骨髓间充质干细胞表达成骨基因的构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，尤其涉及一种骨髓间充质干细胞表达成骨基因的构建 方法。
【背景技术】
[0002] 因创伤、肿瘤、炎症等导致的大范围骨缺损是临床上长期面临的难题，严重危害人 类健康。传统的治疗手段如自体骨移植存在骨量缺乏、同种异体骨移植有传播疾病可能、异 种异体骨移植则会产生免疫排斥反应等问题，因此骨组织工程已成为治疗大范围骨缺损的 新策略。目前在动物实验中，组织工程骨修复小范围骨缺损时，骨折的愈合效果很好，但是 在修复大范围骨缺损时，中心部分经常发生缺血坏死。因此，单纯的使用组织工程骨治疗大 范围骨缺损困难重重。近年的研宄表明，将具有促成骨作用的基因（如骨形态发生蛋白2) 通过基因转染的方法整合到种子细胞中，可以诱导其向成骨方向分化，提高成骨活性。
[0003] 骨髓间充质干细胞是存在于骨髓中的一类具备多方向分化潜能的非造血干细胞， 在一定的诱导条件下能向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞等方向分化。而且骨髓 间充质干细胞在临床上已被应用于治疗移植物抗宿主病和同种异体造血干细胞移植，其生 物安全性已得到证实。然而骨髓间充质干细胞不易于外源基因导入，因此选择合适的基因 转染技术至关重要。
[0004] 低氧诱导因子 1a(hypoxia-induciblefactor-lalpha，HIF-1a)作为低氧反应 的一种核转录调节因子，通过对其下游靶基因的诱导表达，调控血管生成、能量代谢、细胞 增殖迀移分化等反应。
[0005] 把目的基因转移到靶细胞中的方法有很多，目前应用的基因载体分为两大类：非 病毒载体和病毒载体。非病毒载体主要包括脂质体、聚合物等，这类载体的优点是可以大量 生产，毒性反应及免疫抑制方面也相对较安全，但其转染效率低、表达量低、体内应用较困 难。病毒载体主要有3种：反转录病毒、慢病毒和腺病毒。反转录病毒载体的缺点是负载容 量小、整合的随机性有潜在的危险性、只能感染分裂期细胞，有临床试验结果表明，反转录 病毒有诱发白血病的风险，其生物安全性受到广泛地质疑。腺病毒载体和慢病毒载体是现 在使用最为广泛的两种方法。腺病毒载体可以感染分裂期及分裂期细胞，但是不能将目的 基因整合到靶细胞的基因组中，因此不能持续稳定的表达外源基因。慢病毒载体是由人类 免疫缺陷病毒（humanimmunodeficiencyvirus，HIV)改造获得的，慢病毒载体系统包括表 达载体及包装质粒。目前，还没有使用低氧诱导因子la重组慢病毒感染骨髓间充质干细 胞表达成骨基因的方法。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种骨髓间充质干细胞表达成骨基因的构建方法，旨在提 供一种利用携带低氧诱导因子la的慢病毒感染骨髓充质干细胞、构建感染骨髓间充质干 细胞珠、表达成骨基因的问题。
[0007] 本发明是这样实现的，一种骨髓间充质干细胞表达成骨基因的构建方法，所述方 法利用携带低氧诱导因子la的慢病毒感染骨髓充质干细胞、表达成骨基因，具体包括下 述步骤：
[0008] 构建慢病毒表达载体Lenti-HIF-1a-eGFP:从Hela细胞中提取总RNA，反转录 成cDNA，分别设计含酶切位点BamHI的引物HIF-la-F和含酶切位点和PspXI的引 物HIF-la-R，利用上述引物对cDNA进行PCR扩增获得扩增基因片段一低氧诱导因子 la基因；将慢病毒包装质粒载体Lenti-eGFP与所述扩增基因片段分别进行酶切处理， 将酶切处理产物连接后转化处理，将转化产物扩增后进行质粒抽提，得到慢病毒表达载体 Lenti-HIF-1a-eGFP;
[0009] 携带低氧诱导因子1a的慢病毒载体Lenti-HIF-1a-eGFP的包装：将慢病毒表达 载体1^拉1-11正-1€[-冗?？与病毒包装质粒1^1^1?&(3 111￥共转染至293了&细胞中，进行病 毒包装，获得携带低氧诱导因子1a的慢病毒载体Lenti-HIF-1a-eGFP，收集病毒原液，并 对病毒滴度进行监控；
[0010] 慢病毒载体Lenti-HIF-1a-eGFP感染骨髓间充质干细胞：获取骨髓间充质干 细胞，当骨髓间充质干细胞融合度达70%时，当病毒滴度以MOI为50时加入慢病毒载体Lenti-HIF-1a-eGFP进行慢病毒感染，获得能够表达成骨基因的感染骨髓间充质干细胞。 [0011] 本发明提供的骨髓间充质干细胞表达成骨基因的构建方法，操作简单，从Hela细 胞中扩增出低氧诱导因子la基因片段，然后利用慢病毒载体将低氧诱导因子la导入至 骨髓间充质干细胞基因组DNA中，无明显的毒性反应，细胞生长良好；由于慢病毒载体自带 增强型绿色荧光蛋白，荧光显微镜下可观察见骨髓间充质干细胞能大量表达低氧诱导因子 la(荧光强）。获得的感染骨髓间充质干细胞能够很好地表达低氧诱导因子la基因，可 提高成骨因子的表达水平。
【附图说明】
[0012] 图1是本发明实施例提供的骨髓间充质干细胞表达成骨基因的构建方法流程示 意图；
[0013] 图2是本发明实施例提供的低氧诱导因子1 a基因琼脂糖凝胶电泳鉴定图；
[0014] 图3是本发明实施例提供的Lentil-eGFP-HIF-1 a重组载体琼脂糖凝胶电泳鉴定 图；
[0015] 图4是本发明实施例提供的骨髓间充质干细胞形态学观察结果图；
[0016] 图5是本发明实施例提供的采用流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面标记物 结果图；
[0017] 图6是本发明实施例提供的携带低氧诱导因子1 a的慢病毒感染48h时大鼠骨髓 间充质干细胞形态图；
[0018] 图7是本发明实施例提供的RT-qPCR分析目的基因感染骨髓间充质干细胞后在1， 4,7，14d成骨相关基因的表达结果统计图。
【具体实施方式】
[0019] 为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合 附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用 以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0020] 慢病毒载体是由人类免疫缺陷病毒（humanimmunodeficiencyvirus，HIV)改造获 得的，慢病毒载体系统包括表达载体及包装质粒，慢病毒表达载体即通常所说的穿梭载体， 包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。在HIV的基础上删除了vif、vpr、vpu和 nef4个辅助基因，同时用表达水疱性口炎病毒（VSV)糖蛋白G的质粒和双嗜性小鼠白血 病病毒（MLV)包膜蛋白Env的质粒，分别取代表达HIV本身包膜蛋白Env的质粒，使HIV-1 载体颗粒包上了VSV或双嗜性MLV的包膜。包膜的更换进一步降低了慢病毒载体恢复成野 生型病毒的可能，使HIV载体感染宿主的范围不再仅限于CD4+细胞，而扩大到几乎能感染 所有组织来源的细胞。VSV的包膜赋予慢病毒载体颗粒高度的稳定性，使其能够通过超速离 心而浓缩，达到高滴度。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载 体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时 共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离 心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转 录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。
[0021] 慢病毒载体是应用最广泛的转基因载体之一，具有下列优点：（1)可实现目的基 因高效转染靶细胞基因组DNA中并能长期稳定表达；（2)能将目的基因插入到靶细胞基因 组DNA中构建稳定的转化细胞株从而实现长期表达；（3)慢病毒包装工艺相对简单；(4)慢 病毒载体经改构后，不在宿主细胞繁殖，不易诱发免疫反应，不会导致宿主细胞死亡，被它 感染的细胞能连续传代，生物安全性高；（5)可以感染分裂期细胞和非分裂期细胞；(6)可 转移的基因片段容量大，最大可达到9kb。为了获得稳定的整合低氧诱导因子1a的种子细 胞株，本发明实施例选择慢病毒载体作为基因转染载体，将外源基因导入骨髓间充质干细 胞中。
[0022] 本发明实施例提供了一种骨髓间充质干细胞表达成骨基因的构建方法，所述方法 利用携带低氧诱导因子1a的慢病毒感染骨髓充质干细胞、表达成骨基因，具体包括下述 步骤，如附图1所示：
[0023] S01.构建慢病毒表达载体Lenti-HIF-1a-eGFP:从Hela细胞中提取总RNA，反 转录成cDNA，分别设计含酶切位点BamHI的引物HIF-la-F和含酶切位点和PspXI的 引物HIF-la-R，利用上述引物对cDNA进行PCR扩增获得扩增基因片段一低氧诱导因子 la基因；将慢病毒包装质粒载体Lenti-eGFP与所述扩增基因片段分别进行酶切处理， 将酶切处理产物连接后转化处理，将转化产物扩增后进行质粒抽提，得到慢病毒表达载体 Lenti-HIF-1a-eGFP;
[0024] S02.携带低氧诱导因子1a的慢病毒载体Lenti-HIF-1a-eGFP的包装：将慢病 毒表达载体1^1^丨-11正-1(1-冗?？与病毒包装质粒1^1^1?3(3 111￥共转染至293了3细胞中， 进行病毒包装，获得携带低氧诱导因子1a的慢病毒载体Lenti-HIF-1a-eGFP，收集病毒 原液，并对病毒滴度进行监控；
[0025] S03.慢病毒载体Lenti-HIF-1a-eGFP感染骨髓间充质干细胞：获取骨髓间充质 干细胞，当骨髓间充质干细胞融合度达70%时，当病毒滴度以