一种发酵木质纤维素离子液体水解液制备脂肪酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种利用木质纤维素离子液体水解液 发酵生产脂肪酸的方法，同时涉及大肠杆菌（Escherichiacoli)在以竹子粉为原料制备脂 肪酸的方法中的应用。
【背景技术】
[0002] 脂肪酸（fattyacid)是指一端含有一个羧基的长的脂肪族碳氢链，直链饱和脂肪 酸的通式是CwHen+1)C00H，低级的脂肪酸是无色液体，有刺激性气味，高级的脂肪酸是蜡状 固体，无可明显嗅到的气味。脂肪酸是最简单的一种脂，它是许多更复杂的脂的组成成分。 脂肪酸在有充足氧供给的情况下，可氧化分解为〇) 2和H20,释放大量能量，因此脂肪酸是机 体主要能量来源之一。
[0003] 脂肪酸是一类羧酸化合物，由碳氢组成的烃类基团连接羧基所构成。脂肪酸在生 物体内与甘油形成三羧酸甘油酯，为脂肪主要成分。脂肪酸还可与磷酸、胆碱、鞘氨醇合成 鞘磷脂，与糖结合生成糖脂等，为生物体细胞膜的重要组分。脂肪酸可作为特殊化学品用于 食品、医药、农业领域。而在能源问题和环境问题日益严重的今天，脂肪酸最吸引人的地方 是其可衍生化为生物柴油和生物汽油，用于制成混合生物燃料或易降解的塑料。
[0004] 目前脂肪酸的生产主要以动物油或植物油为原料，采用高温高压水解或酶法水解 的方式，以及石蜡氧化法等，国际市场的价格依据其成分和纯度不同为500~8000美元/ 吨。然而，从植物或动物中得到的脂肪酸成分不均一，性能不稳定，存在批次差异，动物来 源的脂肪酸可能有微量内毒素，影响其应用于医药、食品工业。目前，越来越多的注意力转 移到利用微生物生产脂肪酸的方向上来（CellFact.，2012，11:51-59)。天然微生物的产 脂肪酸能力非常低，不足细胞重量1%。因此，必须运用生物工程技术对现有产脂肪酸微生 物进行改造。目前主要的研宄进展集中在单细胞藻类、假单胞菌、酵母菌以及大肠杆菌上 (Metab.Eng.，2013,17 :23-29)。近来利用可再生资源用微生物发酵合成的方法生产生物燃 料得到人们的广泛关注，比如来自森林或农业废弃物的木质纤维素就备受青睐。
[0005] 木质纤维素是一种廉价的可再生资源，其储量非常丰富。如果把地球上每年由光 合作用形成的纤维素物质全部有效地利用起来，所产生的能量远远超过全世界每年所消耗 的能量。然而，到目前为人类对其利用效率非常低，全球每年产生的生物质总量约2. 9xl021 焦耳的能量，但是利用率才将近7%。天然纤维素来源广泛，但其复杂的结构特征、较高的结 晶度和分子间与分子内存在大量的氢键，使其不溶于水及普通有机溶剂，这已成为纤维素 生物质开发应用的最大障碍。而用离子液体处理时，它能够破坏纤维素的复杂结构，降低其 结晶度，从而促进纤维素的进一步高效糖化，提高此类生物质的利用率。
[0006] 离子液体作为一种极具前景的绿色溶剂，以其优良的溶解性、强极性、不挥发、不 氧化、对水和空气稳定等特点而受到广泛关注。有关利用离子液体处理生物质得到还原糖 的研宄有一些报道，哈尔滨工业大学巩桂芬等人合成了不同种类的离子液体，并用其处理 纤维素生物质可发酵还原糖。天津工业生物技术研宄所王钦宏等人对一种离子液体作用水 解生物质生产可发酵还原糖的新方法进行报告。
[0007] 众所周知，竹子中含有大量的木质纤维素，是一种非常宝贵的绿色无污染可再生 资源。我国的中国的竹类资源非常丰富，有竹类植物40属，400多种，约占世界竹类种质资 源的1/3。每年可砍伐毛竹4亿多枝，杂竹300万t，相当于1000万m3木材的量。竹子价 格低廉，是非常方便易得的原料，广泛应用于各个行业。但是目前竹子的利用率很低，造成 了竹子资源的极大浪费，严重影响其经济效益。因此，研宄以竹子为原料的发酵方法，使其 得到充分利用，既能保护环境、节约资源又能提高经济效益、造福大众。
[0008] 我国是一个人口众多但是粮食相对短缺的国家，每年大量由国外进口粮食。以粮 食为原料的生物发酵法生产脂肪酸会消耗大量粮食，而利用竹子粉为原料发酵生产脂肪 酸，做到了不与人争粮，有利于缓解粮食危机。目前发酵生产脂肪酸的原料有葡萄糖、秸 杆、玉米芯等，利用竹子粉为原料发酵生产脂肪酸酸，扩展了脂肪酸发酵的原料来源，为脂 肪酸的生产提供了新思路。关于利用发酵生产脂肪酸的研宄也有一些报道，像公布号为CN 104388479A，涉及一种利用餐厨垃圾厌氧发酵产短链脂肪酸的方法，使用的原料为餐厨垃 圾；像公布号CN104099380A，名为一种利用污泥厌氧发酵生产脂肪酸的方法，使用污泥作 为原料。目前，以木质纤维素水解液，特别是竹子粉为原料发酵生产脂肪酸的研宄未见报 道。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的就是针对现有技术存在的问题，提供一种利用竹子粉为原料发酵生 产脂肪酸的方法，同时提供竹子粉在制备脂肪酸中的应用及大肠杆菌（Escherichiacoli) 在以竹子粉为原料制备脂肪酸的方法中的应用。
[0010] 本发明通过以下技术方案达到上述目的：一种利用竹子粉为原料发酵生产脂肪酸 的方法，包括以下步骤：
[0011] 1. 一种利用竹子粉为原料发酵生产脂肪酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0012] (1)将竹子粉碎得到竹子粉，将竹子粉过80目筛子，基于离子液体进行酸水解或 酶水解竹子粉得到木质纤维素水解液直接用于配制培养基或置于_20°C冰箱备用；
[0013] (2)将新鲜的或解冻后的水解液加水调整总糖浓度至10~50g/L，加入氮源、无机 盐、pH缓冲剂配制成脂肪酸发酵培养基；
[0014] (3)将平板上的大肠杆菌（Escherichiacoli)DQ430接入种子培养基中，在有氧 培养箱培养16~20h。
[0015] 所述的大肠杆菌（Escherichiacoli)DQ430,为本实验在大肠杆菌MG1655的基础 上，敲除了FadD基因，并将携带了酰基载体蛋白硫酯酶基因的质粒PTrc-DQTE转入其中所 得到的工程菌。然后在不同浓度的离子液体中进行传代培养，使最终得到的大肠杆菌DQ430 能耐受一定浓度的离子液体。
[0016] 所述的种子培养基的成分及其浓度为：蛋白陈10~20g/L，酵母粉5~10g/L， NaCl5 ~10g/L。
[0017] (4)将培养好的大肠杆菌接种至发酵培养基中，接种量为5~10% (v/v)，在有氧 环境中发酵，pH缓冲剂调节pH在6. 0~7. 0,并在30~37°C发酵24~72h，即可得到脂肪 酸。
[0018] 所述的发酵培养基的成分及其浓度为：总糖10~50g/L，氮源10~40g/L， K2HP041 ~5g/L，CaCl20. 5 ~lg/L，，NaCl0? 5 ~2g/L，（NH4)2S040. 5 ~2g/L，MgCl20. 5 ~ lg/L〇
[0019] 所述的pH缓冲剂是碳酸盐、氨水、NaOH，所述的碳酸盐为碱式碳酸镁或碳酸钠，所 述的发酵条件为有氧。
[0020] 所述的氮源包括有机氮源和无机氮源；所述的有机氮源包括酵母粉、蛋白胨、玉米 浆、豆饼粉，所述的无机氮源包括尿素、硫酸铵。
[0021] 所述的发酵方式可采用分批发酵、分批补料发酵或连续发酵。
[0022] 所述处理方法包括：
[0023] (1)酸解法：足量离子液体熔融后，与竹子粉、氯化铜和10% (v/v)盐酸在100°C 搅拌反应4~5h，抽滤后加入50% (w/w)氢氧化钠使其分层，快速混勾30min，使用离心机 快速离心所得下层清液即为用于发酵的水解液。
[0024] (2)酶解法：足量离子液体与竹子粉在120°C搅拌反应3h后，加水抽滤，并用水洗 4~6