一种复苏骨髓间充质干细胞的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，具体的说是涉及一种复苏骨髓间充质干细胞的方法。
【背景技术】
[0002]间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层，属于多能干细胞，MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。如间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。
[0003]骨髓间充质干细胞是来源于成体骨髓的间充质干细胞，与脐带、脂肪间充质干细胞一样，其具有较强的自我更新及多向分化潜能。间充质干细胞在分离培养后需要通过低温冷冻保存，在使用时再经过复苏进行组织器官损伤修复。
[0004]文献《冻存复苏后骨髓间充质干细胞体外扩增和多向分化潜能研究》(浙江大学学报工学版，第40卷第11期，2006年11月)记载了当前复苏骨髓间充质干细胞的普遍方法:
[0005]在复温时从液氮中取出样品立即放入37°C水浴锅内摇动冻存管，l-2min后复温完毕，加入新鲜的培养液(含体积分数为10 %的FBS的α -MEM培养液)400g离心5min，弃上清液，加入新鲜培养液放入C02培养箱中培养。待细胞达到80 % -90 %融合后，用消化液消化并以1:3传代进一步扩增.
[0006]虽然上述复苏的方法比较简单、快捷，但是该方法复苏后的细胞活力偏低，不利于后续的进行组织器官损伤修复等临床应用。
【发明内容】
[0007]有鉴于此，本发明的目的在于提供一种复苏骨髓间充质干细胞的方法，使得所述方法能够提高复苏后骨髓间充质干细胞的活力，并且仍然保持可以分化为成骨细胞、成脂细胞的能力。
[0008]为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案:
[0009]—种复苏骨髓间充质干细胞的方法，包括:
[0010]步骤1、将传代至P3-P5代的骨髓间充质干细胞先用间充质干细胞完全培养基培养后，再用无血清的DMEM培养基培养，分别在培养24h、48h、72h时收集培养基上清，将各时间段上清离心后再取上清混合，获得条件培养基；
[0011]步骤2、将冻存的骨髓间充质干细胞解冻，并加入到步骤1收集的条件培养基中离心去上清，然后再次加入条件培养基重悬并培养至细胞融合度达到要求。
[0012]针对现有方法复苏冻存的骨髓间充质干细胞后细胞活力不高的问题，本发明在复苏时不采用传统方法中惯用的商业培养基进行复苏，而是采用培养过骨髓间充质干细胞的条件培养基来进行复苏，可显著改善复苏后细胞活力不高的现象。本发明发现利用条件培养液可有效提高复苏细胞或组织的活力，而且不同来源的条件培养液对不同细胞、组织的活力有不同的促进或抑制作用。
[0013]其中，作为优选，步骤1为:
[0014]将传代至P3-P5代的骨髓间充质干细胞按照5000-10000/cm2的细胞密度用间充质干细胞完全培养基培养24h，用Hanks清洗后，再用无血清的DMEM培养基培养，分别在培养24h、48h、72h时收集培养基上清，1000-2000rpm离心5_10min，去除沉淀，收集所有上清混合，滤膜过滤后获得条件培养基。
[0015]对于本发明所述条件培养基中的细胞接种密度、离心操作的参数、培养时间和环境等可根据实际情况进行调节，本发明仅是给出比较优选的参数，但并不仅限于这些参数及其组合，对于本发明其他方法步骤中出现的类似参数也不仅限于所提供的优选参数及其组合。
[0016]作为优选，所述间充质干细胞完全培养基为含10% FBS的DMEM/F12培养基。
[0017]对于P3-P5代的骨髓间充质干细胞可按照本领域常规的分离方法以及传代方法来获得，本发明提供了如下优选的获得方法:
[0018]从正常人骨髓样本中分离出单核细胞层，离心清洗细胞沉淀，用骨髓间充质干细胞生长培养基重悬沉淀并培养48h，然后更换骨髓间充质干细胞生长培养基继续培养至细胞融合度达到80% -90%,获得P0代；
[0019]用胰蛋白酶消化P0代贴壁细胞，离心后用骨髓间充质干细胞生长培养基重悬细胞沉淀，并传代培养，按照所述方式传代至P3-P5代。
[0020]其中，更进一步优选的，所述单核细胞层可由以下方法分离获得:
[0021]取正常人的骨髓样本加入等体积生理盐水混匀，然后用巴氏吸管吸取骨髓混合液加入到等体积的淋巴细胞分离液中，离心后用巴氏吸管吸取中间层的单核细胞层。
[0022]更进一步优选的，所述骨髓间充质干细胞生长培养基为含10% FBS以及10ng/mLbFGF的DMHM培养基。
[0023]在步骤2复苏环节，将本发明所采用的条件培养基替代现有经常采用的商业培养基，按照一般的做法复苏即可。
[0024]作为优选，步骤2为:
[0025]将冻存的骨髓间充质干细胞放置在35_42°C的水浴锅中，震荡温育30_60秒，然后加入到5-10倍体积的条件培养基中，以1000-2000rpm离心3_5分钟，去上清，用条件培养基重悬沉淀，吹打混匀，并按照5000-10000/cm2的细胞密度用条件培养基放置在37°C、5%0)2培养箱静置培养24小时后，更换条件培养基继续培养至细胞融合度达到80% -90%。
[0026]运用本发明所述方法复苏冻存的骨髓间充质干细胞，相比采用现有方法(《冻存复苏后骨髓间充质干细胞体外扩增和多向分化潜能研究》中记载的复苏方法)复苏后的细胞，其活力显著提高，且依然保持间充质干细胞良好的生物学特征，具有分化为成骨细胞和成脂细胞的能力。基于此，本发明提供了所述条件培养基在复苏骨髓间充质干细胞中的应用。本发明所述条件培养基在不使用时可放置在-20°C培养箱保存6个月-12个月左右或放置在-80°C保存1年以上。需要使用时，恢复到37°C常温使用。
[0027]由以上技术方案可知，本发明以培养过骨髓间充质干细胞的培养基上清为复苏时的培养基，替代现有方法中普遍采用的诸如a -MEM, DMEM这种商业培养基，依靠其中包含的多种细胞在增殖过程中分泌的活性物质来促进复苏后的骨髓间充质干细胞的生长，进而提尚其活力。
【附图说明】
[0028]图1所示为本发明复苏方法和现有复苏方法细胞复苏后活力柱形图；
[0029]图2所示为本发明复苏方法和现有复苏方法细胞复苏且培养72h后的细胞总数柱形图；
[0030]图3所示为空白组细胞表面抗原流式细胞仪检测图；
[0031 ]图4所示为实验组细胞表面抗原流式细胞仪检测图；
[0032]图5所示为复苏后细胞成骨诱导的镜检图；
[0033]图6所示为复苏后细胞成脂诱导的镜检图。
【具体实施方式】
[0034]本发明实施例公开了一种复苏骨髓间充质干细胞的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0035]为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种复苏骨髓间充质干细胞的方法进行详细说明。
[0036]实施例1:骨髓间充质干细胞的培养及条件培养基的收集
[0037]将抽取的成体骨髓，用加入等体积的生理盐水，然后用巴氏吸管吸取骨髓混合液加入到等体积的淋巴细胞分离液中，以2000转离心10分钟；离心后用巴氏吸管吸取中间层的单核细胞层。加入骨髓间充质干细胞生长培养基(DMEM+10% FBS+10ng/ml bFGF)重悬细胞沉淀，随后放置在37°C，5% C02细胞培养箱培养，每2-3天换液，待细胞融合度达到80% -90%，用0.25%胰酶消化细胞，离心后用完全培养基重悬沉淀，5X103/cm2细胞密度接种培养皿中继续培养。取P3-P5代细胞进行条件培养基收集。
[0038]条件培养基收集:用于条件培养基的骨髓间充质干细胞，先按照5X 103/cm2细胞密度接种培养皿，完全培养基进行培养24小时后，用Hanks清洗后，加入无血清的DMEM培养基，在24小时、48小时、72小时后，分别收集细胞培养基上清，将上清分装于50mL离心管中，1000pm离心5min。去除沉淀，收集上清。用一次性注射器吸取条件培养基，用0.22 μπι滤膜过滤，收集在无菌收集瓶中。放置在-20°C培养箱保存6个月-12个月左右或放置在-80°C保存1年以上。需