条件A下分析固体，其结果是固体的光学纯度不小于98％e.e。
表4.HPLC条件A柱子Sumichiral OA-5000(Sumika Chemical Analysis Service，Ltd.)柱子温度60℃洗脱溶液3mM CuSO4水溶液流速1.0mL/min检测CD-2095plus(JASCO Corporation)样品0.1％水溶液经福尔马林处理后，注入50μL实施例8利用所述转化体不对称水解2-甲基半胱氨酸酰胺外消旋混合物不添加氯化锰除了不添加氯化锰水溶液外，以与实施例7相同的方式进行生物化学不对称水解反应。反应于30℃进行24小时，并进行与实施例7相同的后续处理，由此获得1.50g(11.1mmol)2-甲基-L-半胱氨酸。自2-甲基-L-半胱氨酸酰胺的分离收率为37.9mol％，自2-甲基半胱氨酸酰胺的分离收率为18.9mol％，且光学纯度不小于98％e.e。
比较实施例1利用野生型微生物(0.01g细胞)不对称水解2-甲基半胱氨酸酰胺外消旋混合物制备具有以下表5所示组成的培养基，将200mL的培养基注入到1-L锥形烧瓶中并灭菌。然后，将黄黄色杆菌接种到烧瓶中，振荡培养在30℃进行170小时。随后，将培养溶液进行离心，由此获得相当于0.1g干细胞的活细胞。
表5.培养基组成(NH4)2SO43gKH2PO41.4gNa2HPO43g
NaHCO30.3gMgSO4·7H2O0.2g2％CaCl21g酵母提取物 0.2g维生素混合物 1g尿素 1g丙三醇 10g痕量矿物质 3.5g1L(pH7.0)将10.0g(58.6mmol)盐酸2-甲基半胱氨酸酰胺的外消旋混合物溶解到300mL 50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)中。然后，将所述混合物注入500-mL烧瓶中，烧瓶中添加氯化锰水溶液，使得二价Mn离子的浓度变为10ppm，另外添加相当于0.01g干细胞的活细胞，之后在氮气流下在30℃搅动培养24小时，进行水解反应。反应完成后，将反应溶液进行离心以去除细胞，在以下表6所示的HPLC条件B下分析上清。结果没有观察到产物2-甲基半胱氨酸。
表6.HPLC条件B柱子LiChrosorb 100 RP-18(KANTO CHEMICAL CO.，INC.)柱子温度40℃洗脱溶液50mM HClO4水溶液流速0.5mL/min检测RI样品注入5μL0.1％水溶液比较实施例2利用野生型微生物(5g细胞)不对称水解2-甲基半胱氨酸酰胺外消旋混合物将在比较实施例1中的培养基组成中培养后获得的10L培养液进行离心，由此获得相当于5g黄黄色杆菌干细胞的活细胞。将10.0g(58.6mmol)盐酸2-甲基半胱氨酸酰胺的外消旋混合物溶解到300mL 50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)中。然后，将所述混合物注入500-mL烧瓶中，烧瓶中添加氯化锰水溶液，使得二价Mn离子的浓度变为10ppm，再添加相当于5g干细胞的活细胞，之后在氮气流下在30℃搅动培养24小时，进行水解反应。反应完成后，将反应溶液离心以去除细胞，在HPLC条件B下分析上清。结果证实产生了28.2mmol的2-甲基半胱氨酸。此外，在HPLC条件A下分析上清，其结果是L-氨基酸的光学纯度不小于98％e.e。
比较实施例3利用野生型微生物不对称水解2-甲基半胱氨酸酰胺外消旋混合物不添加氯化锰除了不添加氯化锰水溶液外，以与比较实施例2相同的方式进行生物化学不对称水解反应。反应在30℃进行24小时。反应完成后，将反应溶液进行离心以去除细胞，然后在HPLC条件B下分析上清。结果证实产生了13.9mmol的2-甲基半胱氨酸。此外，在HPLC条件A下分析上清，结果，所述L-氨基酸的光学纯度不小于98％e.e。
实施例9利用所述转化体不对称水解多种氨基酸酰胺的外消旋化合物利用转化菌株pMCA1/JM109的培养液和作为底物的多种氨基酸酰胺的外消旋混合物进行酶反应，其中所述转化菌株pMCA1/JM109已经用与实施例7相同的方式培养。将每种底物化合物溶解到50mM磷酸缓冲液(pH7.0)中，以将底物浓度调节至0.1％，向底物溶液添加细胞，在30℃进行酶反应。反应完成后，将反应溶液进行离心以由此去除细胞，并在HPLC条件A和HPLC条件B下分析立体选择性和反应率(反应率＝反应完成后的氨基酸mol量/(反应后的氨基酸酰胺的mol量+反应后的氨基酸的mol量)×100)。结果如表7所示。在任何反应中，水解的选择性都是对L-型的选择性，并且所产生的L-氨基酸的光学纯度不小于98％e.e。
表7.多种氨基酸酰胺的反应结果


工业实用性本发明提供生产光学活性氨基酸，特别是光学活性2-烷基半胱氨酸的优选方法，其中光学活性2-烷基半胱氨酸从工业观点来说是非常有用的化合物，预计将广泛地用作多种工业化学品、药物、和农业化学品的生产中间体。
序列表<110>三菱瓦斯化学株式会社(Mitsubishi Gas Chemical Company，Inc.)<120>L-氨基酸酰胺不对称水解酶及其编码DNA<130>200544-C5111<150>JP2004-214241<151>2004-07-22<160>10<210>1<211>40<212>PRT<213>黄黄色杆菌<400>1Ala Ser Arg Pro Leu Thr Pro Pro Pro Tyr Ser Pro Pro Asp Pro Ala Trp1 5 10 15Leu Glu Gly Ser Ile Met Ala Ala Arg Gly Glu Ala Lys Gly Arg Ala Gly20 25 30Glu Arg Tyr Glu Ile Thr35 40<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的DNA<400>2cgsccsctsa csccsccscc 20<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的DNA
<400>3ccsccsgayc csgcstggctsg22<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的DNA<400>4sgtgatytcr tascgytcgcc 21<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的DNA<400>5sgcscggccc ttsgcytcgcc 21<210>6<211>87<212>DNA<213>黄黄色杆菌<220>
<400>6cctcccgatc cggcctggct cgaaggctcc atcatggctg cccgcggcga agccaaaggg 60cgcgccggcg aacgctacga gatcacc 87<210>7<211>4840<212>DNA<213>黄黄色杆菌<220>
<221>CDS
<222>(868)..(1932)<400>7gaattcgata ttatccgcga ggagccggcg cccatccggc cggatcccta tctggtgcgc 60tccgcgccca ccgacagctg gttcgcatcc gcgccgcgct gcggtcgcca agtaaggagc120gggcgagcca tgtcccgcaa cctgctccag aacttccgcg gcgcccgggc gctcatcgtc180gcctccggcg agggcggcat cgacacgctg gagagcgtgc tcggcaagct cggcctcttg240gtcgcccgct cggaggcgcc ggaggcgggc cgccatctcg acctcgcctc ggtggaggag300cgcgcggacc tgctcttcat cgacggcgac ctcgacagcg tgctgccctg cgacctcggc360gcggcccgca ccccgccggt gccggtgatc gggctggtcg gcatcgaggc gccgggccgg420ctgaaggcgt tgatgaacca gggggccacg gccttcctgc gcaagccggt ctatgccggc480gccgtctaca ccacgctgtt cctcggcgtg aaccagtatc tgctgcgcaa ggagatggcg540agcgagctga acgcccagca ggatcgccgc cgccgccgca aggcggtcat caagaccatc600ctgctgctga tggaagagca ccaggtggat gacgacgagg cctatgtcat gctccgccgc660gacagcatgc gccggcgcca gagcctcgag gattattgcg aggactacat ctccggccgg720tcgaagctga ccgcgtcctc gcccgaagcc gagccgcgca ccgcggcccg gcgctgacct780taccgaccca catcacgacg gagccgcccg gctccgccgc acgtggcagc tgccagcgac840gccagcccgc ccgcaaggag aaggccc atg tcc cgg cat ccc atg tcc cgg cag894Met Ser Arg His Pro Met Ser Arg Gln1 5cac gca tca cgg cct ctg acg ccg ccc ccc tat tcc cct ccc gat ccg gcc 945His Ala Ser Arg Pro Leu Thr Pro Pro Pro Tyr Ser Pro Pro Asp Pro Ala10 15 20 25tgg ctc gaa ggc tcc atc atg gct gcc cgc ggc gaa gcc aaa ggg cgc gcc 996Trp Leu Glu Gly Ser Ile Met Ala Ala Arg Gly Glu Ala Lys Gly Arg Ala30 35 40ggc gaa cgc tac gag atc acc gag gcg agc caa ggc aag tat cac tac gtc 1047Gly Glu Arg Tyr Glu Ile Thr Glu Ala Ser Gln Gly Lys Tyr His Tyr Val45 50 55 60tac ggc ccg tat gcc acg ccc gtg ctg cgc gtg gat ccg ggc gcg gtg gtg 1098Tyr Gly Pro Tyr Ala Thr Pro Val Leu Arg Val Asp Pro Gly Ala Val Val61 65 70 75agc gcc gag acc cac gac gcc atg gaa ggg cag atc aaa agc gag agc gac 1149Ser Ala Glu Thr His Asp Ala Met Glu Gly Gln Ile Lys Ser Glu Ser Asp80 85 90aag ccg tcg gaa atc ctc aac ttt ccc ttc ctc aac ccg cag aat ggg ccg 1200Lys Pro Ser Glu Ile Leu Asn Phe Pro Phe Leu Asn Pro Gln Asn Gly Pro95 100 105 110atc ttc gtc aac ggc gcg gag aag ggc gac tgc ctc gcc gtc tat atc cac 1251Ile Phe Val Asn Gly Ala Glu Lys Gly Asp Cys Leu Ala Val Tyr Ile His115 120 125gac atc gtg ccg cgc ggg ccg cag ccc atc ggc acc acc tgc atc atg ccg 1302Asp Ile Val Pro Arg Gly Pro Gln Pro Ile Gly Thr Thr Cys Ile Met Pro130 135 140 145
gag ttc ggc ggc ctc gtc ggc aca ggc gac acc gcg atc ctc aac gcg cct 1353Glu Phe Gly Gly Leu Val Gly Thr Gly Asp Thr Ala Ile Leu Asn Ala Pro150 155 160ttg ccg gag atc gtg aag aag ctg cac gtg gat ccg gcg act ggc gtg cgc 1404Leu Pro Glu Ile Val Lys Lys Leu His Val Asp Pro Ala Thr Gly Val Arg165 170 175tgg aac gag cga atc agc ctg ccc tac cag ccc ttc atc ggc acc atc ggc 1455Trp Asn Glu Arg Ile Ser Leu Pro Tyr Gln Pro Phe Ile Gly Thr Ile Gly180 185 190 195acc gcg ccg gag atc gag gcc att tcc tcc ctc gtc ccc gac tat tac ggc 1506Thr Ala Pro Glu Ile Glu Ala Ile Ser Ser Leu Val Pro Asp Tyr Tyr Gly200 205 210ggc aac atg gac ctg ccg gac gtg gct ccc ggc gcc gtc atc tac ctg ccg 1557Gly Asn Met Asp Leu Pro Asp Val Ala Pro Gly Ala Val Ile Tyr Leu Pro215 220 225 230gtc cat gcg ccc ggc gcc ctg ctc tat ctc ggc gat tgc cac gcc gcg cag 1608Val His Ala Pro Gly Ala Leu Leu Tyr Leu Gly Asp Cys His Ala Ala Gln235 240 245ggc gat ggg gag ctg tgt gga ttc gcc atc gag cat ccc acc gtg acc acg 1659Gly Asp Gly Glu Leu Cys Gly Phe Ala Ile Glu His Pro Thr Val Thr Thr250 255 260gtg cag atc gac ctc atc aag ggg tgg aac ttc cgc tgg ccg cgg ctg gag 1710Val Gln Ile Asp Leu Ile Lys Gly Trp Asn Phe Arg Trp Pro Arg Leu Glu265 270 275 280acc cac gac cgc atc atg acc atc ggc tcc ggc cgc ccc atg gag gac gcc 1761Thr His Asp Arg Ile Met Thr Ile Gly Ser Gly Arg Pro Met Glu Asp Ala285 290 295gcc cgc atc gcc tat cga gaa ctg gtg cgc tgg atg gcc gcc gac tac ggg 1812Ala Arg Ile Ala Tyr Arg Glu Leu Val Arg Trp Met Ala Ala Asp Tyr Gly300 305 310 315tat gac gag ctg gaa gcc tac atg ctg ctg acg cag gcc ggg cac ctc agg 1863Tyr Asp Glu Leu Glu Ala Tyr Met Leu Leu Thr Gln Ala Gly His Leu Arg320 325 330gtc ggc aac atg gtg gac ccg aag tac acg ctc ggc gcc tcc gtc gac aag 1914Val Gly Asn Met Val Asp Pro Lys Tyr Thr Leu Gly Ala Ser Val Asp Lys335 340 345acg ctt ctc ggc gcg gcc tgagctacgc acgcctggca atggctccgg cgatcgcacg 1972Thr Leu Leu Gly Ala Ala350 355atggcgccag cctccggtcg agccacctac gcccgcagat cctgccactc gggatggcgg 2032cggaactgcg tggcaacgta tgaacacagc ggggtgatct tgaagccctc cgcgcgggca 2092tcggcgatga gggcatccac cagacgcgca gcgatgccgc gcccttcgaa ggccggcggc 2152acgccgtatg ggtgacgacg aacgggccgt cgccgcggcg ctggtagctc agttccgctt 2212ccgcaccccc gccgaggcga atgacataac ggcctccgcc cggcccctcc tcgcgctgaa 2272
tctcttggcg agcatcttgg ctggcgtcgt tcatcatgcc tccgtcggtg gtggtgcccc 2332caccataacg gcgatgctat cccatcagtt catttcgcgc gcctcaagcc cgcgagcgtg 2392cggaaggcat ctgcgagccc ctccttggac agcggctgca cgaagttgcg aatatagggc 2452gctgtctccc aggacacgga aacgatgccg tccaccacgg cctcggtctc gacgccgaaa 2512tcctccagcg cgcgcggcag gccgaggcgg gcgtagaagg ccagcatgtc cgccatgaaa 2572tcggcgtccc ggccttccgc cagcaattgc accagaagcc cgagggccac ctgttcgcca 2632tgcagcgccc gcgccacctc cggcaccgtg gagaagccgc gcgtgagaga atgggcgatg 2692gacaggcccc cgctttcgaa ggcgaggccg gagaggagga tggtcgcctc caccacgcgc 2752tccaccgcct cgtccgccgt cttgcgggcg acggcggcca ccgccgcctc gccatccgcg 2812cggatggcac ggtagcaggc atcggcgata gtgacggcga gcgtggtggg gcgacccttg 2872aagaaattca gcccgccggc ggcggcgcac tgctctactt caaacttctt ggacagcgca 2932tcgccgatgc ccgccacgaa gaagcgcgcc ggcgcctgga cgatgacgga tgtatccacc 2992agcaccgcat cggggttggc atccatcagc cgcacttcgc tcagcacgtg ctcggcggtg 3052tagaccacca cgaggcggga ggtggggctg tcgttggagg cgatggtcgg cacgatcacg 3112agcggcgtgc gcagcgcgat gcgcacgccc ttggcggtgt cgatggcctt gccgccgccg 3172acaccgatca ccacgtcagc gcccgccgcc cgcgccgccg cggccagctt gtccatctcc 3232gccgccgtgc attccccgcc gaaggtggcg aaggtgaccg cctcggcctc cgccagctca 3292gccttcaggc gcgccccgag cagatccatc acgatggcgt cggccaccac gaagggccgg 3352cggcgtgcag gcgcacgagc gcgcccagct caccaagtgc ctcggggccc tggatgtagc 3412gggccggaga cccgaacgcg cgcacgctca tgcgtcaccc cagtggaaat cgcgcttgcc 3472gccatccatg cagatcaagg cgccgttgat gaaagccgcc tgcgtggagc agaggaaggc 3532gacgagcgcc cccacctcct ccggctggca gaagcggccg acgggattct gtccggtgat 3592caccgcccgc ttctccggcg agaaggtcga tgaaatcggt ggccacatag ccgggcgatg 3652gcgttcacgg tgatgccgtc cgcccccacc tccttcgcca ccgtgcgggt gaagccgagc 3712acgccggcct tggccgccga ataattcgcg acgcctggcc ggccgccgcc ggtgacgttc 3772atggacgagg tgttgacgat gcggccgaag ccatttgcgc gcatcagtgg aatggcgtgc 3832ttgctgcaca ggaaggtgct gcgcaggtgg gtggagacga tgatgtcgaa gtcgtcgatc 3892tccatctccg ccacacgccg cccgagatgg cgcccacccg ccccggcatt gttcacgaga 3952atgtcgaggc gcccgaaggc gtccgcagca gcactcacga cgccagccgc gcccgcctcg 4012tcggccacgt cgcccgcgtg ccgccgcctc gtacccagcc tgccgcagct ccttggcgca 4072gtggcggcgc cctccgcgtc gatgtcgttg atgacgatgc gcgcgccctc ggcggcgagc 4132cccaacgcct ccgcccggcc gatgccggcg ccgcgccggt gacaagggcg acccgccctt 4192tcaatcccag atccatcttg gtctccgatc agcccttcac cgcgcccgcg ccgagcccct 4252gaatgaagta ttggctcagc aaggcgaagg cgccgaacag cggcaaagcg atgagggtgg 4312agccggccat gatctccccc cagcgcagat cgaacgaacc gaccatggag gccagcccca 4372ccggcacggt cttgttggca tcggagccga tcatgatcag cgcataggtg tagtccgtcc 4432acgacaggag gaaggagaag atggccaccg tgatgagccc cggcagcgac agcggcagca 4492ccacccgcag gaaggcgccg agccgtgtgc agccatccac catcgccgcc tcttccagct 4552cgaacggcat gctcttgaag aagccccaca ggaaccacac gccgagcggc agcgtgaggg 4612tgagatggga gacgatgacg ctcgccagcg tgtcgcccaa ccccagcttg gcgaagatgg 4672agaacatggg aatggcgatg agcagcggcg ggaacatgta ggcgtagagc atcgccccca 4732cgatgagccc cttgccgcgg atgcggtggc gcgtgaccgc ataggcgatc atgatcgaga 4792acaccatggt caccgccacc gtcaccgccg cagacgatga gggaattc4840
<210>8<211>355<212>PRT<213>黄黄色杆菌<220>
<400>8Met Ser Arg His Pro Met Ser Arg Gln His Ala Ser Arg Pro Leu Thr Pro Pro1 5 10 15Pro Tyr Ser Pro Pro Asp Pro Ala Trp Leu Glu Gly Ser Ile Met Ala Ala Arg20 25 30 35Gly Glu Ala Lys Gly Arg Ala Gly Glu Arg Tyr Glu Ile Thr Glu Ala Ser Gln40 45 50Gly Lys Tyr His Tyr Val Tyr Gly Pro Tyr Ala Thr Pro Val Leu Arg Val Asp55 60 65 70Pro Gly Ala Val Val Ser Ala Glu Thr His Asp Ala Met Glu Gly Gln Ile Lys75 80 85 90Ser Glu Ser Asp Lys Pro Ser Glu Ile Leu Asn Phe Pro Phe Leu Asn Pro Gln95 100 105Asn Gly Pro Ile Phe Val Asn Gly Ala Glu Lys Gly Asp Cys Leu Ala Val Tyr110 115 120 125Ile His Asp Ile Val Pro Arg Gly Pro Gln Pro Ile Gly Thr Thr Cys Ile Met130 135 140Pro Glu Phe Gly Gly Leu Val Gly Thr Gly Asp Thr Ala Ile Leu Asn Ala Pro145 150 155 160Leu Pro Glu Ile Val Lys Lys Leu His Val Asp Pro Ala Thr Gly Val Arg Trp165 170 175 180Asn Glu Arg Ile Ser Leu Pro Tyr Gln Pro Phe Ile Gly Thr Ile Gly Thr Ala185 190 195Pro Glu Ile Glu Ala Ile Ser Ser Leu Val Pro Asp Tyr Tyr Gly Gly Asn Met200 205 210 215Asp Leu Pro Asp Val Ala Pro Gly Ala Val Ile Tyr Leu Pro Val His Ala Pro220 225 230Gly Ala Leu Leu Tyr Leu Gly Asp Cys His Ala Ala Gln Gly Asp Gly Glu Leu235 240 245 250Cys Gly Phe Ala Ile Glu His Pro Thr Val Thr Thr Val Gln Ile Asp Leu Ile255 260 265 270Lys Gly Trp Asn Phe Arg Trp Pro Arg Leu Glu Thr His Asp Arg Ile Met Thr275 280 285Ile Gly Ser Gly Arg Pro Met Glu Asp Ala Ala Arg Ile Ala Tyr Arg Glu Leu290 295 300 305Val Arg Trp Met Ala Ala Asp Tyr Gly Tyr Asp Glu Leu Glu Ala Tyr Met Leu310 315 320
Leu Thr Gln Ala Gly His Leu Arg Val Gly Asn Met Val Asp Pro Lys Tyr Thr325 330 335 340Leu Gly Ala Ser Val Asp Lys Thr Leu Leu Gly Ala Ala345 350 355<210>9<211>56<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的DNA<400>9cgccagaagc tttaaggagg aatagcccat gtcccggcat cccatgtccc ggcagc56<210>10<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的DNA<400>10taggtgtcta gaccggaggc tgcc 2权利要求
1.立体选择性地水解L-氨基酸酰胺的酰胺键的酶，其中所述酶包含SEQID NO8中氨基酸编号1至355代表的氨基酸序列，或者包括缺失、取代或添加1个或多个氨基酸的所述氨基酸序列。
2.编码根据权利要求1的酶的酶蛋白的DNA。
3.根据权利要求2的DNA，其包含SEQ ID NO7中核苷酸编号868至1932代表的核苷酸序列，或者在严紧条件下与所述核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
4.重组微生物，其中已经导入了根据权利要求2或3的DNA。
5.根据权利要求4的重组微生物，其中所述重组微生物为大肠杆菌。
6.生产L-氨基酸的方法，其包括使L-氨基酸酰胺与根据权利要求1的酶反应以将所述的L-氨基酸酰胺转变为L-氨基酸。
7.根据权利要求6的生产方法，其中所述L-氨基酸酰胺是式1代表的化合物 R1代表氢、低级烷基、取代的低级烷基、苯基、取代的苯基、杂环基团、取代的杂环基团、或者与和R1结合的碳原子及和所述碳原子结合的氨基组合形成含氮杂环的基团，并且R2代表氢或具有1至4个碳原子的低级烷基，附带条件是排除其中R1和R2同时代表氢的情况。
8.根据权利要求6的生产方法，其中所述L-氨基酸酰胺是式2代表的化合物 R代表具有1至4个碳原子的低级烷基。
9.根据权利要求8的生产方法，其中式2中的R为甲基。
全文摘要
本发明通过导入编码酶的DNA生产重组微生物，所述酶水解L－氨基酸酰胺，尤其是L－2－烷基半胱氨酸酰胺的酰胺键，以及利用所获得的微生物的细胞或细胞处理产物生产L－氨基酸。
文档编号C12P13/04GK1989246SQ200580024489
公开日2007年6月27日 申请日期2005年5月23日 优先权日2004年7月22日
发明者浅野泰久, 井上敦 申请人:三菱瓦斯化学株式会社