骨髓间充质干细胞的诱导方法及其诱导液的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细胞工程技术领域，特别涉及一种骨髓间充质干细胞的诱导方法以及 所使用的诱导液。
【背景技术】
[0002] 冠心病心肌梗死及心力衰竭是严重影响人民生活质量和寿命的主要疾病之一。研 究资料显示，成熟的心肌细胞缺乏再生能力，心肌梗死（MI)发生后，梗死区心肌只能通过 纤维组织增生，由无收缩功能的疤痕组织代替，导致心功能下降。临床上缺乏针对梗死心肌 再生、重建的根本性治疗方法，而细胞替代治疗应运而生成为一个理想的治疗策略。
[0003] 骨髓间充质干细胞（Mesenchymaistemcells，MSCs)，是在骨髓中的一种类似成 纤维细胞的一类细胞，具有多方向分化潜能，可以向骨组织、软骨组织、皮肤、造血干细胞支 持介质、骨骼肌细胞及心肌细胞转化。自体骨髓间充质干细胞还具有取材方便、无免疫原 性、具有多向分化潜能、合乎伦理学要求并且无致瘤性，具有其它干细胞不可比拟的优势， 因此，探讨MSCs体外大量扩增及向心肌细胞诱导分化条件将对损伤心肌的修复治疗具有 深远意义。
[0004] 在研究MSCs向心肌细胞分化诱导中，目前主要使用化学诱导剂5-氮胞苷 (5-azacytidine，5-AZA)。5-AZA是胞苷的类似物，它可以与DNA共价结合形成复合物从而 导致DNA甲基在细胞分裂周期中进行性丢失，发挥去甲基化作用，启动MyoD等某些相关等 位基因的表达。国外有学者将成年小鼠骨髓基质细胞经5-氮胞苷诱导后，能产生自主收缩 的肌管结构的细胞团，显微镜下结构类似胚胎心肌细胞。但细胞经过5-AZA处理后可导致 细胞部分皱缩，脱壁，降解、或胞浆内形成脂肪空泡，说明5-AZA作为一种诱导剂对细胞也 有一定毒性。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术中骨髓间充质干细胞诱导转化为心 肌细胞的方法所获得的心肌细胞存在细胞易皱缩脱壁死亡等缺陷，提供一种能够提高骨髓 间充质干细胞的活性及转化率的骨髓间充质干细胞的诱导方法及该方法中所使用的诱导 液。
[0006] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种骨髓间充质干细胞的诱导 方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0007] 获取骨髓间充质干细胞进行体外培养；
[0008] 在体外培养过程中用诱导液进行诱导；
[0009] 其中，所述诱导液包括血管紧张素II和骨形态发生蛋白-2。
[0010] 在本发明提供的骨髓间充质干细胞的诱导方法中，所述血管紧张素II的浓度为 1-5μmol/L，骨形态发生蛋白-2的浓度为50-200μg/L。
[0011] 在本发明提供的骨髓间充质干细胞的诱导方法中，获取骨髓间充质干细胞的方法 步骤包括：
[0012] 抽取人骨髓，在含有低糖DMEM的离心管中混合，再过筛，得到细胞悬液，再将所述 细胞悬液加入到含Percoll分层液的离心管中，离心，获取单个核细胞。
[0013] 在本发明提供的骨髓间充质干细胞的诱导方法中，所述Percoll分层液的密度为 1.067-1. 082kg/L〇
[0014] 在本发明提供的骨髓间充质干细胞的诱导方法中，获取骨髓间充质干细胞的方法 步骤还包括：在获取单个核细胞后，用含有胎牛血清、青霉素和/或链霉素的DMEM对单个核 细胞进行培养，再于〇)2培养箱中孵育，36-96个小时后更换培养基，除去未贴壁的细胞，以 后每2-4天换液1次，直到单个核细胞增殖达到融合状态，即获得纯化后的原代骨髓间充质 干细胞。
[0015] 在本发明提供的骨髓间充质干细胞的诱导方法中，所述DMEM培养基中，胎牛血清 的浓度为180_120mg/L，青霉素的浓度为90-110ug/ml，和/或链霉素的浓度为90-110ug/ ml〇
[0016] 在本发明提供的骨髓间充质干细胞的诱导方法中，用所述诱导液进行诱导反应之 前，还包括对原代骨髓间充质干细胞进行传代培养的过程，包括以下步骤：
[0017]S21、用1. 5~3mL/L胰蛋白酶将原代骨髓间充质干细胞消化分离，再用完全培养 基中止消化，制成细胞悬液；然后传代接种于含新生牛血清的DMEM培养瓶中培养，隔1~3 天换液，直至细胞达到90 %以上融合；
[0018]S22、重复步骤S21继续传代至第4代骨髓间充质干细胞后，用胰蛋白酶消化制成 细胞悬液，再用PBS冲洗后，以0. 5~1. 5X105个/ml的密度接种于多孔板上，培养2-5天。
[0019] 在本发明提供的骨髓间充质干细胞的诱导方法中，用所述诱导液对第4代骨髓间 充质干细胞进行诱导反应，包括以下步骤：
[0020] 利用所述诱导液诱导分化12-36个小时，吸弃诱导液，再用PBS清洗3次，继续用 完全培养基培养，每2-5天换液一次，继续培养1-4周。
[0021] 在本发明提供的骨髓间充质干细胞的诱导方法中，所述DMEM培养基中，所述多孔 板中内置涂有多聚赖氨酸的盖玻片。
[0022] 本发明进一步保护骨髓间充质干细胞的诱导方法中所使用的诱导液，该诱导液包 括浓度为1-5μmol/L的血管紧张素II，和浓度为50-200μg/L的骨形态发生蛋白-2。
[0023] 实施本发明提供的诱导液及骨髓间充质干细胞的诱导方法，可以达到以下有益效 果：通过采用能够促进骨髓间充质干细胞的生长和分化的骨形态发生蛋白以及能够促进骨 髓间充质干细胞增殖的血管紧张素II作为诱导剂诱导培养骨髓间充质干细胞，不仅能够 防止骨髓间充质干细胞过早脱壁凋亡，而且能够提高骨髓间充质干细胞的活性，并提高其 转化率。
【具体实施方式】
[0024] 为解决现有技术中采用5-氮胞苷诱导骨髓间充质干细胞转化成的心肌细胞存在 细胞易皱缩脱壁、降解死亡等缺陷，本发明的创新点在于提供一种新的骨髓间充质干细胞 的诱导方法及诱导液，该方法中采用血管紧张素II和骨形态发生蛋白-2作为诱导剂进行 骨髓间充质干细胞的诱导培养，不仅能够促进骨髓间充质干细胞转化成心肌细胞，提高转 化率，而且还能够增强细胞活性，解决了现有技术中，由骨髓间充质干细胞转化后获得的心 肌细胞易脱壁降解死亡的问题。
[0025] 具体地，本发明提供的骨髓间充质干细胞的诱导方法，先获取到骨髓间充质干细 胞进行体外培养；在体外培养过程中利用本发明的诱导液进行诱导反应。在本发明实施 例中，体外培养过程包括先提纯出骨髓间充质干细胞的单个核细胞，进行扩增培养，传代培 养，诱导反应等步骤。具体包括以下步骤：
[0026] S1、获取骨髓间充质干细胞；
[0027]S2、对骨髓间充质干细胞进行传代培养至第四代骨髓间充质干细胞；
[0028]S3、用诱导液对第4代骨髓间充质干细胞进行诱导反应至收获心肌细胞。
[0029] 进一步地，在步骤S1中，本发明所采用的骨髓间充质干细胞是通过密度梯度离心 结合贴壁培养的方式分离纯化获取的骨髓间充质干细胞，密度梯度离心法能够根据不同细 胞之间存在的沉降系数差，在一定离心介质和离心力作用下，不同细胞各自以一定速度沉 降，在密度梯度不同区域上形成区带，从而能够去除骨髓血中的大量红细胞、粒细胞和成纤 维细胞等混杂细胞。然后，再利用骨髓间充质干细胞贴壁生长的特性对密度梯度离心法获 得的单个核细胞进行贴壁培养，通过去除非贴壁细胞，以进一步纯化骨髓间充质干细胞。步 骤S1的具体过程为：
[0030]S11、密度梯度离心法获取单个核细胞；
[0031] 抽取人骨髓，在含有低糖DMEM的离心管中混合，再过筛，得到细胞悬液，再将所述 细胞悬液加入到含Percoll分层液的离心管中，离心，获取单个核细胞。其中，Percoll分 层液的密度为1. 067-1. 082kg/L。
[0032]S12、贴壁培养法进一步纯化骨髓间充质干细胞；
[0033] 用含有胎牛血清、青霉素和/或链霉素的DMEM对步骤S11获得的单个核细胞进行 培养，再于〇)2培养箱中孵育，36-96个小时后更换培养基，除去未贴壁的细胞，以后每2-4 天换液1次，直到单个核细胞增殖达到融合状态，即获得纯化后的原代骨髓间充质干细胞。
[0034] 其中，DMEM培养基中，胎牛血清的浓度为180-120mg/L，青霉素的浓度为 90-110ug/ml，和/或链霉素的浓度为90-110ug/ml。青霉素能够阻碍细菌的细胞壁合成，导 致细胞泄漏死亡，从而抑制细菌的生长；链霉素能够作用于细菌的核糖体，阻碍蛋白翻译， 从而抑制细菌生长；自然环境下，不考虑人为产生的抗药性，对青霉素不敏感的绝大多数微 生物对链霉素敏感，反之亦然；因此，最为优选地是将青霉素和链霉素搭配使用能够控制几 乎全部常见的细菌，从而能够尽量避免细菌对骨髓间充质干细胞的生长及活性造成的不良 影响。
[0035] 步骤S2中，对原代骨髓间充质干细胞进行传代培养，以获取生长及活性最佳的第 四代骨髓间充质干细胞进行诱导反应，具体步骤为：
[0036]S21、用1. 5~3mL/L胰蛋白酶将步骤S12中获得的原代骨髓间充质干细胞进行消 化分离，再用完全培养基中止消化，制成细胞悬液；然后传代接种于含新生牛血清的DMEM 培养瓶中培养，隔1~3天换液，直至细胞达到90%以上融合；
[0037]S22、重复步骤S1继续传代至第4代骨髓间充质干细胞后，用胰蛋白酶消化制成细 胞悬液，再用PBS冲洗后，以0. 5~1. 5X105个/ml的密度接种于多孔板上，培养2-5天。
[0038] 其中，多孔板中内置涂有多聚赖氨酸的盖玻片；多聚赖氨酸是带正电荷的氨基酸， 能够消除器皿与细胞膜的电荷排斥作用，能够促进细胞与器皿的粘合，提高细胞贴壁能力。 因此，将骨髓间充质干细胞置于涂有多聚赖氨酸的细胞培养容器中，能够促进骨髓间充质 干细胞贴壁生长。
[0039] 步骤S3的具体过程为：
[0040] 利用诱导液对步骤S22中获得的第4代骨髓间充质干细胞进行诱导分化12-36个 小时，吸弃诱导液，再用PBS清洗3次，继续用完全培养基培养，每2-5天换液一次，继续培 养1-4周至心肌细胞成熟并增殖到临床使用量。
[0041 ] 其中，诱导液包括血管紧张素II和骨形态发生蛋白-2。血管紧张素II是一种肤类 激素，作为一种细胞因子及生长因子，能够刺激血管平滑肌细胞、成纤维细胞的增殖；另外， 血管紧张素II是血管平滑肌细胞强大的丝裂原，它可通过自分泌、旁分泌刺激血管平滑肌 细胞的DNA和蛋白质合成增加，导致细胞数目增多；还可促进血小板衍生生长因子（PDGF)、 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)的合成和释放，使血管紧张素II促血管平滑肌细胞分裂、 增殖作用加强；血管紧张素II与其受体结合，能活化多条信号通路，导致细胞活化；优选 地，血管紧张素II的浓度为1-5μmol/L。而骨形态发生蛋白是一族多功能的糖蛋白，属于 转化生长因子β家族成员，可调节骨髓间充质干细胞的生长，分化和凋亡。优选地，骨形态 发生蛋白的浓度为50-200μg/L。
[0042] 本发明通过大量实验证明，血管紧张素II结合骨形态发生蛋白共同诱导骨髓间 充质干细胞，能够抑制细胞的凋亡，促进