间充质干细胞培养试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001 ]本发明属于干细胞培养领域，具体涉及一种间充质干细胞培养试剂盒。
【背景技术】
[0002]间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。如间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。
[0003]间充质干细胞包括脐带间充质干细胞和骨髓间充质干细胞。
[0004]脐带间充质干细胞是一类具有自我更新、增殖和多向分化潜能的干细胞，具有来源广泛、易于采集、保存和运输、无异体排斥、避免伦理争议等诸多优点。流式细胞仪分析发现脐带间充质干细胞高表达间质细胞标志(⑶44、CD105)、整合素受体(⑶29、CD49b、⑶49c、⑶51)、不表达造血系标志(⑶34、CD45)白细胞抗原HLA-DR和内皮细胞标志CD31。脐带间充质干细胞在体内外可以分化为骨细胞、软骨细胞、肝细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞以及神经元细胞等。目前人脐带间充质干细胞在组织工程骨、人工血管以及基因治疗等临床应用研究中已逐渐深入，并已显示出广阔的应用前景。目前，对脐带间充质干细胞的分离培养、扩增还没有统一的标准，存在纯度低、原代培养时间长等缺点。各种类型的成纤维成体干细胞扩增一般在2?3天开始进入指数式生长，相差不大，而原代细胞由于组织来源不同，出现细胞克隆时间差异较大，所以，原代细胞传代时间是分离得到目的细胞的关键。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种能够提高间充质干细胞原代细胞传代时间的培养试剂盒，以使间充质干细胞多次传代后依然保持有细胞全能性。
[0006]本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的:
[0007]—种间充质干细胞培养试剂盒，包括细胞培养液A和细胞培养液B;
[0008]所述细胞培养液A为含80?120ng/ml细胞因子LIF、80?120ng/ml细胞因子bFGF和20?30yg/ml Granulodiene A的Knockout-DMEM培养基；
[0009]所述细胞培养液B为胎牛血清。
[0010]进一步地，所述细胞培养液A为含100ng/ml细胞因子LIF、100ng/ml细胞因子bFGF和25yg/ml Granulodiene A的Knockout-DMEM培养基。
[0011]进一步地，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。
[0012]进一步地，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞。
[0013]进一步地，所述细胞培养液A和细胞培养液B均为无菌，并各自独立包装。
[0014]进一步地，所述的间充质干细胞培养试剂盒还包括细胞洗涤液和细胞消化液;所述细胞洗涤液为生理盐水;所述细胞消化液为Collagenase II水溶液。
[0015]进一步地，所述细胞消化液为浓度为0.2g/100ml的Collagenase II水溶液。
[0016]进一步地，所述生理盐水由氯化钠和水组成，氯化钠的浓度为0.9g/100ml。
[0017]进一步地，所述细胞培养液A、细胞培养液B、细胞洗涤液和细胞消化液均为无菌，并各自独立包装。
[0018]上述间充质干细胞培养试剂盒在间充质干细胞培养中的应用。
[0019]本发明的优点:
[0020]本发明提供的培养试剂盒能够提高间充质干细胞原代细胞传代时间，使间充质干细胞多次传代后依然保持有细胞全能性。
【具体实施方式】
[0021]下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
[0022]本发明化合物Granulodiene A的制备方法参见文献:Sesquiterpenes from thesaprotrophic fungus Granulobasidium ve 11 ereum( El I i s&Cragin) Jill i ch，Phytochemistry 102(2014)197-204。
[0023]实施例1:试剂盒的制备
[0024]1、组分的制备
[0025]细胞洗涤液的制备:将9gNaCl溶于去离子水并用去离子水定容至1000ml，高压灭囷后置于4 C冰箱内备用。
[0026]细胞培养液A的制备:将细胞因子LIF、细胞因子bFGF和化合物Granulodiene A溶于无菌Knockout-DMEM培养基(液体)，细胞因子LIF的浓度为100ng/ml，细胞因子bFGF的浓度为100ng/ml，化合物Granulodiene A的浓度为25yg/ml。置于4°C冰箱内备用。
[0027]细胞培养液B为无菌胎牛血清，置于-20V冰箱内备用。
[0028]细胞消化液:将Collagenase II溶于去离子水使CollagenaseII的浓度为0.2g/100ml，置于4°C冰箱内备用。
[0029]2、组分的分装以及试剂盒的制备
[0030]用于分离脐带间充质干细胞的试剂盒(I次/盒)由独立包装的如下组分组成:I瓶细胞洗涤液(10ml/瓶)、I瓶细胞培养液A(80ml/瓶)，I瓶细胞培养液B(20ml/瓶)和I瓶细胞消化液(10ml/瓶)。
[0031]实施例2:试剂盒的制备，与实施例1对比，仅细胞培养液A中不添加GranulodieneA
[0032]1、组分的制备
[0033]细胞洗涤液的制备:将9gNaCl溶于去离子水并用去离子水定容至1000ml，高压灭囷后置于4 C冰箱内备用。
[0034]细胞培养液A的制备:将细胞因子LIF和细胞因子bFGF溶于无菌Knockout-DMEM培养基(液体)，细胞因子LIF的浓度为100ng/ml，细胞因子bFGF的浓度为100ng/ml。置于4°C冰箱内备用。
[0035]细胞培养液B为无菌胎牛血清，置于-20V冰箱内备用。
[0036]细胞消化液:将Collagenase II溶于去离子水使CollagenaseII的浓度为0.2g/100ml，置于4°C冰箱内备用。
[0037]2、组分的分装以及试剂盒的制备
[0038]用于分离脐带间充质干细胞的试剂盒(I次/盒)由独立包装的如下组分组成:I瓶细胞洗涤液(10ml/瓶)、I瓶细胞培养液A(80ml/瓶)，I瓶细胞培养液B(20ml/瓶)和I瓶细胞消化液(10ml/瓶)。
[0039]实施例3:脐带间充质干细胞的分离与快速扩增培养
[0040]分别用实施例1(实验组)和实施例2(对照组)制备的试剂盒进行脐带间充质干细胞的分离与快速扩增培养。
[0041 ]细胞培养液的制备:将细胞培养液A和细胞培养液B按照5:1的体积比混合。
[0042]1、无菌收集离体脐带(来源为人)，浸没于含双抗的细胞培养液(含双抗的细胞培养液由细胞培养液、青霉素和链霉素组成，青霉素的浓度为lg/100ml、链霉素的浓度为Ig/10ml)中，玻璃容器密封运输至实验室。
[0043]2、在生物安全柜中剪取约1cm长的脐带，用细胞洗涤液清洗血污；用解剖刀去除外被羊膜、2条脐静脉和I条脐动脉，得到华尔通氏胶(动静脉之间的胚胎粘液样结缔组织)。
[0044]3、将华尔通氏胶剪碎成肉糜状，转移到离心管中，加入20ml细胞消化液，混匀37°C过夜消化(约6小时)；吸取液相、离心(2500rpm，5分钟)，收集沉淀(原代细胞)。
[0045]4、用细胞培养液重悬原代细胞，接种于0.2%明胶包被的培养瓶中(每16个细胞接种到I个25cm2培养瓶)，置于37°C,5%CO2培养箱中培养;持续观察细胞贴壁生长情况，细胞多数贴壁后(约24小时)更换为新的细胞培养液，除去未贴壁细胞和杂质，以后每3天半量更换细胞培养液(半量即原细胞培养液体积的一半;也可每4天半量更换细胞培养液)，原代细胞培养7天后细胞密度达到90%。
[0046]5、原代细胞培养至细胞密度达到90%后进行第一次传代，之后均在细胞密度达到90% (培养2?3天)时进行传代;继续传代20次(即第一次传代后，又连续传代了 19次)。
[0047]实施例4:细胞纯度测定
[0048]分别取实施例1(实验组)和实施例2(对照组)制备的试剂盒按实施例3方法分离培养传代20次的细胞进行流式细胞仪检测，以验证细胞样本的纯度。
[0049]通过流式细胞仪分别检测第20次传代后的细胞样本的表面抗原CD29的图谱，实验组细胞样本的阳性率为95.7%，而对照组细胞样本的阳性率仅为79.4%o结果表明，采用本发明提供的细胞培养液将原代细胞传代20次后，细胞的纯度依然非常高。
[0050]实施例5:全能性验证
[0051]为证实脐带间充质干细胞的多向分化潜能，本实施例对实施例3中第15次传代后的细胞样本向成骨细胞和脂肪细胞分化的潜能进行鉴定。
[0052]1、向成骨细胞分化
[0053]将细胞样本以3000cells/cm2接种，然后加入成骨诱导培养基(向Knock out-DMEM培养基中添加地塞米松至ΙΟΟηΜ、抗坏血酸至50μΜ、β-甘油磷酸钠至10mM)，于37°C、5%⑶2培养箱中培养，大约5?7天后观察。
[0054]结果实验组可观察到如下现象:细胞汇合成单层，细胞突起互相连接，并可重叠生长而不发生接触抑制；重叠生长的细胞逐渐形成结节状，随后胶原堆积及钙盐沉积，细胞间出现致密的圆形不透光团块物质，表明细胞样本可以向成骨细胞分化。
[0055]对照组未观察到实验组所见现象，说明使用实施例2制备的试剂盒所培养的脐带间充质干细胞传代15代后基本丧失继续分化为成骨细胞的能力。
[0056]2、向脂肪细胞分化
[0057]将细胞样本以3000cells/cm2接种，然后加入成脂肪诱导培养基(向Knockout-DMEM培养基中添加地塞米松至ΙμΜ、甲基-异丁基黄嘌呤至0.5mM、胰岛素至10yg/ml、吲哚美辛至ΙΟΟμΜ)，持续培养。
[0058]结果实验组可见如下现象:第2天细胞汇合成单层;2周后部分细胞形态变圆，胞浆内出现亮圆形脂滴;随着时间延长，圆形细胞逐渐增多。表明细胞样本可向脂肪细胞分化。
[0059]对照组未观察到实验组所见现象，说明使用实施例2制备的试剂盒所培养的脐带间充质干细胞传代15代后基本丧失继续分化为脂肪细胞的能力。
[0060]以上结果表明，采用本发明提供的细胞培养液将脐带间充质干细胞传代15次后，细胞仍然维持很高的纯度和良好的全能性。
[0061]采用本发明提供的细胞培养液培养骨髓间充质干细胞，也取得了同样好的效果。
[0062]上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
【主权项】
1.一种间充质干细胞培养试剂盒，其特征在于:包括细胞培养液A和细胞培养液B; 所述细胞培养液A为含80?120ng/ml细胞因子LIF、80?120ng/ml细胞因子bFGF和20?30yg/ml GranulodieneA的Knockout-DMEM培养基； 所述细胞培养液B为胎牛血清。2.根据权利要求1所述的间充质干细胞培养试剂盒，其特征在于:所述细胞培养液A为含 100ng/ml细胞因子LIF、100ng/ml细胞因子bFGF和25yg/ml Granulodiene A的Knockout-DMHM培养基。3.根据权利要求1所述的间充质干细胞培养试剂盒，其特征在于:所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。4.根据权利要求1所述的间充质干细胞培养试剂盒，其特征在于:所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞。5.根据权利要求1所述的间充质干细胞培养试剂盒，其特征在于:所述细胞培养液A和细胞培养液B均为无菌，并各自独立包装。6.根据权利要求1所述的间充质干细胞培养试剂盒，其特征在于:还包括细胞洗涤液和细胞消化液;所述细胞洗涤液为生理盐水;所述细胞消化液为Collagenase II水溶液。7.根据权利要求6所述的间充质干细胞培养试剂盒，其特征在于:所述细胞消化液为浓度为0.2g/100ml的Collagenase II水溶液。8.根据权利要求6所述的间充质干细胞培养试剂盒，其特征在于:所述生理盐水由氯化钠和水组成，氯化钠的浓度为0.9g/100ml。9.根据权利要求6所述的间充质干细胞培养试剂盒，其特征在于:所述细胞培养液A、细胞培养液B、细胞洗涤液和细胞消化液均为无菌，并各自独立包装。10.权利要求1?9任一所述间充质干细胞培养试剂盒在间充质干细胞培养中的应用。
【专利摘要】本发明公开了间充质干细胞培养试剂盒，包括细胞培养液A和细胞培养液B；所述细胞培养液A为含80～120ng/ml细胞因子LIF、80～120ng/ml细胞因子bFGF和20～30μg/mlGranulodiene A的Knockout?DMEM培养基；所述细胞培养液B为胎牛血清。采用本发明提供的细胞培养液将脐带间充质干细胞传代15次后，细胞仍然维持很高的纯度和良好的全能性。采用本发明提供的细胞培养液培养骨髓间充质干细胞，也取得了同样好的效果。这些结果表明，本发明提供的培养试剂盒能够提高间充质干细胞原代细胞传代时间，使间充质干细胞多次传代后依然保持有细胞全能性。
【IPC分类】C12N5/0775
【公开号】CN105713872
【申请号】CN201610201894
【发明人】赵顺英
【申请人】赵顺英